胡秀娟 劉海兵 賀廣湘

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·基礎(chǔ)研究·

脂多糖對人鼻黏膜上皮細(xì)胞人β防御素2誘導(dǎo)表達(dá)的影響△

胡秀娟 劉海兵 賀廣湘＊

目的 觀察脂多糖(LPS)誘導(dǎo)人鼻黏膜上皮細(xì)胞人β防御素2(hBD-2)表達(dá)的影響。方法 用LPS刺激人鼻黏膜上皮細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測hBD-2 mRNA的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測hBD-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 LPS刺激2 h后人鼻黏膜上皮細(xì)胞可見hBD-2 mRNA的表達(dá)，并呈劑量和時(shí)間依賴性；刺激4 h后人鼻黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中可見hBD-2蛋白的表達(dá)。結(jié)論 一定劑量的LPS可誘導(dǎo)人鼻黏膜上皮細(xì)胞hBD-2的表達(dá)，這種表達(dá)具有一定的劑量和時(shí)間依賴性。(中國眼耳鼻喉科雜志，2017，17：245-248)

人鼻黏膜上皮細(xì)胞；人β防御素2；脂多糖

鼻-鼻竇炎是常見的難治性疾病，發(fā)病率高達(dá)16%，極大影響了人們的健康和生活質(zhì)量[1]。目前其治療效果欠佳，復(fù)發(fā)率高。而人β防御素2(human β defensin 2, hBD-2)廣泛表達(dá)于包括鼻黏膜在內(nèi)的各種黏膜細(xì)胞和上皮組織，不僅具有廣譜抗微生物活性，迄今未發(fā)現(xiàn)對其有明顯抗性的噬菌體，而且在先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用[2]。因此作為內(nèi)源性“超級抗生素”的hBD-2有可能成為一種新型的鼻-鼻竇炎治療藥物，既能解決細(xì)菌耐藥問題，又能發(fā)揮免疫防御功能，在治療鼻-鼻竇炎中具有廣泛的應(yīng)用前景，可能給鼻-鼻竇炎的治療帶來新的革命，值得進(jìn)一步深入研究。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入研究脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)對鼻黏膜上皮細(xì)胞hBD-2的誘導(dǎo)表達(dá)作用，以期從分子生物學(xué)水平明確鼻黏膜上皮細(xì)胞中hBD-2誘導(dǎo)表達(dá)的規(guī)律和機(jī)制，為深入研究鼻-鼻竇炎的有效防治提供理論依據(jù)和線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 DMEM:Ham F12以1∶1配比，0.25%膠原酶、Hank液(Hyclone公司)，Keratinocyte-SFM(GIBCO公司)，胎牛血清(四季清公司)，I型膠原酶和LPS購自Sigma公司，BD-2(C-17)(SC-10854，美國SANTA公司)，Total RNA 試劑盒Ⅱ(R6934-01，OMEGA公司),Rever Tra Ace qPCR RT試劑盒(TOYOBO公司)，2×Taq Master Mix、DNA Marker(TIANGEN公司)，hBD-2上下游引物(255 bp)、GAPDH上下游引物(452 bp)均由上海生工公司合成。

1.2 原代鼻黏膜上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 標(biāo)本來自湘雅三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科同期做鼻中隔矯正術(shù)、鼻腔血管電凝術(shù)患者。經(jīng)患者同意，在行鼻內(nèi)鏡手術(shù)時(shí)取其下鼻甲黏膜。所有患者無全身及鼻腔局部炎癥、無變態(tài)反應(yīng)性疾病，取材前近2個(gè)月無全身及局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及其他抑制細(xì)胞生長藥物史，無鼻手術(shù)、外傷史。在無菌條件下，生理鹽水浸洗，去除粘附的鼻甲、壞死組織及黏液、血液，放入4 ℃的保存液中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞培養(yǎng)室。4 h內(nèi)于無菌超凈臺上，用含10 mg/L氟康唑和100 mg/L慶大霉素的生理鹽水反復(fù)沖洗下鼻甲黏膜3～5遍后，將下鼻甲黏膜剪成1 mm ×1 mm×1 mm大小的組織塊。參照王振霖等[3]的方法并略作改動，以組織塊30～50倍體積的0.1% 膠原酶37 ℃消化30 min，加入等量0.25%的胰蛋白酶消化5 min，加入適量含15%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。靜置后組織塊沉于無菌玻璃皿底時(shí)，吸去上清液，以1 mL無菌注射器挑起組織塊，均勻種植于25 cm×25 cm瓶底，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，在對側(cè)加入5 mL含15%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2、95% O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。48 h 后更換Keratinocyte-SFM(K-SFM)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每4 d換液。傳代后種板，72 h后進(jìn)行細(xì)胞角蛋白鑒定。

1.3 LPS刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞 待第10天左右細(xì)胞呈對數(shù)生長時(shí)進(jìn)行消化傳代，以1∶3的比例種板。待細(xì)胞基本融合，生長狀態(tài)良好時(shí)分別予以LPS 0、1、10 μg/mL的濃度進(jìn)行刺激，并取LPS 10 μg/mL的濃度分別刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞0、2、4、6、24 h，收集不同濃度刺激后的細(xì)胞總RNA及不同時(shí)相點(diǎn)的細(xì)胞總RNA，以LPS 10 μg/mL的濃度刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞4 h后檢測胞質(zhì)蛋白。

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 采用Trizol法抽提總RNA，行完整性檢測。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配置反應(yīng)體系：5×RT緩沖液4 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、Primer Mix 1 μL、RNA 3 μg(通過所測濃度依次計(jì)算需加入反應(yīng)體系的各樣本RNA體積)，最后加入Nuclease-free Water使總體積達(dá)20 μL。在37 ℃反轉(zhuǎn)錄成cDNA,參照試劑盒說明書加樣至20 μL體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共33個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。陽性對照GAPDH，產(chǎn)物長度為452 bp,上游：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′；hBD-2引物上游： 5′-CCA GCC ATC AGC CAT GAC GGT-3′，下游：5′-GGA GCC CTT TCT GAA TCC GCA-3′，產(chǎn)物長度為255 bp。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定，3%H2O2室溫孵育去除內(nèi)源性過氧化物酶，0.2%的Triton X-100室溫處理30 min增加細(xì)胞膜通透性，封閉液封閉，一抗(山羊抗hBD-2)孵育過夜，二抗孵育2 h。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染，樹膠封片。本組實(shí)驗(yàn)中LPS 0 μg/mL為對照組。

1.6 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 各測量組的電泳圖片用凝膠成像系統(tǒng)照相后進(jìn)行吸光度值測定，將目的基因的吸光度值與GAPDH的吸光度值進(jìn)行比較，得出相對值。相對值越高，說明目的基因轉(zhuǎn)錄水平越高。hBD-2在黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色或棕黃色顆粒為陽性，與蘇木素復(fù)染后細(xì)胞核藍(lán)染不重疊，定位區(qū)分明確。

2 結(jié)果

2.1 LPS刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞對hBD-2 mRNA表達(dá)的作用 不同濃度的LPS(0、1、10 μg/mL)刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞4 h后，hBD-2 mRNA表達(dá)呈劑量依賴性升高，經(jīng)電泳后在凝膠上呈現(xiàn)的亮度隨著刺激濃度的增加而增加(圖1)。將hBD-2mRNA與GAPDH的吸光度比值[LPS為0、1、10 μg/mL時(shí)分別為(0.35±0.035)(0.51±0.009)(0.62±0.002)]進(jìn)行比較，可見兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1. LPS刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞對hBD-2mRNA表達(dá)的作用

2.2 一定濃度LPS不同時(shí)間點(diǎn)刺激上皮細(xì)胞對hBD-2 mRNA表達(dá)的作用 用一定濃度的LPS(10 μg/mL)刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞，在0、2、4、6、24 h時(shí)檢測hBD-2mRNA的表達(dá)。從電泳后的凝膠上呈現(xiàn)的亮度變化可見看出，2 h時(shí)可見鼻黏膜上皮細(xì)胞中hBD-2 mRNA表達(dá)，4 h表達(dá)最明顯，6 h有所下降，24 h后降低明顯(圖2)。將hBD-2 mRNA與GAPDH的吸光度比值[0、2、4、6、24 h后分別為(0.44±0.029)(0.56±0.029)(0.60±0.028)(0.52±0.029)(0.50±0.027)]進(jìn)行比較，可見兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2. hBD-2mRNA表達(dá)與LPS刺激的時(shí)效關(guān)系

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測hBD-2的表達(dá) 正常情況下，未受刺激的對照組鼻黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)呈半透明狀，基本未檢測到hBD-2蛋白的表達(dá)；用一定濃度的LPS(10 μg/mL)刺激4 h，免疫細(xì)胞化學(xué)法證實(shí)鼻黏膜上皮細(xì)胞有hBD-2蛋白表達(dá)，主要分布在胞質(zhì)中，呈棕色顆粒(圖3)。

圖3. 鼻黏膜上皮細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色(SP法×100倍) A.未受刺激的對照組鼻黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)呈半透明狀;B.受刺激的鼻黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)黃染

3 討論

hBD-2是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的富含半胱氨酸的內(nèi)源性抗微生物活性肽，具有抵御病原微生物入侵的生物活性，參與了許多疾病的病理生理過程。與hBD-1的固有表達(dá)不同，hBD-2在某些組織如氣道上皮中呈微量的固有表達(dá)，但主要表現(xiàn)為受到炎癥刺激后的誘導(dǎo)表達(dá)?？烧T導(dǎo)hBD-2表達(dá)的因素包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、魯斯假絲酵母(念珠菌)、白假絲酵母、人類免疫缺陷病毒(HIV-1)等微生物；一些細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素α(interleukin α,IL-α)、IL-β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-γ、L-異亮氨酸和LPS等物質(zhì)也可誘導(dǎo)hBD-2的表達(dá)。不同的微生物成分可誘導(dǎo)不同防御素分子的表達(dá)，以對抗不同微生物感染，而不同刺激因素對hBD-2的誘導(dǎo)存在著明顯的不同[4-7]。近年來對hBD-2的誘導(dǎo)研究以及誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制的研究也越來越多。

鼻部炎癥性疾病多與革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌以及真菌感染等有關(guān)。LPS是含糖和脂的化合物,糖多于脂,是革蘭陰性細(xì)菌外膜的主要成分，可作用于體內(nèi)的巨噬細(xì)胞等，使之產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子[8]。因此，用LPS刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞從而誘導(dǎo)hBD-2的表達(dá)具有一定的代表性。

目前關(guān)于鼻部hBD-2表達(dá)的研究也不少，但系統(tǒng)應(yīng)用革蘭陰性菌毒性物質(zhì)誘導(dǎo)hBD-2的表達(dá)尚罕見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)應(yīng)用革蘭陰性菌毒性物質(zhì)LPS刺激培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞，觀察hBD-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LPS能誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞中hBD-2的表達(dá)，且在一定劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性，這與文獻(xiàn)[9]報(bào)道LPS誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞hBD-2的表達(dá)規(guī)律一致。另外，一定濃度LPS(10 μg/mL)刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)刺激2 h時(shí)hBD-2的表達(dá)增加，4 h時(shí)表達(dá)增加明顯，6 h時(shí)較4 h有所減少，24 h時(shí)開始降低，說明當(dāng)病原微生物侵襲上呼吸道時(shí)，hBD-2的表達(dá)、分泌可能是上呼吸道最初的防御反應(yīng)，參與早期的抗菌過程。

hBD-2誘導(dǎo)表達(dá)的機(jī)制和信號傳導(dǎo)通路目前并不完全清楚。有研究[10-12]發(fā)現(xiàn)，首先各種刺激因素被靶細(xì)胞上的病原識別受體識別，如Toll樣受體、CD14等，然后通過某種信號通路傳導(dǎo)這種刺激并誘導(dǎo)hBD-2表達(dá)和上調(diào)。Scharf等[12]研究發(fā)現(xiàn)，嗜肺軍團(tuán)桿菌刺激人肺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)hBD-2表達(dá)是通過TLR2和TLR5介導(dǎo)的，同時(shí)p38MAPK、JNK、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和AP-1信號通路都參與了調(diào)控。趙俊麗等[13]發(fā)現(xiàn)LPS可能通過TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)hBD-2。有學(xué)者[14]在體外白假絲酵母刺激食管細(xì)胞株誘導(dǎo)hBD-2和hBD-3表達(dá)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，兩者調(diào)控的信號傳導(dǎo)通路是不同的，其中hBD-2表達(dá)調(diào)控的信號傳導(dǎo)通路是NF-κB和AP-1信號傳導(dǎo)通路協(xié)同作用，而hBD-3是獨(dú)立依賴EGFR/MAPK/AP-1信號傳導(dǎo)通路調(diào)控。Yoon等[15]發(fā)現(xiàn)脆弱類桿菌腸毒素刺激小腸上皮細(xì)胞誘導(dǎo)hBD-2的表達(dá)時(shí)需要通過絲裂原激活蛋白激酶/IκB激酶/NF-κB信號傳導(dǎo)通路。以上研究表明，不同防御素表達(dá)調(diào)控的信號傳導(dǎo)通路是不同的[14]，并且hBD-2的誘導(dǎo)表達(dá)也可能是通過多種信號通路實(shí)現(xiàn)的。外來刺激信號通過激活NF-κB可能是上皮細(xì)胞hBD-2基因激活的機(jī)制之一。然而亦可能還有其他激活通路，如p38MAPK、JNK、NF-κB和AP-1途徑。李同麗等[16]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞致炎在 30 min 內(nèi)和濃度在1 mg/L內(nèi)是以時(shí)間和濃度“正依賴”方式導(dǎo)致p38MAPK的活性增強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)不足之處在于沒有用更多的刺激濃度刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞，但目前誘導(dǎo)表達(dá)規(guī)律的揭示，為下一步通過信號通路基因芯片對鼻黏膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)hBD-2表達(dá)的調(diào)控信號通路進(jìn)行檢測奠定了基礎(chǔ)。

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(本文編輯 楊美琴)

Roles of lipopolysaccharide in the expression of human β defensin 2 in human nasal mucosa epithelial cells

HU Xiu-juan, LIU Hai-bing, HE Guang-xiang＊.

Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, the Affiliated Hospital of Chengdu University, Chengdu 610081, China

HE Guang-xiang, Email: hgx2000@163.com

Objective To explore the role of lipopolysaccharide (LPS) in the expression of human β defensin 2(hBD-2) in human nasal mucosa epithelial cells. Methods After the human nasal mucosa epithelial cells were stimulated with LPS, the expression of hBD-2 mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and the expression of hBD-2 protein was detected by immunocytochemistry. Results The hBD-2 mRNA could be detected 2 hours after LPS stimulation and expressed in a dose- and time-dependent manner. The hBD-2 protein could be detected in cytoplasm 4 hours after LPS stimulation. Conclusions A certain dose of LPS could induce the expression of hBD-2 in human nasal mucosa epithelial cells in a dose- and time-dependent manner. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:245-248)

Human nasal mucosa epithelial cells; Human β defensin 2; Lipopolysaccharide

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(14JJ2038)；湖南省長沙市科技項(xiàng)目(K1203050-31)

成都大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 成都 610081;＊中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 長沙 410013

賀廣湘(Email: hgx2000@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.04.005

2016-11-17)