李丹 羅怡 盧奕

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·基礎(chǔ)研究·

紫外線C誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞中CRYAA表達(dá)的上升△

李丹 羅怡＊盧奕＊

目的 研究在紫外線照射下人晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)中晶狀體蛋白的表達(dá)變化。方法 用波長為254 nm的紫外線C(UVC)照射LEC(包括原代細(xì)胞和細(xì)胞系)，一定時(shí)間后收集照射后的細(xì)胞進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：①碘化丙啶(PI)染色和線粒體膜電位流式檢測對細(xì)胞進(jìn)行凋亡評估；②實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測CYRAA,CRYAB,CRYBB2基因的mRNA表達(dá)量；③免疫熒光染色檢測CRYAA的蛋白表達(dá)；④焦磷酸測序檢測CRYAA基因的啟動子區(qū)域甲基化。結(jié)果 LEC在強(qiáng)度為25 μW/cm2的UVC照射0、10、20、30 min后立即做PI染色，結(jié)果顯示：隨著照射時(shí)間的增加，細(xì)胞凋亡率遞增，分別為0、7%、33%和100%。LEC在UVC照射10 s并培養(yǎng)24 h后100%死亡；照射5 s并培養(yǎng)24 h后，部分凋亡，CRYAA基因表達(dá)量顯著上調(diào)(>4倍)，但是細(xì)胞傳代后CRYAA基因表達(dá)量恢復(fù)正常水平。焦磷酸測序結(jié)果顯示，CRYAA基因的啟動子區(qū)甲基化水平無明顯變化。結(jié)論 LEC在受到強(qiáng)度為25 μW/cm2的UVC照射10 s并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后死亡，照射5 s并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，CRYAA基因表達(dá)上調(diào)，提示其抗氧化作用，但該上調(diào)不是通過CRYAA基因啟動子甲基化改變來調(diào)控的。(中國眼耳鼻喉科雜志，2017，17：239-244)

白內(nèi)障；紫外線；CRYAA；細(xì)胞凋亡

白內(nèi)障被定義為晶狀體渾濁，在全球范圍內(nèi)約有1 600萬患者，是主要的致盲眼病[1]?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為白內(nèi)障是隨著年齡老化自然發(fā)生的，平均在50歲開始發(fā)病。同時(shí)，若干其他因素也會影響、加速白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展，包括家族遺傳、眼外傷、糖尿病、眼部炎癥、長時(shí)間暴露在紫外線(ultraviolet，UV)下等因素。已經(jīng)被普遍認(rèn)同的是：長期在可接觸UV環(huán)境下工作的人(不論UV是來自于太陽光，還是消毒燈)，患白內(nèi)障的年齡會比平均年齡提前。這個(gè)現(xiàn)象說明UV照射和白內(nèi)障發(fā)生間有直接聯(lián)系。

人眼的晶狀體是一個(gè)由緊密、整齊排列的無核纖維細(xì)胞組成的透明橢圓球體和覆蓋在上面的一層囊膜構(gòu)成。在前囊膜上生長有單層晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells, LEC)。在人的一生中，LEC能夠不斷分化成纖維細(xì)胞，達(dá)到晶狀體纖維細(xì)胞的新老更替。許多研究[2]結(jié)果表明白內(nèi)障的發(fā)生始于LEC的病變，因此我們選擇人LEC作為實(shí)驗(yàn)材料來研究UV對晶狀體的影響。以往研究表明UV會對豬LEC[3]和人LEC造成損傷[4-6]。其中在對豬LEC的研究中發(fā)現(xiàn)，UV在波長250～280 nm區(qū)對細(xì)胞的傷害最大[3]。基于這個(gè)結(jié)論，在本項(xiàng)研究中，我們選擇用波長254 nm UV(UV-254)對人LEC照射并在基因和細(xì)胞水平做相關(guān)檢測。

1 資料與方法

1.1 資料 來自于人的材料已通過復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院倫理委員會審核。人的材料是來自本院白內(nèi)障手術(shù)中撕囊的囊膜片段，已經(jīng)得到患者的同意。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系人LEC系 SRA01/04[7]購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所。在后文中，如未作特殊說明，LEC均指人LEC。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 來自于人晶狀體囊膜的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法如下。先將前囊膜用微型剪剪成小片段(直徑約2 mm)，并轉(zhuǎn)移到直徑35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿。加入DMEM(Gibco 11995， Life Technologies, NY, USA)加20% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Gibco 10099141)的培養(yǎng)液至剛好蓋住培養(yǎng)皿底部(這樣可以幫助囊膜貼壁)，37℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h后，加入1 mL 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d。之后每天換液。培養(yǎng)1周后，原代細(xì)胞從囊膜中爬出并增殖。用刮刀刮下細(xì)胞用來做分子實(shí)驗(yàn)。來自于細(xì)胞系的SRA01/04細(xì)胞用DMEM加10% FBS進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)備用。1.2.2 細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞凋亡和壞死試劑盒(C1056，碧云天，中國)檢測。按照說明書孵育后，對細(xì)胞進(jìn)行Hoechst 33342和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，然后在熒光顯微鏡下觀察。每個(gè)培養(yǎng)皿中至少計(jì)數(shù)了1 300個(gè)細(xì)胞(并被判定為活細(xì)胞或死細(xì)胞)。

1.2.3 線粒體膜電位檢測實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞早期凋亡用線粒體膜電位檢測試劑盒(C2006，碧云天，中國)檢測。在該方法中，JC-1是一種通常用于檢測線粒體膜電位(Δψm)的熒光素，Δψm的降低是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志之一。當(dāng)Δψm高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)呈紅色熒光；當(dāng)Δψm低時(shí)，JC-1無法聚集而形成單體，呈綠色熒光。在細(xì)胞用JC-1處理20 min后，用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行流式檢測。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將細(xì)胞用刮刀從培養(yǎng)皿中刮下后收集在1.5 mL的EP管中。用TRIzol(15596; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取RNA并測定其濃度。將等量的RNA(2 μg)用PrimeScript RT Master Mix試劑盒(RR036， Takara，中國大連)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將此作為模板用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(RR420， Takara)行熒光定量PCR(qPCR)檢測。使用儀器為ABI 7500 (Life Technologies, 美國)?；颚?actin為內(nèi)參基因。所測基因引物為CRYAA: Forward 5′- GAC GAC CAC GGC TAC ATT TC-3′, Reverse 5′- GGC AGA CAG GGA GCA AGA-3′; for CRYAB: Forward 5′- GTT GGG AGA TGT GAT TGA G-3′, Reverse 5′- GAT GAC AGG GAT GAA GTA ATG-3′; for CRYBB2: Forward 5′- GGA CAG CCA AGA GCA CAA GA-3′, Reverse 5′- ACC CGC ACA GAT GAC ACC T-3′; for DNMT1 Forward 5′-GTG GGG GAC TGT GTC TCT GT-3′，Reverse 5′-TGA AAG CTG CAT GTC CTC AC-3′; for β-actin: Forward 5′- AAG GTG ACA GCA GTC GGT T-3′, Reverse 5′- TGT GTG GAC TTG GGA GAG G-3′。1.2.5 焦磷酸測序 DNA抽提使用DNA-easy blood and tissue kit試劑盒(天根，中國)。對2 μg基因組DNA用EpiTect Bisulfite kit試劑盒(Qiagen，加拿大)進(jìn)行二硫酸鹽處理，隨后在選定的CRYAA基因的啟動子CpG島區(qū)域(-757～-706)進(jìn)行焦磷酸測序(pyrosequencing)。所用引物是：Forward 5′-biotin-GTG ATA GGG AAG TGG GGA TAT GT-3′, Reverse 5′- CCT AAA CCC CCA ACC CCA TAA CCA T-3′, 測序引物為 5′- CAA CCC CAT AAC CAT C-3′。

1.2.6 免疫熒光染色 LEC用4%多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton破膜10 min，10%羊血清封閉30 min，隨后加一抗孵育2 h。用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)洗3次后加二抗Alexa-Fluor 488(Jackson Immuno Research, 美國)1∶400孵育1 h。用PBS洗3次后加Hoechst 33342 1∶2 000孵育1 min，用PBS洗3次后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 LEC在UVC照射30 min后立即死亡 首先對254 nm UVC(功率為25 μW/cm2)持續(xù)照射后的細(xì)胞進(jìn)行即時(shí)觀察，對LEC(文中如未做特別說明，則LEC指的是細(xì)胞系SRA01/04培養(yǎng)而來的細(xì)胞)死亡檢測。經(jīng)過Hoechst和PI染色后，死細(xì)胞因?yàn)榧?xì)胞膜破裂會吸收PI而在熒光顯微鏡下發(fā)出紅色熒光。在分別照射0、10、20和30 min后，細(xì)胞死亡率分別為0、7%、33%和100%(圖1)。

圖1. UVC照射后細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn) LEC在UVC照射0 min (A), 10 min (B), 20 min (C)和30 min (D)后進(jìn)行PI和Hoechst染色。死細(xì)胞在PI通道會發(fā)出紅色。細(xì)胞死亡率顯示在最右欄

2.2 LEC在UVC照射數(shù)秒后即會引起早期凋亡 在發(fā)現(xiàn)30 min的UVC持續(xù)照射會導(dǎo)致LEC 100%立即死亡后，對細(xì)胞進(jìn)行UVC照射數(shù)秒，隨后培養(yǎng)24 h后做早期凋亡檢測。選擇的照射時(shí)間為2 s、5 s、10 s和30 s。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LEC經(jīng)過10 s UVC照射，培養(yǎng)24 h后全部從培養(yǎng)皿底部漂起死亡；而經(jīng)過5 s UVC照射，培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察大約有25%的細(xì)胞漂起；經(jīng)過2 s UVC照射，培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察未見明顯的細(xì)胞漂起現(xiàn)象。進(jìn)而使用JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位(Δψm)來提示細(xì)胞早期凋亡程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過5 s UVC照射并培養(yǎng)24 h后，早期凋亡率與未處理細(xì)胞相比提高了2倍(從1.8%到5.4%)。2.3 UVC照射后CRYAA基因表達(dá)量升高 基于以上結(jié)果，選擇對LEC進(jìn)行5 s UVC照射并繼續(xù)培養(yǎng)，因?yàn)樵谶@個(gè)劑量的刺激下，既能引起細(xì)胞部分損傷又不至于全部死亡。在照射后不同時(shí)間點(diǎn)用qPCR檢測了3個(gè)編碼晶狀體蛋白基因的mRNA水平：CRYAA，CRYAB和CRYBB2代表α和 β 晶狀體蛋白的表達(dá)水平。選擇UVC照射5 s后培養(yǎng)0 h，6 h，24 h，傳第二代后(P2)以及傳第三代后(P3)共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)來做基因表達(dá)檢測，結(jié)果如圖3所示。相較于0 h，CRYAA和CRYAB的表達(dá)量在24 h分別升高到4.6和2.6倍，并在P2，P3回歸到0 h水平。這一結(jié)果說明UVC短時(shí)照射會刺激細(xì)胞啟動保護(hù)機(jī)制。而α晶狀體蛋白已知具有細(xì)胞抗氧化損傷、熱損傷的作用[8-10]，因此CRYAA，CRYAB表達(dá)水平升高。而在傳代后期表達(dá)水平的回落提示在傳代過程中死細(xì)胞的去除以及新增殖細(xì)胞抵消了受損細(xì)胞的影響。

圖2. UVC引起的線粒體膜電位改變 未接受(A)和接受UVC照射(B)的LEC線粒體膜電位檢測結(jié)果顯示(C4象限代表JC-1單體形式，即細(xì)胞早期凋亡標(biāo)志)，UVC照射5 s并培養(yǎng)24 h后會引起早期凋亡的升高

我們之前的研究結(jié)果證實(shí)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中，CRYAA基因的表達(dá)量降低與其啟動子區(qū)域內(nèi)高甲基化水平相關(guān)[11]。因此猜測UVC引起了CRYAA基因的啟動子甲基化降低，從而調(diào)控了其表達(dá)量的升高。于是檢測了一個(gè)主要的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶基因DNMT1的表達(dá)量，同樣使用qPCR檢測。但是檢測結(jié)果顯示DNMT1在24 h同樣也是升高的，提示CRYAA基因表達(dá)量的升高應(yīng)該不是受甲基化調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的。此外，我們還在原代培養(yǎng)的LEC(即從白內(nèi)障手術(shù)中的囊膜片段進(jìn)行原代培養(yǎng)的細(xì)胞)上驗(yàn)證了這種基因表達(dá)的變化(圖3B)。由于原代細(xì)胞的材料不易取得且較難培養(yǎng)，選擇了2個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示在UVC 5 s并培養(yǎng)24 h后，CRYAA基因的表達(dá)升高1.3倍，而CRYAB和CRYBB2基因則無明顯變化。這種與用細(xì)胞系做基因檢測所得到結(jié)果的不一致應(yīng)該是細(xì)胞系(圖3C)和原代細(xì)胞(圖3D)本身的性質(zhì)(即其內(nèi)源晶狀體基因的起始轉(zhuǎn)錄本量)不一樣所導(dǎo)致的。有證據(jù)[12-14]表明來自于細(xì)胞系培養(yǎng)的LEC中，晶狀體蛋白相較于原代人LEC有極大的降低。但DNMT1的表達(dá)無論在細(xì)胞系還是原代LEC中，UVC照射均可引起其基因表達(dá)升高大約2倍。對DNMT1這種升高的機(jī)制和影響的解讀是一個(gè)未來可以深入研究的方向。

除此之外，我們還用人αA和αB晶狀體蛋白的抗體(CRYAA和CRYAB)對UVC照射5 s并培養(yǎng)24 h前后的LEC做了熒光染色。結(jié)果如圖4所示，用綠色熒光信號表征的CRYAA和CRYAB蛋白表達(dá)量在UVC照射5 s并培養(yǎng)24 h后有明顯升高。

圖3. 晶狀體基因和DNMT1基因在UVC照射前后的表達(dá)變化 A.在細(xì)胞系SRA01/04中各基因的qPCR檢測結(jié)果；B.在原代培養(yǎng)LEC中各基因的qPCR檢測結(jié)果；C.細(xì)胞系SRA01/04；D.原代培養(yǎng)LEC顯微鏡下觀察圖片，標(biāo)尺200 μm

圖4. 免疫熒光染色顯示CRYAA和CRYAB的表達(dá)量升高 在LEC細(xì)胞未經(jīng)過處理(A,C)和經(jīng)過UVC照射5 s并培養(yǎng)24 h后(E,G)用CRYAA和CRYAB抗體做免疫熒光染色；細(xì)胞核DNA用Hoechst染色(B,D,F,H)

2.4 焦磷酸測序結(jié)果顯示CRYAA甲基化水平正常 為了進(jìn)一步探究CRYAA被UVC照射后產(chǎn)生的表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，我們利用焦磷酸測序技術(shù)對CRYAA基因啟動子區(qū)域(-757～-706)的CpG島序列(圖5A)的甲基化水平做了檢測。選擇如前文所述的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測序結(jié)果如圖5B所示，顯示并無明顯差異。這個(gè)結(jié)果提示，CRYAA表達(dá)量的增加不是由于其啟動子區(qū)的低甲基化來實(shí)現(xiàn)的。

圖5. UVC照射后CRYAA啟動子CpG島甲基化水平檢測 A.CRYAA基因啟動子-757～-706序列。B.在UVC照射5 s后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)做焦磷酸測序檢測，其平均水平于最后一欄所示

3 討論

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)已經(jīng)明確白內(nèi)障在過度太陽光照的國家相比其他國家會早發(fā)、高發(fā)。并且，在這些國家里，由白內(nèi)障手術(shù)取出的白內(nèi)障晶狀體顏色更深[15-16]。這些數(shù)據(jù)表明了直接的UV照射和晶狀體渾濁之間的相關(guān)性。在分子機(jī)制層面，在一定的時(shí)間和強(qiáng)度UV照射后，凋亡基因Bax表達(dá)升高，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)降低，并且Bax/Bcl-2比值和LEC凋亡水平呈正相關(guān)[17]。在更系統(tǒng)的基因組表達(dá)研究中，Osada等[6]用基因芯片比較了UVB照射前后LEC全基因組表達(dá)的變化，并重點(diǎn)分析了細(xì)胞外蛋白，篩選出了18個(gè)編碼分泌蛋白的基因有2倍以上上調(diào)。這些研究都表明外部UV照射能在分子水平上對細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。對于白內(nèi)障患者，UV照射是如何加重晶狀體渾濁程度的，其分子機(jī)制是我們試圖探究的謎題。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了UV對LEC更直接的影響，即重點(diǎn)分析LEC組成晶狀體的最重要成分：晶狀體蛋白編碼基因的表達(dá)量變化。在人晶狀體中，水溶性的晶狀體蛋白約占90%，并根據(jù)其性狀主要分為3類：α, β和 γ[18-19]。其中α晶狀體蛋白又由αA和αB的多肽鏈組成復(fù)合物，并具有分子伴侶(chaperone)調(diào)控蛋白折疊的功能，以幫助蛋白在晶狀體及其他組織里規(guī)則有序地排列[20-22]，提供有序的梯度折光率以確保其組織透明性。特別是編碼αA晶狀體蛋白的CRYAA基因，其啟動子區(qū)是首個(gè)被鑒定出在哺乳動物中具有組織特異性/偏向性的啟動子[23]，因此，被當(dāng)作晶狀體中的明星分子得到廣泛研究[24]。而β和γ晶狀體蛋白則會形成β/γ超級家族，β晶狀體蛋白也是晶狀體中含量最豐富的水溶性蛋白。在本研究中，我們選擇了CRYAA,CRYAB和CRYBB2(分別編碼αA, αB 和βB2晶狀體蛋白)這3個(gè)基因作為代表來表征整體的晶狀體蛋白水平。經(jīng)過一系列測試發(fā)現(xiàn)，功率25 μW/cm2紫外燈在254 nm波長照射5 s是合適的照射強(qiáng)度，在這個(gè)強(qiáng)度下，培養(yǎng)皿中的細(xì)胞既受到了UVC的影響，又能存活。根據(jù)圖3的qPCR和圖4的熒光染色結(jié)果，我們觀察到CRYAA和CRYAB在UVC照射5 s并培養(yǎng)6 h及24 h后有不同程度的上調(diào)，而CRYBB2的表達(dá)量則比較穩(wěn)定。這也和以往的研究[8-10]結(jié)果相吻合，即α晶狀體蛋白在受到氧化應(yīng)激、高溫及亞硝酸鹽處理時(shí)會啟動對細(xì)胞的保護(hù)作用。因此推測α 和 β晶狀體蛋白在UVC刺激下的不同表現(xiàn)可能是由于α晶狀體蛋白特殊的抗凋亡能力。

根據(jù)qPCR結(jié)果(圖3A)，甲基化轉(zhuǎn)移酶基因DNMT1的表達(dá)無論在細(xì)胞系還是原代LEC中，UVC照射均可引起其基因表達(dá)升高大約2倍。這與我們設(shè)想的CRYAA升高可能是其啟動子區(qū)去甲基化的結(jié)果相違背(如果CRYAA的升高是其啟動子區(qū)去甲基化的結(jié)果，那么最直接的解釋是甲基化轉(zhuǎn)移酶如DNMT1表達(dá)降低或者去甲基化酶如TET2升高)。于是對CRYAA的啟動子區(qū)進(jìn)行了甲基化焦磷酸測序，結(jié)果證實(shí)UVC引起的CRYAA，CRYAB表達(dá)升高并不是通過甲基化水平來調(diào)節(jié)的。我們推測，像老年性白內(nèi)障發(fā)生過程一樣，甲基化水平的改變需要更長時(shí)間的慢性影響；而對由UVC照射引起DNMT1表達(dá)升高機(jī)制和影響的解讀是未來一個(gè)可以深入研究的方向。

志謝 感謝為本實(shí)驗(yàn)提供手術(shù)材料的白內(nèi)障患者。感謝復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院吳繼紅教授為本研究提供的寶貴建議。

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(本文編輯 諸靜英)

Ultraviolet C induced up-regulation expression ofCRYAAin human lens epithelial cells

LI Dan, LUO Yi＊, LU Yi＊.

Research Center, Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University, Shanghai 200031, China

LU Yi, Email: luyieent@126.com

Objective To investigate the crystalline expression change induced by ultraviolet (UV) exposure in human lens epithelial cells (LECs). Methods LECs (including cells from primary culture and cell line) were exposed to UVC at the wavelength of 254 nm for certain time and were collected for the following assays: ①apoptosis detection by propidium iodide (PI) staining and mitochondrial membrane potential evaluation; ②quantitative PCR (qPCR) for measuring the expression of crystallin coding genesCYRAA,CRYABandCRYBB2; ③Immunofluorescence staining ofCRYAA; ④pyrosequencing analysis of the promoter region ofCRYAAto evaluated the methylation status. Results LECs exposed to UVC at the intensity of 25 μW/cm2for 0, 10, 20 and 30 min showed an increasing apoptosis rate by immediate propidium iodide (PI) staining at 0, 7%, 33% and 100%. LECs exposed to UVC for 10 seconds or longer died at 100% after 24 hours, whereas LECs exposed to UVC for 5 seconds died partially after 24 hours; theCRYAAgene expression showed a significant increase after 24 hours. The pyrosequencing ofCRYAApromoter showed that the methylation status did not change in the UVC-treated cells. Conclusions The exposure to UVC for longer than 10 seconds would 100% kill the cultured LECs. A 5 seconds-exposure to UVC would induce an increase inCRYAAexpression, and the up-regulation is not the result from demethylation. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:239-244)

Cataract; Ultraviolet;CRYAA; Cell apoptosis

國家自然科學(xué)基金(81200668)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心＊眼科 衛(wèi)生部近視眼及相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200031

盧奕(Email：luyieent@126.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.04.003

2016-08-22)