蔡 暢 趙燕娜 劉 敏

(聊城大學生物制藥研究院,山東聊城252059)

不同藥載比的紫杉醇白蛋白納米粒的制備及釋藥性能研究①

蔡 暢 趙燕娜 劉 敏

(聊城大學生物制藥研究院,山東聊城252059)

紫杉醇作為治療癌癥的有效藥物具有很強的抗癌效果和廣譜治療范圍.紫杉醇白蛋白納米?？商岣咂淙芙舛群蜕锢寐?本文采用注入法制備不同藥載比(紫杉醇/牛血清白蛋白)的紫杉醇白蛋白納米粒，考察了其粒徑及釋藥性能.以藥載比為9∶1制備的納米粒的粒徑最小，顆粒最均勻并且其釋放速率最慢，有較好的緩釋效果.考察藥載比為9∶1制備的納米粒的穩(wěn)定性及載藥量.放置一周后其粒徑?jīng)]有太大變化判斷其穩(wěn)定，計算載藥量為11.45%.

紫杉醇，牛血清白蛋白，納米粒，藥載比，藥物釋放，穩(wěn)定性

0 引言

紫杉醇(paclitaxel，PTX，圖1A)作為阿霉素之后最熱點新型的抗癌藥之一，在腫瘤相關治療領域中具有重要的意義.紫杉醇是由太平洋紫杉等紅豆杉屬植物中提取的一種抗癌作用優(yōu)良的二萜類化合物.紫杉醇的抗癌機制是通過促進極為穩(wěn)定的微管聚集的同時阻斷微管正常生理性的解聚(在細胞分裂周期中的G2和M兩個期)，從而導致細胞死亡，達到阻礙腫瘤生長的目的.目前廣泛應用于非小細胞性腫瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等.然而，紫杉醇在水中的溶解度極低(0.77 μmol/L左右)，因此不能直接作為臨床藥物應用于癌癥的治療[1-5].

在當前國產(chǎn)和進口的紫杉醇注射劑中都是以乙醇和聚氧乙烯蓖麻油作為助溶的載體，聚氧乙烯蓖麻油會導致出現(xiàn)極為嚴重的超敏反應現(xiàn)象[3].因此，能夠研制出副作用相對小的紫杉醇制劑已迫在眉睫.高分子納米粒子作為藥物載體可以彌補傳統(tǒng)藥物制劑中的缺陷與不足.目前在國內臨床研究方面，我國所研發(fā)的紫杉醇脂質體已開始在臨床上應用，并且顯示出了良好的應用前景.紫杉醇-白蛋白納米混懸劑是用人血白蛋白來包裹紫杉醇所形成的納米粒，可以將紫杉醇穩(wěn)定的分散于水溶液之中，減少了所帶來的副作用.由于納米粒的粒徑極小所以具有被動的靶向性，在腫瘤細胞上存在著特殊的載體能夠主動攝取白蛋白，顯示了白蛋白納米粒技術所具有的優(yōu)越性[6].但是作為載體的人血白蛋白資源稀缺、價格較高，并且專利費昂貴，從而造成醫(yī)療成本很高[7].

牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA，圖1B)也具有包裹紫杉醇的能力[7]，紫杉醇-白蛋白納米混懸劑是由牛血清白蛋白包裹了紫杉醇形成的納米粒，使紫杉醇能夠穩(wěn)定的分散于水溶液中，從而避免了表面活性劑所帶來的副作用，并提高抗腫瘤活性.然而目前國內還沒有白蛋白納米粒藥物上市，主要的原因是對紫杉醇和白蛋白之間的相互作用、制備工藝及影響因素的科學研究還不成熟，前期納米藥物的開發(fā)經(jīng)驗不豐富.在諸多影響因素中，紫杉醇/白蛋白摩爾比會對納米顆粒的粒徑、釋放性能和穩(wěn)定性等有重要影響.因此，本文通過注入法制備不同摩爾比的紫杉醇白蛋白納米粒，測定不同摩爾比紫杉醇白蛋白納米粒的粒徑，并通過繪制紫杉醇紫外標準曲線確定不同摩爾比紫杉醇白蛋白納米粒的體外釋放，從所測粒徑結果和釋放結果分析合適摩爾比.最后考察了9∶1摩爾比紫杉醇白蛋白納米粒的穩(wěn)定性.所得結果將為開發(fā)紫杉醇白蛋白納米粒產(chǎn)品提供重要理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

電子天平(METTLER TOLEDO AL204梅特勒-托利多儀器有限公司，上海，中國，測量精度為±0.01 mg)；Benchtop pro 31冷凍干燥機(VirTis公司，美國)；Zetasizernano ZS 型粒度儀/電位儀(Malvern Instruments公司，英國)；SHA-B水浴恒溫振蕩器(金壇國旺實驗儀器廠，常州，中國)；78HW(1型恒溫磁力攪拌(泰斯特儀器有限公司有限公司，天津，中國)；D-3L型高壓均質機(Ph-Tech公司，美國)

圖1 紫杉醇(A)與牛血清白蛋白(B)的結構

1.2 實驗試劑

磷酸二氫鈉(ACS級試劑，北京百靈威科技有限公司)；磷酸氫鈉(分析純AR，純度(≥99%，ACROS Organics)；十二烷基硫酸鈉(分析純AR，天津科密歐化學試劑有限公司)；丙酮(純度(≥99.7%，分析純AR，天津科密歐化學試劑有限公司)；甲醇(純度(≥99.7%，分析純AR，天津科密歐化學試劑有限公司)；紫杉醇(購于阿拉丁有限公司)：牛血清白蛋白(分子量=68 000，購于中國北京百靈威有限公司)；實驗室溶劑配置用水均為三次去離子水.

1.3實驗步驟

1.3.1 紫杉醇紫外標準曲線的繪制.用分析天平準確稱取紫杉醇適量，加甲醇溶解，配制成75 μg/mL紫杉醇儲備液.分別準確吸取一定量的紫杉醇儲備液于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋到刻度.配制成濃度為0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、 5 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL的紫杉醇溶液.對25 μg/mL的紫杉醇溶液，用紫外掃一個全波長.將配好的溶液按低濃度到高濃度依次在最大吸收波長處測量紫外吸收，記錄227 nm下的吸收度(227 nm為最大吸收波長)，將其濃度和吸光度進行回歸，得到標準曲線.

1.3.2 不同摩爾比紫杉醇白蛋白納米粒的制備及粒徑測定.采用注入法制備紫杉醇白蛋白納米粒[8,9].5 mg紫杉醇溶于1 mL丙酮，取一定量白蛋白溶于10 mL水，藥載比(藥物/白蛋白摩爾比)設為7∶1，9∶1及11∶1，攪拌條件下將紫杉醇丙酮溶液逐滴加入白蛋白水溶液中，繼續(xù)攪拌5 min后，旋蒸除去丙酮，加水定容至10 mL后，高壓均質即得紫杉醇/白蛋白納米粒(PTX/BSA NPs)溶液.馬爾文粒度儀測定其粒徑，采用 4 mW He-Ne激光器，波長633 nm，散射角為173°.

1.3.3 不同摩爾比紫杉醇白蛋白納米粒的體外釋放.用移液槍分別吸取上述納米粒溶液2 mL置于透析袋(MW=8 000-14 000)中，釋放外液選擇pH=7.4的PBS(含0.5% SDS)，每隔一定時間取樣3 mL，并補同等體積空白釋放外液，吸取出來樣品在227 nm處測得紫外的吸光度，將吸光度代入紫杉醇標準曲線中得到藥物濃度.然后計算釋放的百分比，并且繪制出釋放曲線.

1.3.4 9:1摩爾比紫杉醇白蛋白納米粒的穩(wěn)定性考察及載藥量的測定.取9:1摩爾比的紫杉醇白蛋白納米粒在4℃的冰箱中避光放置一周后，用馬爾文粒度儀測量粒徑確定穩(wěn)定性.將2 mL納米粒溶液凍干后，重溶于1 mL有機溶劑中(甲醇)，渦旋1 min，使蛋白變性沉淀，10 000 rpm離心10 min棄去蛋白沉淀，上清液用甲醇適當稀釋后，在波長為227 nm下進行紫外吸光度的測量，得到藥物濃度，按以下公式計算載藥量

其中W1為凍干納米粒中的藥物質量，W2為凍干納米粒的總質量.

2 結果與討論

2.1 紫杉醇紫外標準曲線的測量結果

圖2 紫杉醇紫外標準曲線

由紫杉醇的紫外全波長掃描圖可知，其最大吸光度對應的波長為227 nm.

以紫杉醇濃度為橫坐標，波長227 nm處的吸光度為縱坐標，得到線性回歸方程：Y=0.036 9X+0.00 08R2=0.999 8，在0.5-25 μg/mL的濃度范圍內擬合性良好，得到紫杉醇的標準曲線如圖2所示.

2.2 紫杉醇白蛋白納米粒制備工藝的確立

納米顆粒的大小直接影響藥物的釋放、生物利用度、載藥量與靶向性等，是衡量納米制劑質量的重要指標.影響粒徑和分布的因素包括處方配比、制備工藝和分散設備等.許多研究表明高壓均質機制備的納米顆粒粒徑較小，且粒度分布均勻和穩(wěn)定性好[10,11].為考察高壓均質次數(shù)對紫杉醇白蛋白納米粒粒徑的影響，制備摩爾比9∶1的紫杉醇白蛋白納米粒并進行高壓均質.

由于高壓均質時間過長會導致樣品溫度升高，所以每次高壓均質的時間控制為1.5 min.接下來通過每高壓均質一次測一次粒徑的方法確定高壓均質的次數(shù).其粒徑分布的變化情況如圖3-圖6所示

圖3 摩爾比9∶1未均質時的粒徑及其分布

圖4 摩爾比9∶1均質一次時的粒徑及其分布

由圖3-圖6可以看出，高壓均質三次時的粒徑范圍在10-200 nm且分布均勻，故確定高壓均質的次數(shù)為3次.

2.3 紫杉醇/白蛋白納米粒(PTX/BSA NPs)的粒徑及其分布

目前測量納米顆粒尺寸的儀器主要有透射電鏡、X射線衍射儀、激光粒度儀等，其中激光粒度儀不僅可以測得粒徑大小，還可以給出粒徑分布[12,13].不同藥載比的紫杉醇/白蛋白納米粒(PTX/BSA NPs)粒徑、PDI值見表1，粒徑分布見圖7-圖9.

圖5 摩爾比9∶1均質二次時的粒徑及其分布

圖6 摩爾比9∶1均質三次時的粒徑及其分布

圖7 藥載比7∶1 PTX/BSA NPs的粒徑分布圖

圖8 藥載比9∶1 PTX/BSA NPs的粒徑分布圖

圖9 藥載比11∶1 PTX/BSA NPs的粒徑分布圖

圖10 紫杉醇/白蛋白納米粒(PTX/BSA NPs )的釋放曲線

表1 不同藥載比的PTX/BSA NPs的粒徑及PDI值

PTX/BSA藥載比Size/nmPDI7∶1169.1±2.00.175±0.0119∶1144.6±1.50.200±0.00911∶1158.8±2.20.209±0.014

從所測粒徑結果可以看出，不同藥載比的紫杉醇/白蛋白納米粒(PTX/BSA NPs)的粒徑有所差異(7∶1與9∶1組間P值=0.001；11∶1與9∶1組間P值=0.000，均小于0.01，差異顯著)，不難發(fā)現(xiàn)藥載比為9∶1制備的紫杉醇白蛋白納米粒的粒徑是最小的，且從粒徑分布圖上看，藥載比從7∶1增加至11∶1的過程中，小部分納米粒開始聚集，逐漸形成大顆粒(圖中箭頭所示).

2.4 紫杉醇/白蛋白納米粒(PTX/BSA NPs)的釋放曲線

紫杉醇/白蛋白納米粒(PTX/BSA NPs)的釋放曲線如圖10所示.

從釋放結果可以看出，不同藥載比的紫杉醇/白蛋白納米粒(PTX/BSA NPs)的釋放稍有差異(7∶1與9∶1在24 h釋放度組間P值=0.004；11∶1與9∶1組間P值=0.406，前者小于0.05，差異顯著)(7∶1與9∶1在72 h釋放度組間P值=0.003；11∶1與9∶1組間P值=0.021，均小于0.05，差異顯著)，以9∶1制備的納米粒釋放速率最慢，有較好的緩釋效果.

2.5 9∶1摩爾比紫杉醇白蛋白納米粒的穩(wěn)定性及載藥量

圖11 摩爾比9∶1放置一周的粒徑及其分布

將樣品在4℃冰箱中放置在一周驗證其穩(wěn)定性.放置一周的粒徑圖如圖11所示.

由上圖可知放置一周的NPs粒徑幾乎沒有改變，并且分布均勻.所以制備的NPs在放置一周后粒徑不發(fā)生改變，穩(wěn)定性較好.

制備的納米顆粒中紫杉醇的載藥量為紫杉醇質量與納米顆粒質量之比，經(jīng)計算，載藥量為11.45%.

3 結論

本文通過紫外可見光譜確定紫杉醇的最大吸收波長為227 nm，從所測粒徑結果可以看出，不同藥載比的紫杉醇/白蛋白納米粒(PTX/BSA NPs)的粒徑有所差異，按照9∶1摩爾比制備的納米粒的粒徑最小，藥載比從7∶1增加至11∶1的過程中，小部分納米粒開始聚集，逐漸形成大顆粒.從釋放結果可以看出，不同藥載比紫杉醇/白蛋白納米(PTX/BSA NPs)的釋放稍有差異，9∶1制備的納米粒釋放速率最慢.紫杉醇/白蛋白摩爾比9∶1制備的PTX/BSA NPs在粒徑及釋放行為上均顯示出了稍許優(yōu)勢.以9∶1制備的納米粒載藥量為11.45%，且放置一周后粒徑不發(fā)生改變，證明穩(wěn)定性較好.

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The Study on the Preparation and Drug Release Properties of Paclitaxel Albumin Nanoparticles with Different Drug/Carrier Ratio

CAI Chang ZHAO Yan-na LIU Min

(Institute of Bio Pharmaceutical Research,Liaocheng University,Liaocheng 252059,China)

Paclitaxel, an effective drug for the treatment of cancer, has a strong anti-cancer effect and broad-spectrum treatment. Paclitaxel albumin nanoparticles can increase their solubility and bioavailability. In this paper, paclitaxel albumin nanoparticles with different drug / carrier ratio (paclitaxel / bovine serum albumin) were preparedby Injection method.The particle size and drug release properties of the prepared paclitaxel nanoparticles were investigated.The nanoparticles prepared with paclitaxel / bovine serum albumin ratio of 9∶1 had the smallest and most uniform particle size, as well as the slowest release rate, which indicated that the resulting nanoparticle had better sustained release effect.After being placed for one week, the particle size of the nanoparticle did not change significantly, which indicated that the particle was stable. The drug loading was calculated to be 11.45%.

paclitaxel，bovine serum albumin，nanoparticles，drug/carrier ratio，drug release，stability

2017-02-26

國家自然科學基金項目(21473085)；山東省重點科研開發(fā)項目(2015GGB01567)資助

劉敏，E-mail:liumin2@lcu.edu.cn.

R943

A

1672-6634(2017)02-0050-06