張 寧，秦昆明，金俊杰，劉美輝，楊 冰，曾慶琪#（.江蘇建康職業(yè)學院藥學院，南京 009；.南京海昌中藥集團有限公司，南京 006；3.南京海源中藥飲片有限公司，南京 006）

HPLC法同時測定六神丸中9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分的含量

張 寧1＊，秦昆明2，3，金俊杰2，劉美輝1，楊 冰2，曾慶琪1#（1.江蘇建康職業(yè)學院藥學院，南京 210029；2.南京海昌中藥集團有限公司，南京 210061；3.南京海源中藥飲片有限公司，南京 210061）

目的：建立同時測定六神丸中和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為ODS-2 C18，流動相為乙腈-0.15%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為296 nm，柱溫為40℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.10～70.39 μg/mL（r＝0.999 6）、4.03～257.78 μg/mL（r＝0.999 9）、4.09～261.89 μg/mL（r＝0.999 9）、0.67～42.96 μg/mL（r＝0.999 9）、3.36～214.73 μg/mL（r＝0.999 9）、5.73～366.44 μg/mL（r＝0.999 9）、3.77～241.56 μg/mL（r＝0.999 9）、7.31～468.11 μg/mL（r＝0.999 9）、5.18～331.56 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限分別為1.10、0.85、1.02、0.34、0.84、1.43、0.94、3.66、2.59μg/mL，檢測限分別為0.27、0.21、0.51、0.17、0.42、0.72、0.47、0.91、1.30μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為96.35%～103.10%（RSD＝2.72%，n＝6）、96.76%～103.24%（RSD＝2.49%，n＝6）、97.01%～101.39%（RSD＝1.64%，n＝6）、97.32%～104.01%（RSD＝2.61%，n＝6）、95.76%～103.60%（RSD＝2.92%，n＝6）、95.07%～102.59%（RSD＝2.92%，n＝6）、95.77%～101.43%（RSD＝2.03%，n＝6）、95.11%～103.72（RSD＝3.19%，n＝6）、95.23%～103.34（RSD＝3.24%，n＝6）。結(jié)論：該方法簡便快速、準確可靠、重復性好，適用于同時測定六神丸中蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分的含量。

六神丸；蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分；含量測定；高效液相色譜法

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of gamabufotalin，arenobufagin，telocinobufagin，desacetylcinobufotalin，bufotalin，cinobufotalin，bufalin，cinobufagin and resibufogenin in Liushen pills.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on ODS-2 C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.15% phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 296 nm，and column temperature was 40℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of gamabufotalin，arenobufagin，telocinobufagin，desacetylcinobufotalin，bufotalin，cinobufotalin，bufalin，cinobufagin and resibufogenin were 1.10-70.39 μg/mL（r＝0.999 6），4.03-257.78 μg/mL（r＝0.999 9），4.09-261.89 μg/mL（r＝0.999 9），0.67-42.96 μg/mL（r＝0.999 9），3.36-214.73 μg/mL（r＝0.999 9），5.73-366.44 μg/mL（r＝0.999 9），3.77-241.56 μg/mL（r＝0.999 9），7.31-468.11 μg/mL（r＝0.999 9），5.18-331.56 μg/mL（r＝0.999 9）.The limits of quantitation were 1.10，0.85，1.02，0.34，0.84，1.43，0.94，3.66，2.59μg/mL；the limits of detection were 0.27，0.21，0.51，0.17，0.42，0.72，0.47，0.91，1.30μg/mL，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%.The recoveries were 96.35%-103.10%（RSD＝2.72%，n＝6），96.76%-103.24%（RSD＝2.49%，n＝6），97.01%-101.39%（RSD＝1.64%，n＝6），97.32%-104.01%（RSD＝2.61%，n＝6），95.76%-103.60%（RSD＝2.92%，n＝6），95.07%-102.59%（RSD＝2.92%，n＝6），95.77%-101.43%（RSD＝2.03%，n＝6），95.11%-103.72%（RSD＝3.19%，n＝6），95.23%-103.34%（RSD＝3.24%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，accurate，reliable and can be used for the determination of bufadienolide in Liushen pills.

KEYWORDSLiushen pills；Bufadienolide；Content determination；HPLC

六神丸出自《中國醫(yī)學大辭典》[1]，具有清涼解毒、消炎止痛的功效，適用于咽喉腫痛、爛喉丹痧、小兒熱癤、癰瘍疔瘡等證，屬于國家中藥保護品種。該藥由牛黃、麝香、蟾酥、冰片、雄黃和珍珠六味中藥組成[2]，其中蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufogargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B.melanostictus Schneider的干燥分泌物[3]，具有解毒、消腫、強心和止痛等功效，其活性成分蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分具有升壓、興奮呼吸系統(tǒng)、抗腫瘤及顯著的洋地黃樣作用[4-6]，此外還具有一定的攻毒抗癌作用，可用于腸癌、肝癌、白血病、皮膚癌等的治療[7-8]；但是，蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分還具有一定心臟毒性，可導致心功能障礙、引發(fā)心律失常等[9-10]。目前，該制劑收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑（第十八冊）》（標準編號：WS3-B-3374-98），該標準中只有牛黃中膽酸的含量測定項，且現(xiàn)有報道也只測定了單個或者兩個蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分的含量[11-13]。鑒于此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定六神丸中9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分（和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基）含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括在線脫氣機、自動進樣器Prominence SIL-20A、2998紫外可見光檢測器和柱溫箱（美國Waters公司）；Anke TGL-16C型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；FA1204B型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；XPE56型微量電子天平（美國Mettler-Toledo公司）；Milli-Q Synthesis 108型超純水儀（美國Millipore公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：200 W，功率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

六神丸（雷允上藥業(yè)有限公司，批號：NA18003A、NA18008B、NA18018A、NA18021B、OA18019A、OA1000 5B、OA18025B、OA18009C、OA18004B、LA18012C，規(guī)格：10粒/支）；和蟾蜍他靈對照品（批號：465-11-2）、沙蟾毒精對照品（批號：464-74-4）、遠華蟾毒精對照品（批號：472-26-4）、去乙酰華蟾毒它靈對照品（批號：4099-30-3）、華蟾毒它靈對照品（批號：1108-68-5）、蟾毒靈對照品（批號：11981-201501）均購自寶雞辰光生物科技有限公司，純度均＞98.0%；蟾毒它靈對照品（批號：110703-201305）、華蟾酥毒基對照品（批號：110803-201406）、酯蟾毒配基對照品（批號：110718-201108）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98.0%；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ODS-2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.15%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，20%→25%A；15～25 min，25%→40%A；25～35 min，40%A；35～37 min，40%→55%A；37～45 min，55% A；45～47 min，55%→100%A；47～52 min，100%A；52～54 min，100%→20%A；54～55 min，20%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：296 nm；柱溫：40℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取和蟾蜍他靈對照品7.039 mg、沙蟾毒精對照品25.778 mg、遠華蟾毒精對照品26.189 mg、去乙酰華蟾毒它靈對照品4.296 mg、蟾毒它靈對照品21.473 mg、華蟾毒它靈對照品36.644 mg、蟾毒靈對照品24.156 mg、華蟾酥毒基對照品36.644 mg、酯蟾毒配基對照品33.156 mg，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成和蟾蜍他靈質(zhì)量濃度為70.39 μg/mL、沙蟾毒精質(zhì)量濃度為257.78 μg/mL、遠華蟾毒精質(zhì)量濃度為261.89 μg/mL、去乙酰華蟾毒它靈質(zhì)量濃度為42.96 μg/mL、蟾毒它靈質(zhì)量濃度為214.73 μg/mL、華蟾毒它靈質(zhì)量濃度為366.44 μg/mL、蟾毒靈質(zhì)量濃度為241.56 μg/mL、華蟾酥毒基質(zhì)量濃度為366.44 μg/mL、酯蟾毒配基質(zhì)量濃度為331.56 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研磨粉碎后過200目篩，取粉末約0.2 g，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取60 min，放冷至室溫，加甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，以半徑5 cm、3 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以蟾毒靈峰計為3 000，和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基的保留時間分別為17.270、23.180、29.533、30.131、31.063、32.890、38.888、41.989、42.483 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液0.15、0.31、0.62、1.25、2.5、5 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD，詳見表2。

表2 LOQ與LOD測定結(jié)果（μg/mL）Tab 2 Determination results of LOQ and LOD（μg/ mL）

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積的RSD分別為1.36%、1.25%、1.44%、1.07%、1.08%、1.21%、1.20%、1.16%、1.11%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：NA18003A）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積的RSD分別為1.70%、1.60%、1.80%、2.37%、1.83%、1.87%、1.93%、1.71%、1.75%（n＝8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：NA18003A）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積的RSD分別為2.06%、 2.28%、2.47%、2.09%、2.44%、2.36%、2.47%、2.45%、2.45%（n＝6），表明本試驗重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品（批號：NA18003A）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測定

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

續(xù)表3Continued tab 3

取10批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Determination result of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 樣品提取方法和提取時間的選擇

筆者考察了不同的提取方法（超聲提取、回流提?。?、提取溶劑（甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、乙醇）和提取時間（30、60、90、120 min）對提取效果的影響。結(jié)果，以甲醇為提取溶劑，超聲提取60 min，蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分提取率最高。

3.2 流動相的選擇

筆者考察了不同的流動相體系——甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.15%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液對色譜圖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相時基線不平、峰形較差；以乙腈-0.15%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液為流動相時，色譜峰形較好，但從維護色譜柱的角度考慮，最終選用乙腈-0.15%磷酸溶液為流動相。

3.3 柱溫的考察

筆者考察了不同的柱溫（35、40℃）對色譜圖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫為35℃時待測成分的出峰時間較晚；而柱溫為40℃時，待測成分出峰時間適宜，峰形及分離度均較好，故最終選擇40℃為本試驗的柱溫。

3.4 結(jié)果分析

蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分作為六神丸發(fā)揮藥效的重要組成部分，并未成為六神丸的質(zhì)量控制指標成分。從樣品測定結(jié)果看，10批六神丸中9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分差異較大。為實現(xiàn)對六神丸質(zhì)量的控制，保證六神丸的安全有效，亟需建立以蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分為質(zhì)量控制指標之一的六神丸質(zhì)量標準。

綜上所述，本方法簡便快速、準確可靠、重復性好，適用于同時測定六神丸中蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分的含量。

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（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of 9 Components of Bufadienolide in Liushen Pills by HPLC

ZHANG Ning1，QIN Kunming2，3，JIN Junjie2，LIU Meihui1，YANG Bing2，ZENG Qingqi1（1.School of Pharmacy，Jiangsu Jiankang Vocational College，Nanjing 210029，China；2.Nanjing Haichang TCM Corporation，Co.，Ltd. Nanjing 210061，China；3.Nanjing Haiyuan TCM Decoction Piece Co.，Ltd.，Nanjing 210061，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）21-3000-04

2017-04-17

2017-05-09）

＊講師，碩士。研究方向：025-68172734。E-mail：zhangning198410@163.com

#通信作者：教授，博士生導師。研究方向：中醫(yī)臨床。電話：025-68172734。E-mail：zengqq111@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.34