蔣慧慧

（巢湖學(xué)院，安徽 巢湖 238000）

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中啟動(dòng)元件的研究進(jìn)展

蔣慧慧

（巢湖學(xué)院，安徽 巢湖 238000）

畢赤酵母是真核細(xì)胞常用表達(dá)系統(tǒng)之一，具有細(xì)胞密度高、純化方法簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)錄后修飾功能完善等優(yōu)點(diǎn)。作為重要的調(diào)控元件，表達(dá)系統(tǒng)中啟動(dòng)元件的功能強(qiáng)弱與表達(dá)效率的高低密切相關(guān)。目前，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動(dòng)元件分為三類(lèi)，分別是以pAOX為代表的甲醇誘導(dǎo)型、以pGAP為代表的非甲醇誘導(dǎo)型，還有一些新型工業(yè)酵母啟動(dòng)子也是理想的表達(dá)系統(tǒng)啟動(dòng)元件。充分了解這些酵母啟動(dòng)子的最新研究進(jìn)展，可以為工業(yè)酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化提供重要的發(fā)展思路。

畢赤酵母；啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型；組成型

畢赤酵母（Pichia pastoris）是為數(shù)不多的商業(yè)化真核表達(dá)系統(tǒng)之一，自上世紀(jì)70年代Phillips Petroleum公司成功開(kāi)發(fā)出P.pastoris高密度培養(yǎng)方案，迄今已有超過(guò)600種蛋白質(zhì)成功利用這一微生物細(xì)胞工廠實(shí)現(xiàn)基因克隆并表達(dá)[1]。進(jìn)入21世紀(jì)，P.pastoris在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面也有應(yīng)用[2]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)之所以如此受青睞，不僅因?yàn)槠渚哂袪I(yíng)養(yǎng)成分單一、細(xì)胞密度高、純化方法簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)錄后修飾完善等優(yōu)點(diǎn)，還與該系統(tǒng)中可供選擇的受?chē)?yán)密調(diào)控、功能各異的啟動(dòng)元件密不可分。

畢赤酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)效率很大程度上取決于啟動(dòng)元件的功能，而啟動(dòng)功能的強(qiáng)弱往往決定于它的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄條件。目前，酵母等大多數(shù)真核生物啟動(dòng)元件所共有的結(jié)構(gòu)模式已得到普遍認(rèn)可，如圖1所示[3]，包括上游啟動(dòng)子和核心啟動(dòng)子兩部分，其中位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的TATA區(qū)與原核生物Pribnow區(qū)類(lèi)似，是富含TA的保守序列[4]；TATA區(qū)的中心位置一般位于-20到-30，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定；而-40到-110區(qū)的CAAT區(qū)、GC區(qū)屬上游激活序列，主要控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率；增強(qiáng)子則能使連鎖基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加。但并不是所有真核基因的啟動(dòng)子區(qū)都包含上述所有保守序列，且不同基因轉(zhuǎn)錄條件有所差異，故不同基因來(lái)源的啟動(dòng)子在功能上參差不齊。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動(dòng)元件可分為甲醇誘導(dǎo)型和非甲醇誘導(dǎo)型兩大類(lèi)，前者包括pAOX1 （alcohol oxidase，醇氧化酶）、pAOX2、pFLD1（formaldehyde dehydrogenase，甲醛脫氫酶）等，后者以pGAP（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，3-磷酸甘油醛脫氫酶）、pYPT1（GTPase酶）為代表，還有一些新型工業(yè)酵母啟動(dòng)子也是理想的表達(dá)系統(tǒng)啟動(dòng)元件。

圖1 真核基因啟動(dòng)元件的結(jié)構(gòu)示意圖

1 甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

1.1 pAOX1和pAOX2

當(dāng)畢赤酵母以甲醇為唯一碳源時(shí)，其細(xì)胞通過(guò)特殊的甲醇利用途徑進(jìn)行生長(zhǎng)[5]，途徑中的醇氧化酶（AOX）和二羥丙酮合酶（DHAS）等關(guān)鍵酶表現(xiàn)出很高的水平。應(yīng)用最廣泛的甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pAOX正是來(lái)源于AOX基因。畢赤酵母細(xì)胞中有兩個(gè)基因能編碼合成醇氧化酶，即AOX1（大于90%）和AOX2（小于10%）。一般來(lái)說(shuō)，pAOX1啟動(dòng)子控制下的蛋白表達(dá)水平要高于pAOX2啟動(dòng)子，然而也有利用pAOX2啟動(dòng)子或截短倒位的pAOX2啟動(dòng)子來(lái)提高表達(dá)水平的成功報(bào)道[6]，另外通過(guò)添加消泡劑類(lèi)物質(zhì)如油酸，可能會(huì)提高pAOX2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平[7]。

在成功進(jìn)行了細(xì)菌、真菌、無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物（包括人）、植物、病毒等多種蛋白表達(dá)的應(yīng)用研究后，張震陽(yáng)等[8]利用pAOX1研究甘油轉(zhuǎn)運(yùn)體GT2對(duì)甘油等碳源阻遏的影響，通過(guò)同源重組的方法，敲除GT2基因，獲得的ΔGT2突變株可以一定程度上解除甘油對(duì)甲醇的代謝抑制，暗示甘油轉(zhuǎn)運(yùn)體和pAOX1的功能有關(guān)。孟祥琨[9]重點(diǎn)研究畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子介導(dǎo)下畢赤酵母中ATG周?chē)蛄袑?duì)基因表達(dá)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果說(shuō)明在ATG周?chē)迦氲男蛄惺峭ㄟ^(guò)影響了pAOX1的轉(zhuǎn)錄，使得mRNA的表達(dá)量發(fā)生了改變，從而影響蛋白質(zhì)的最終產(chǎn)量。針對(duì)pAOX控制的不同表型細(xì)胞，研究者分別在培養(yǎng)基組成、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、連續(xù)式培養(yǎng)的發(fā)酵操作策略、甲醇濃度的監(jiān)測(cè)與控制、輔助底物的添加等方面進(jìn)行研究。另一方面，以pAOX1的分子調(diào)控機(jī)理研究為切入點(diǎn)，研究者希望通過(guò)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)或調(diào)控路徑的改造，實(shí)現(xiàn)非甲醇物質(zhì)誘導(dǎo)pAOX1的起始。經(jīng)過(guò)十多年的研究，目前已有多個(gè)與甲醇誘導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、跨膜蛋白等被發(fā)現(xiàn)，為實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子功能的調(diào)控提供可能。

2005年，美國(guó)俄勒岡州的Lin-Cereghino GP等[10]最早對(duì)甲醇誘導(dǎo)利用相關(guān)因子進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)克隆得到MXR1（methanol expression regulator 1，可編碼合成甲醇代謝途徑中必要的反式作用因子Mxr1p）。當(dāng)細(xì)胞受到甲醇誘導(dǎo)時(shí)，Mxr1p由過(guò)氧化物酶體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并特異性的結(jié)合在pAOX1的5’端啟動(dòng)子序列；在MXR1基因缺失的突變體中，pAOX1無(wú)法正常起始轉(zhuǎn)錄。研究人員還對(duì)Mxr1p在pAOX1轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的可能結(jié)合部位進(jìn)行了研究。

國(guó)內(nèi)華東理工大學(xué)周祥山教授團(tuán)隊(duì)關(guān)于甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子碳源阻遏機(jī)制的研究較為系統(tǒng)和深入。2009年，宣姚吉等[11]在pAOX1啟動(dòng)子上游-638和-510之間發(fā)現(xiàn)一順式作用調(diào)節(jié)元件D區(qū)域（Region D），該區(qū)域包含反向重復(fù)序列，參與甲醇誘導(dǎo)pAOX1啟動(dòng)子的正向調(diào)節(jié)。2010年，張平[12]在P.pastoris中克隆并分析了釀酒酵母MIG（multicopy inhibitor of GAL gene expression）同源的碳源阻遏因子編碼基因PpMIG1和PpMIG2，分析結(jié)果顯示，基因編碼的蛋白質(zhì)具有典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，可以與受葡萄糖等碳源阻遏的pAOX1啟動(dòng)子結(jié)合，從而影響轉(zhuǎn)錄起始。另外，通過(guò)功能鑒定，畢赤酵母己糖運(yùn)載體編碼基因PpHXT1受糖濃度調(diào)控，不僅影響己糖運(yùn)輸，其編碼的蛋白質(zhì)還直接參與pAOX1的阻遏途徑。2011年，柏鵬[13]篩選出pAOX1葡萄糖脫阻遏畢赤酵母突變株，并依此分析出己糖感應(yīng)體基因PpHXS1的缺失，使突變體在果糖、葡萄糖或甘露糖中具有pAOX1啟動(dòng)活性的原因；正調(diào)節(jié)甲醇誘導(dǎo)pAOX1起始轉(zhuǎn)錄的PpMPP1和PpTRM1基因也得到了功能鑒定。2012年，亓飛[14]在張平的研究基礎(chǔ)之上，利用亞細(xì)胞定位技術(shù)，闡釋了碳源阻遏因子PpMIG1和PpMIG2在不同碳源環(huán)境中對(duì)pAOX1的影響，即以甲醇為碳源時(shí)，阻遏因子位于細(xì)胞質(zhì)，無(wú)阻遏現(xiàn)象；以葡萄糖為碳源，阻遏因子則轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核參與pAOX1阻遏調(diào)控。上述pAOX1調(diào)節(jié)因子 （正調(diào)控Mxr1p、PpMPP1、PpTRM1和負(fù)調(diào)控PpMIG1、PpMIG2）之間在表達(dá)水平上的關(guān)聯(lián)也得到闡釋。

1.2 pFLD1

另一類(lèi)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pFLD1受甲醇（碳源）或甲胺（氮源）誘導(dǎo)：當(dāng)用甲胺誘導(dǎo)時(shí)，葡萄糖、山梨醇或甘油可以替代甲醇作為唯一碳源；甲醇誘導(dǎo)時(shí)，則不可替換其他碳源?；谶@一特性，可以在包含雙啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)中，通過(guò)誘導(dǎo)物甲醇或甲胺的切換，達(dá)到目的基因表達(dá)的靈活控制。Duan H等[15]在pPIC9K載體上加入pFLD1啟動(dòng)子序列，重組載體上即具有pAOX1和pFLD1雙啟動(dòng)子，分別在pAOX1下游串聯(lián)GEL（gelatin，骨膠）基因、pFLD1 下游串聯(lián) GFP（green uorescent protein，綠色熒光蛋白）基因，轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115進(jìn)行后培養(yǎng)。當(dāng)用0.5%（V/V）甲醇為碳源時(shí)，重組菌在pAOX1和pFLD1的分別起始下同時(shí)表達(dá)GEL（胞外）和GFP（胞內(nèi)）；而以葡萄糖或山梨醇為碳源、甲胺為氮源時(shí)，只有GFP正常表達(dá)。為減小有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒性，甲胺的濃度以不超過(guò)0.5%（V/V）為宜。

pFLD1同時(shí)具有類(lèi)似于pAOX1的嚴(yán)密調(diào)控和轉(zhuǎn)錄效率，這些特征使pFLD1成為甲醇依賴(lài)型啟動(dòng)子的可能替代對(duì)象[6]。Zhan R等[16]在畢赤酵母中首次利用pFLD1實(shí)現(xiàn)了IFTase（Inulin fructotransferase，菊粉果糖轉(zhuǎn)移酶）的高效表達(dá)：通過(guò)四種底物的流加培養(yǎng)，高密度菌體受甲醇和甲胺鹽酸鹽共同誘導(dǎo)，IFTase活性最高為野生菌的3.2倍，達(dá) 62.72U/mL；1—1.5%（W/V）的葡萄糖或0.5—1.5%（V/V）甘油可以替代甲醇作為碳源，pFLD1使重組畢赤酵母無(wú)甲醇培養(yǎng)表達(dá)IFTase成為現(xiàn)實(shí)。

2 非甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

由于甲醇在大規(guī)模生產(chǎn)中存在安全隱患，pAOX1等甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的使用受到一定限制，為此非甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子研究隨之展開(kāi)，具體包含三類(lèi)：一是組成型啟動(dòng)子，二是甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的改造，三是新型啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)。

2.1 畢赤酵母組成型啟動(dòng)子

P.pastoris組成型啟動(dòng)子的最大優(yōu)勢(shì)是不需要甲醇誘導(dǎo)，但沒(méi)有被廣泛使用的原因之一可能是組成型表達(dá)的過(guò)量外源蛋白對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有毒性[17]。在合適的條件下，含有組成型啟動(dòng)子的重組菌可以一直在同一碳源（葡萄糖、甘油或油酸等）條件下連續(xù)培養(yǎng)，其組成型表達(dá)也可以達(dá)到很高的水平。

強(qiáng)組成型啟動(dòng)子pGAP自1997年被分離出來(lái)，已成功應(yīng)用于重組外消旋-果聚糖酶（LsdB）、羧酸酯酶（TCE）、哺乳動(dòng)物肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（hPEPT1和 rPEPT2）、β-內(nèi)酰胺酶、β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）、乙肝表面抗原（HBsAg）等多種不同外源蛋白的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)[17]。與pAOX1表達(dá)強(qiáng)度的對(duì)比研究中，pGAP與受甲醇誘導(dǎo)的pAOX1在特定蛋白的表達(dá)上各有優(yōu)勢(shì)：如pGAP在起始TCE的表達(dá)上優(yōu)于pAOX1，而pAOX1起始的GUS表達(dá)量高于pGAP[18]。另外，國(guó)內(nèi)外也有利用pAOX1和pGAP聯(lián)合作用提高外源蛋白表達(dá)量的報(bào)道[19]。在碳源的選擇上，pGAP較pAOX1更加寬泛，葡萄糖、甘油、油酸、甲醇等都可以被利用，但作用效果各異，其中甲醇的利用效果最差，葡萄糖和甘油效果最好，葡萄糖多用于搖瓶培養(yǎng)，甘油適用于大規(guī)模生產(chǎn)[20]。

大多數(shù)的啟動(dòng)子研究都以強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性為啟動(dòng)子選擇依據(jù)，但研究發(fā)現(xiàn)在某些特殊條件下強(qiáng)啟動(dòng)子的表現(xiàn)不如一些弱啟動(dòng)子，pYPT1就是這樣一類(lèi)組成型弱啟動(dòng)子，其啟動(dòng)強(qiáng)度明顯弱于pGAP，但卻更適合實(shí)現(xiàn)最佳表達(dá)，因?yàn)閺?qiáng)啟動(dòng)子帶來(lái)的過(guò)量外源表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞壓力過(guò)大[21]，所以，選擇最適強(qiáng)度的啟動(dòng)子是關(guān)鍵。秦秀林[22]采用易錯(cuò)PCR對(duì)pGAP進(jìn)行隨機(jī)突變，借助組成型表達(dá)文庫(kù)篩選的高通量方法，篩選到不同強(qiáng)度的組成型突變啟動(dòng)子，組成功能性啟動(dòng)子文庫(kù)，并分別在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白和酶活水平上加以驗(yàn)證，為S-腺苷甲硫氨酸等代謝工程途徑的優(yōu)化提供了思路。

2.2 甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的改造

目前甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的改造主要有兩種思路，一是借助組成型啟動(dòng)子的調(diào)控因子，與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子協(xié)同作用，如Takagi S等[23]通過(guò)組成型共表達(dá)pGAP的正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Prm1p，實(shí)現(xiàn)了甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的無(wú)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)；二是對(duì)pAOX1進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的調(diào)整，Hartner FS等[24]通過(guò)序列調(diào)整，使pAOX1啟動(dòng)子可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失或重復(fù)，構(gòu)建了不同啟動(dòng)子活性（6%-160%的野生型啟動(dòng)子活性）的啟動(dòng)子文庫(kù)，經(jīng)過(guò)比較找出12個(gè)與甲醇誘導(dǎo)有關(guān)的反式作用因子，其中一些pAOX1變種啟動(dòng)子由于部分調(diào)控元件的改變?cè)诩状既笔У臈l件下仍具有活性。改造后的原甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子，不僅擺脫了對(duì)誘導(dǎo)物甲醇的依賴(lài)，還在一定程度上保留了原啟動(dòng)子的活性。

2.3 畢赤酵母新啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)

畢赤酵母新型啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)研究具有多樣性，有些新啟動(dòng)子是從畢赤酵母中篩選到的新誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如Cregg J等[25]研究的來(lái)源于醇脫氫酶的新誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pADH1，不論是在以甘油為主要碳源的培養(yǎng)基中添加乙醇，還是直接以乙醇為唯一碳源，啟動(dòng)子都受到嚴(yán)格的誘導(dǎo)調(diào)控；Stadlmayr G等[26]通過(guò)對(duì)畢赤酵母轉(zhuǎn)錄水平較高的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)硫胺素合成基因啟動(dòng)子pTHI11在低特異性生長(zhǎng)速率下沒(méi)有高轉(zhuǎn)錄水平，但在添加硫胺素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)錄活性明顯提高，是新型硫胺素誘導(dǎo)啟動(dòng)子。亓飛等[27]使用RNA-Seq技術(shù)，測(cè)序了畢赤酵母的轉(zhuǎn)錄組，并從中篩選到2個(gè)新型強(qiáng)啟動(dòng)子P437和P1431，其中P437僅受甲醇誘導(dǎo)而受葡萄糖阻遏，P1431在甲醇和葡萄糖碳源中均可驅(qū)動(dòng)外源蛋白表達(dá)，并且葡萄糖對(duì)其誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。張雪[28]從畢赤酵母鼠李糖代謝途徑中挖掘了兩個(gè)鼠李糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P0075和P0341，均可有效啟動(dòng)報(bào)告基因lacB和gfp的表達(dá)。

另一部分新啟動(dòng)子是基于高轉(zhuǎn)錄水平篩選到的組成型啟動(dòng)子，如張軒薇等[29]研究的細(xì)胞壁蛋白基因啟動(dòng)子pGCW14，在南極假絲酵母脂肪酶 B（CALB）的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，pGCW14的活力高于pGAP、接近pAOX1，且具有最高的產(chǎn)酶效率；研究者還利用在線分析軟件TESS對(duì)pGCW14的可能作用元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并嘗試?yán)脝?dòng)子序列突變提高啟動(dòng)子活性。

3 新型工業(yè)酵母啟動(dòng)子

在工業(yè)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，還有一些工業(yè)酵母來(lái)源啟動(dòng)子由于其特殊性質(zhì) （如耐高溫、耐高滲），在啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)研究和應(yīng)用中也占有十分重要的位置。

3.1 耐高溫新啟動(dòng)子

耐熱酵母Pichia thermomethanolica（后命名為Ogataea thermomethanolica）可以在高溫下以甲醇為唯一碳源生長(zhǎng)[30]，2012年該酵母已成功用做P.pastoris啟動(dòng)子的表達(dá)宿主，且轉(zhuǎn)化效率很高。為提高P.thermomethanolica在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中作為外源蛋白表達(dá)宿主的能力，研究者對(duì)該酵母自身的潛在可利用啟動(dòng)子展開(kāi)研究。Harnpicharnchai P 等[30]從 P.thermomethanolica BCC16875中分離出耐高溫的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子ptGAP，該啟動(dòng)子除具有畢赤酵母pGAP的強(qiáng)組成型表達(dá)特性，還可以在高達(dá)42℃的多種碳源環(huán)境中有效起始轉(zhuǎn)錄，降低工業(yè)化生產(chǎn)的冷卻成本。Promdonkoy P等[31]還對(duì)來(lái)自于該株耐熱酵母的醇氧化酶基因啟動(dòng)子pOthAOX進(jìn)行了研究，pOthAOX是耐高溫的甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可以在最高45℃溫度下調(diào)控植酸酶的表達(dá)；且pOthAOX是唯一發(fā)現(xiàn)的、在去阻遏階段起始外源蛋白表達(dá)的AOX啟動(dòng)子。

3.2 耐高滲新啟動(dòng)子

產(chǎn)甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）是一株從自然界篩選得到的工業(yè)甘油生產(chǎn)菌株，具有耐受高滲透壓、高產(chǎn)甘油的特點(diǎn)[32]。通過(guò)對(duì)酵母高滲甘油應(yīng)答途徑（HOG途徑）的分析，多個(gè)甘油合成途徑中的關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子被克隆和分析，如pCggpd（胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因啟動(dòng)子）和pCgSTL3（H+/甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子）。丁春生[33]和劉愛(ài)玲[34]分別在釀酒酵母、煙草中分析了pCggpd受滲透壓調(diào)控的特性，劉愛(ài)玲還結(jié)合啟動(dòng)子上游存在的七個(gè)滲透壓脅迫應(yīng)答元件（STRE），設(shè)計(jì)了不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段，通過(guò)報(bào)告基因找到1000bp的最強(qiáng)調(diào)控啟動(dòng)子片段。徐丹[35]以pUC19為改造對(duì)象，利用pCggpd替換原有啟動(dòng)子，結(jié)合其18s rDNA為整合位點(diǎn)，構(gòu)建了適用于工業(yè)菌株的穿梭型整合載體pUSGZ。朱佳莉[36]篩選到受HOG途徑核心分子CgHog1調(diào)控的啟動(dòng)子 pCgSTL1、pCgSTL3、pCgZWF，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對(duì)三種啟動(dòng)子受不同滲透壓調(diào)節(jié)的啟動(dòng)強(qiáng)度進(jìn)行比較，結(jié)果顯示在一定范圍內(nèi)隨著滲透壓的變化，三種啟動(dòng)子的啟動(dòng)強(qiáng)度也隨之進(jìn)行調(diào)整，其中pCgSTL3受滲透壓調(diào)控作用最強(qiáng)。

4 結(jié)論與展望

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)一直是分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，其中核心啟動(dòng)子由于其特殊性能尤其受到關(guān)注。本文主要分三部分介紹畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動(dòng)元件，即甲醇誘導(dǎo)型、非甲醇誘導(dǎo)型和新型工業(yè)酵母啟動(dòng)子。這三類(lèi)啟動(dòng)子特征顯著，培養(yǎng)要求各異，可以滿足畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中各類(lèi)外源蛋白的表達(dá)需求。結(jié)合全面的啟動(dòng)性能分析、誘導(dǎo)機(jī)制調(diào)控和啟動(dòng)強(qiáng)度可調(diào)的新啟動(dòng)子篩選，適合畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)元件庫(kù)正逐步豐富，發(fā)現(xiàn)、掌握、改造這些酵母啟動(dòng)子的作用及應(yīng)用特點(diǎn)，可以為構(gòu)建最優(yōu)化工業(yè)酵母表達(dá)系統(tǒng)提供參考。

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RESEARCH PROGRESS OF PROMOTER ELEMENTS IN PICHIA PASTORIS EXPRESSION SYSTEM

JIANG Hui-hui
（Chaohu College， Chaohu Anhui 238000）

Pichia pastoris is one of the most common expression systems for eukaryotic cells,with the advantages of high cell density,simple purification methods,and the perfect function of post-transcriptional modification.As an important regulatory element,the function of the promoter element in the expression system is closely related to the level of expression efficiency.At present,the promoter elements commonly used in Pichia pastoris expression system are divided into three types:the methanol inducible promoter represented by pAOX,non-methanol inducible promoter like pGAP,and some new industrial yeast promoters are also ideal promoter elements.To fully understand the latest research progress of these yeast promoters could provide an important development idea for the optimization of industrial yeast expression system.

Pichia pastoris； Promoter element； Inducible promoter； Constitutive promoter

Q939.5

A

：1672-2868（2017）03-0067-06

責(zé)任編輯：李 曉

2017-04-06

蔣慧慧（1988-），女，安徽合肥人。巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，助教。研究方向：分子生物學(xué)。