趙東豪，王強，王旭峰，黎智廣，黃珂，李劉冬

(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(廣州)，農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心(廣州)，廣東 廣州 510300)

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超高效液相色譜串聯(lián)質譜法測定水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中49種獸藥的殘留量

趙東豪，王強，王旭峰，黎智廣，黃珂，李劉冬*

(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(廣州)，農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心(廣州)，廣東 廣州 510300)

建立了超高效液相色譜串聯(lián)質譜測定水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中硝基呋喃類、磺胺類、氟喹諾酮類、大環(huán)內酯類等11類、49種藥物的分析方法。樣品分別采用固相萃取法和冷凍干燥法濃縮后，經(jīng)Kinetex C18色譜柱分離，乙腈和0.1%甲酸水作為流動相梯度洗脫，正負離子同時掃描，多時段-多反應監(jiān)測模式下測定，外標法定量。各種藥物在相應的濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)大于0.998。冷凍干燥法各種藥物的方法檢出限為5～30 ng/L，加標回收率為63.1%～120%，相對標準偏差<15.2%。固相萃取法各種藥物的方法檢出限為1～5 ng/L，除孔雀石綠類外，加標回收率為67.1%～119%，相對標準偏差<13.6%。方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于測定水產(chǎn)養(yǎng)殖場池塘水樣中殘留的多種類藥物。[中國漁業(yè)質量與標準，2017,7(3):30-37]

獸藥；水樣；多殘留檢測；固相萃取法；冷凍干燥法；超高效液相色譜串聯(lián)質譜

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，為預防或治療魚、蝦等動物的細菌性疾病，減少經(jīng)濟損失，相關從業(yè)人員經(jīng)常會使用磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類等抗菌藥物[1-2]，甚至硝基呋喃類、孔雀石綠類、氯霉素類、氟喹諾酮類等違禁藥物在水產(chǎn)品中也屢有檢出[3-4]。與畜禽養(yǎng)殖不同，水產(chǎn)養(yǎng)殖不管是將藥物混合在飼料中飼喂，還是直接往池塘中潑灑，藥物都會溶于水體，而水中殘留的藥物會在換水時污染周圍的河流、湖泊等自然水域[5]。王丹等[6]研究結果表明，在中國地表水環(huán)境中已檢出磺胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類等68種抗菌藥物。雖然如此種類眾多的抗菌藥物殘留并不完全與水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)相關[7-8]，但水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗菌藥物的不合理使用，仍是其中一種不容忽略的因素[9]。水體環(huán)境中抗菌藥物較高濃度的殘留，會影響生態(tài)環(huán)境的平衡[10]，還可能誘導細菌耐藥性[11]，危害人類健康[12-13]。

目前，關于水產(chǎn)品中硝基呋喃類、磺胺類、氟喹諾酮類、孔雀石綠類和氯霉素類等禁限用藥物的殘留檢測方法研究比較多[14]，主要采用高效液相色譜法(HPLC)[15-16]和液相色譜串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)測定某類藥物，或者同時測定少數(shù)幾類藥物[17-18]。與水產(chǎn)品等復雜生物基質樣品相比，水樣的基質相對來說比較簡單，不用太多的提取步驟，大多只需經(jīng)過簡單的濃縮與凈化處理，即可上機測定。因此，一次樣品處理，同時測定水樣中殘留的多種類藥物成為可能[19]。鑒于目前水產(chǎn)養(yǎng)殖過程的藥物使用情況，為了更加方便、有效地監(jiān)控多種類藥物的使用，評估其對水產(chǎn)品的質量安全風險，本研究選擇文獻報導較多的硝基呋喃類、磺胺類、氟喹諾酮類、大環(huán)內酯類、林可霉素、沃尼妙林、甲基睪酮、孔雀石綠類、四環(huán)素類、喹噁啉類以及氯霉素類等11類藥物作為研究對象，分別采用固相萃取法和冷凍干燥法濃縮、富集水產(chǎn)養(yǎng)殖場池塘水體中殘留的痕量藥物，結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定，建立了水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中49種藥物殘留量的分析方法，為監(jiān)控水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中多種類藥物的使用情況，評估其對水產(chǎn)品的質量安全風險提供實用的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

Acquity UPLC I-Class/Xevo TQS超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿質譜儀(配備電噴霧離子源及Masslynx數(shù)據(jù)處理軟件)購于美國Waters公司；5810型臺式離心機購于德國Eppendorf公司；MS3旋渦混合器購于德國IKA公司；ALPHA 2-4 LSC冷凍干燥機購于德國Christ公司；Milli Q去離子水發(fā)生器購于美國Millipore公司；N-EVAP氮吹儀購于美國Organomation公司；20管真空固相萃取儀購于美國Waters公司。

1.2 實驗試劑

磺胺類、氟喹諾酮類等多種獸藥標準品，純度≥95%(Dr. Ehrenstorfer)；Oasis HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL)購于美國Waters公司；乙腈、甲酸為色譜純，購于美國Sigma-Aldrich公司，Na2EDTA(分析純)購于廣州化學試劑廠，用水配制成1 g/L的溶液，用甲酸調節(jié)pH至3.0。

1.3 測定方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL；流速為0.3 mL/min；流動相為乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脫程序為0～5 min，10%～50% A；5～7.5 min，50%～95% A；7.5～9 min，95% A；9～9.5 min，95%～10% A；9.5～11 min，10% A。

1.3.2 質譜條件

離子源為電噴霧電離(ESI)；掃描方式為正負離子同時掃描；離子源溫度為150 ℃；毛細管電壓為3.0 kV；脫溶劑氣溫度為350 ℃；脫溶劑氣流量為750 L/h；碰撞氣流速為0.15 mL/min，錐孔反吹氣流量為150 L/h；監(jiān)測方式為多時段-多反應監(jiān)測(multiple-period MRM)。

表1 49種化合物的MRM離子對及質譜條件參數(shù)Tab.1 MRM transition and mass spectrometric parameters for the 49 analytes

續(xù)表1 Tab.1 continued

注：*表示定量離子。

1.4 樣品前處理

1.4.1 水樣的采集與過濾

從水面下約0.5 m處采集5 L水樣，裝于玻璃瓶中，靜置沉淀后，先用2 μm的玻璃纖維膜過濾去除較大雜質，再經(jīng)0.45 μm的混合纖維素酯微孔濾膜過濾后，備用。

1.4.2 樣品的濃縮

1.4.2.1 固相萃取法

準確量取100 mL過濾后的水樣，加入0.4 g Na2EDTA，用甲酸調節(jié)溶液pH至約3.0[20]，采用Waters Oasis HLB(500 mg，6 mL)固相萃取柱富集和凈化。依次用6 mL甲醇和6 mL水活化小柱后，再用6 mL Na2EDTA溶液平衡。將上述待測水樣以約1 mL/min的速率過柱，棄流出液，用6 mL水淋洗后壓干，再用8 mL甲醇洗脫，洗脫液于40 ℃水浴下氮氣吹干，用乙腈-0.1%甲酸水溶液(10∶90，V/V)定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

1.4.2.2 冷凍干燥法

準確量取20 mL過濾后的水樣于50 mL聚丙烯離心管中，置于-80 ℃超低溫冰箱，約1 h后完全凍結。冷凍干燥機泵提前預熱約20～30 min，將已經(jīng)凍結的水樣轉移至凍干機的樣品倉，在Main Drying模式下真空冷凍干燥約40 h，樣品倉溫度保持在-83 ℃，大氣壓為6 Pa。待測樣品全部凍干后，加入1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(10∶90，V/V)，超聲波溶解10 min，渦旋振蕩1 min，以20 000 g高速離心10 min后，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

2 結果與分析

2.1 固相萃取柱的選擇

將待測的49種藥物的混合標準溶液添加至100 mL空白水樣中，以回收率作為評價指標，對固相萃取小柱類型和萃取條件進行篩選比較。本研究所測定的對象包括硝基呋喃類、磺胺類、氟喹諾酮類、大環(huán)內酯類、林可霉素、沃尼妙林、甲基睪酮、孔雀石綠類(含結晶紫及其代謝物)、四環(huán)素類、喹噁啉類以及氯霉素等11類藥物，這些化合物的理化性質各異，為了對以上所有藥物都能取得理想的檢測效果，選取通用型固相萃取柱HLB小柱和C18小柱對水體中的11類藥物進行濃縮與富集。結果表明，使用C18小柱時，硝基呋喃類藥物(NFZ、FZD和NFT)的漏穿率為6%～29%，磺胺類藥物(SD、ST、SM1、SM2和SMO)漏穿率為3%～36%，四環(huán)素類藥物(DO和OTC)雖未漏穿，但是回收率小于30%；而HLB小柱對所有的藥物均具有較好的保留效果，除孔雀石綠類化合物的回收率偏低外，用8 mL甲醇即可將其他種類的藥物從500 mg的HLB小柱上洗脫下來，回收率均大于67%。

孔雀石綠類化合物比較適合用PRS或MCX等陽離子交換柱凈化[21-22]，使用HLB小柱濃縮該類藥物時，將洗脫液由甲醇更換為洗脫能力更強的乙腈，可以有效洗脫孔雀石綠，但對隱色孔雀石綠、結晶紫和隱色結晶紫等3種化合物的洗脫效果仍不理想，其中的原因有待進一步的研究。

四環(huán)素類藥物易與金屬元素形成配合物或螯合物，在水樣中加入Na2EDTA溶液，可以競爭性地與多種金屬螯合，降低重金屬對四環(huán)素類藥物檢測的影響，提高回收率[23]。對于恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等7位引入哌嗪環(huán)的喹諾酮類藥物，將樣品的pH調至酸性過柱，藥物的哌嗪環(huán)能與HLB的填料形成氫鍵，增強藥物在小柱上的保留，而這種現(xiàn)象在氟甲喹等不含哌嗪環(huán)的喹諾酮類藥物上則未發(fā)現(xiàn)[20]。為提高藥物的回收率，將樣品的pH調至約3.0。

2.2 冷凍干燥法的優(yōu)缺點

由于孔雀石綠類藥物難以從HLB小柱上有效洗脫，回收率較低，本研究又建立了冷凍干燥法濃縮樣品，同時檢測11類藥物。與固相萃取、減壓蒸干等樣品濃縮方法相比，冷凍干燥法操作簡單，濃縮過程中不需要使用有機溶劑，成本低且對環(huán)境的污染小。測定樣品時直接將水樣分裝放置于冷凍干燥機中即可，處理過程中目標化合物損失少，回收率較高。本研究將添加11類化合物的水樣凍干后，各種藥物的回收率均>63%，可以滿足水樣中多類藥物同時檢測的需要。但凍干法比較慢，本研究將20 mL水樣凍干，耗時近2 d，如果凍干更多體積的樣品，則需時更久，工作效率稍低。尤其是在樣品量多、時間緊的情況下，凍干法難以完成檢測任務。此外，凍干法處理的樣品基質較臟，盡管液質法具有特異性強的優(yōu)勢，被雜質干擾的可能性較小，但檢測過程中仍需注意基質效應對定量分析的影響。因此，在實際工作中，檢測人員可以根據(jù)待測的藥物種類、樣品數(shù)量及時間限制等因素，靈活選擇固相萃取法或冷凍干燥法進行樣品處理。

2.3 色譜和質譜條件的優(yōu)化

使用ESI質譜測定時，在流動相中添加甲酸或乙酸有助于正電離，負電離時添加氨水等堿性物質則能提高待測物的靈敏度。本研究涉及的49種藥物，除氯霉素、氟苯尼考等少數(shù)幾種藥物負電離時具有更高的靈敏度，其他藥物正電離的效果最佳。為了提高大部分藥物的靈敏度，在樣品中添加了0.1%的甲酸，盡管氯霉素和氟苯尼考的靈敏度有所降低，但仍可滿足檢測的要求。呋喃西林和呋喃妥因為兩性化合物[3]，正負離子掃描均可，當樣品的pH為酸性時，兩者在正離子模式下也具有較高的靈敏度。因此，本研究采用正負離子同時掃描的模式測定，除氯霉素和氟苯尼考采用負電離外，其他藥物均使用正離子模式掃描。

與高效液相色譜法相比，液相色譜串聯(lián)質譜法對色譜峰之間的分離度要求較低。但同一時間段內通過質量分析器的離子太多，會縮短目標離子在檢測器的駐留時間，影響待測物的峰形。本研究利用各種化合物的極性差別，借助柱效較高的粒度為1.7 μm的Kinetex C18色譜柱，以乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動相，采用梯度洗脫法，使各目標物的保留時間分散在1～7 min，在獲得適當保留和理想分離效果的同時，峰形尖銳，靈敏度高。11類化合物中代表性藥物的MRM離子流圖見表1。

圖1 固相萃取法處理的水樣中添加0.5 μg·L-1代表性藥物的MRM離子流圖Fig.1 MRM chromatograms of typical analytes fortified in water samples at 0.5 μg·L-1 which were treated by solid phase extraction

駐留時間對化合物的峰形影響很大。通常情況下，每個峰至少需要采集12個數(shù)據(jù)點，才能使其具有良好的重現(xiàn)性，否則易因峰形失真，影響峰面積而使定量結果偏差較大。當待測物數(shù)量較少時，每個通道的采集方式對檢測結果可能影響不大，但本研究同時測定49種藥物，同一時間段監(jiān)測的離子數(shù)量較多，為提高定量分析的準確度和精密度，在梯度洗脫的基礎上，根據(jù)每個目標峰的保留時間，采用分段采集的方式進行MRM掃描，軟件自動分配駐留時間，盡可能使每個色譜峰都能采集較多的數(shù)據(jù)點。

2.4 方法學考察

配制6個濃度水平的標準溶液，按優(yōu)化的色譜和質譜條件上機測定。以各個藥物的色譜峰面積為縱坐標，以其所對應的濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線。以標準添加法制備樣品，分別采用固相萃取法和冷凍干燥法處理后測定，以定量離子信噪比(S/N)大于3得到方法的檢出限(LOD)。選取實驗室制備的超純水作為空白測試基質，添加3個濃度水平的加標樣品，其中最小的加標濃度，為樣品濃縮后該藥物線性范圍的下限(表2和表3)，每個濃度水平做5個重復，并做空白對照實驗，按照1.4節(jié)所述方法處理后上機測定，計算出各種藥物的加標回收率和相對標準偏差。

結果表明，11類藥物在相應的質量濃度范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)>0.998。采用固相萃取法，各待測物被濃縮100倍后，水體中11類藥物的檢出限為1～ 5 ng/L，加標回收率除孔雀石綠類較低外，其他藥物為67.1%～119%，相對標準偏差<13.6%。冷凍干燥法將各待測物濃縮了20倍，水體中11類藥物的檢出限為5 ～ 30 ng/L，加標回收率為63.1%～120%，相對標準偏差<15.2%。

與大多數(shù)水產(chǎn)品的檢測方法不同，水樣中的藥物濃度可能比較低，需要經(jīng)過濃縮后上機，才能檢測出其中殘留的痕量藥物，因此水樣的方法檢出限常遠低于儀器檢出限。水樣中的藥物濃縮后，濃度落在線性范圍內，即可進行定量分析。

表2 HLB小柱萃取水樣中11類藥物的檢出限、回收率和精密度Tab.2 Limits of detection, recoveries and precision of 11 classes of drug in water samples treated by solid phase extraction with HLB cartridge n=5

表3 冷凍干燥法處理的水樣中11類藥物的檢出限、回收率和精密度Tab.3 Limits of detection, recoveries and precision of 11 classes of drug in water samples treated lyophilization n= 5

2.5 實際樣品測定

從廣東省水產(chǎn)養(yǎng)殖場采集養(yǎng)殖水10份，用建立的方法對水樣進行前處理和上機測定。結果表明，3份水樣中檢出了恩諾沙星、環(huán)丙沙星和磺胺甲噁唑等藥物，質量濃度為117～376 ng/L。

3 結論

本研究建立了水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中硝基呋喃類、磺胺類、氟喹諾酮類、大環(huán)內酯類、林可霉素、沃尼妙林、甲基睪酮、孔雀石綠類、四環(huán)素類、喹噁啉類以及氯霉素類等11類、49種藥物殘留量的分析方法，樣品分別采用固相萃取法和冷凍干燥法濃縮后，經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定。方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于測定水產(chǎn)養(yǎng)殖場池塘水樣中殘留的多種類藥物。

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Determination of 49 veterinary drug residues in aquaculture water byultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHAO Donghao, WANG Qiang, WANG Xufeng, LI Zhiguang, HUANG Ke, LI Liudong*

(Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation (Guangzhou), Fishery Environment and Aquatic Products Quality Inspection & Testing Center of the Ministry of Agriculture (Guangzhou), South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)

An accurate, sensitive and reliable ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was developed for the simultaneous determination of 49 veterinary drugs in water samples. The samples were enriched by solid phase extraction and lyophilization, respectively. Chromatography separation was performed on a Kinetex C18column under gradient elution condition utilizing acetonitrile and 0.1% formic acid as mobile phases. The compounds were quantitated with external standard method in the multiple-period multiple reaction monitoring (MRM) mode using both positive and negative electrospray ionization. The good linearity was achieved in the corresponding concentration range of each analyte and the coefficient of correlation (r) was greater than 0.998. The limits of detection (LOD) were in the range of 5～30 ng/L, and the recoveries of analytes in spiked samples were between 63.1% and 120% with relative standard deviations (RSD) less than 15.2% by lyophilization. The LODs were in the range of 1～5 ng/L, and the recoveries of analytes (except for triphenylmethane dyes) in spiked samples were between 67.1% and 119% with RSDs less than 13.6% by solid phase extraction. The proposed method can be applied to the determination of 49 veterinary drugs in real water samples. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(3):30-37]

veterinary drugs; water; multi-residue determination; solid phase extraction; lyophilization; ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS/MS)

LI Liudong, 168lld@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.03.005

2017-02-22；接收日期：2017-03-28

廣東省水產(chǎn)品質量安全專項(GDSCZA2015008)；中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金資助(2014TS28)；國家農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估重大專項(GJFP201501003)

趙東豪(1981-)，男，博士，助理研究員，研究方向為水產(chǎn)品質量安全與風險評估， donghaozhao@126.com 通信作者：李劉冬，研究員，研究方向為水產(chǎn)品質量安全與風險評估方向的研究，168lld@163.com

S91;O657.63

A

2095-1833(2017)03-0030-08