李玲玉 方 健 于 淼 陳天圣

(華中農業(yè)大學水產(chǎn)學院, 農業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070)

青鳉prdm14的原核表達、多克隆抗體制備及其應用

李玲玉 方 健 于 淼 陳天圣

(華中農業(yè)大學水產(chǎn)學院, 農業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070)

青鳉(Oryzias latipes)是研究遺傳發(fā)育和細胞多能性的重要模式魚類, 為探究prdm14同源基因的潛在作用, 實驗將青鳉prmd14經(jīng)原核表達后制備了兔抗Prdm14多克隆抗體。首先, 將prdm14基因的部分編碼區(qū)連接到pET32a質粒中, 構建重組表達載體pET32a-prdm14?600。隨后將重組載體轉化至大腸桿菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3), 經(jīng)異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)誘導表達, 獲得分子量為60 kD的Prdm14重組蛋白。接著大量誘導蛋白表達并切膠純化, 免疫家兔(Oryctolagus cuniculus), 6周后獲得陽性抗體, 最后通過ELISA和Western blot檢測抗體效價及其特異性。結果顯示, 在37℃、0.6 mmol/L IPTG、誘導3h的條件下, 可獲得Prdm14重組蛋白的高效表達; 制備的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗體能夠特異性識別青鳉組織中表達的Prdm14蛋白以及在HepG2細胞中過表達的青鳉Prdm14: EGFP融合蛋白。綜上所述, 研究首次制備了一種能有效識別青鳉Prdm14的多克隆抗體, 該抗體的獲得為后續(xù)研究prdm14基因在魚類多能性干細胞中的作用提供了有力工具。

青鳉; Prdm14; 原核表達; 多克隆抗體; 干細胞

細胞的多能性調控和分化的分子機制是干細胞生物學領域的一個重要問題。研究表明PRDM家族成員參與了細胞早期的分化, 它們能通過組蛋白酶的激活或者相互作用來調控目的基因的表達, 從而參與轉錄調節(jié)和染色體的表觀修飾過程[1,2]。作為PRDM家族中重要的一員, PRDM14包含一個PR/SET結構域和6個鋅指結構。人類PRDM14在胚胎干細胞中表達, 能直接靶向干細胞因子OCT4的近端增強子從而調控OCT4的表達, 同時能與干細胞中一些關鍵的轉錄因子OCT4、NANOG、SOX2、KLF4等結合, 激活細胞多能性基因同時抑制細胞分化標志基因的表達, 是干細胞調控網(wǎng)絡的核心因子, 在胚胎干細胞多能性狀態(tài)的維持, 體細胞潛在全能性的重新獲得及表觀遺傳學重編程中具有重要作用[3—6]。在小鼠中, prdm14在胚胎干細胞中具有相似的功能[7,8], 同時它也在原始生殖細胞中表達并對生殖細胞的特化和發(fā)育有至關重要的影響[9], 實驗表明prdm14缺失小鼠雌性和雄性均不育[10,11]。PRDM14也是一個重要的原癌基因, 在許多癌細胞中高度表達, 能促進腫瘤細胞的生長并降低其對化療藥物的敏感性[12—14], 對細胞的生長和分化也具有重要的作用[15]。

作為一個新近才被發(fā)掘的基因, 相對于小鼠和人prdm14的諸多研究, 其他物種的同源基因被鑒定的較少, 目前魚類中僅斑馬魚(Danio rerio)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)的同源基因有過報道[16,17]。序列分析表明prdm14基因在結構域的區(qū)段具有較高的保守性, 斑馬魚和牙鲆prdm14的結構域和小鼠的同源性均可達到68%[16,17]。但是目前對魚類prdm14同源基因的研究數(shù)據(jù)有限, 它是否具有干細胞多能性的維持和生殖細胞的特化等功能還有待深入研究。

模式魚類青鳉(Oryzias latipes)具有生殖周期短, 易室內飼養(yǎng), 胚胎發(fā)育過程易觀察, 遺傳背景多樣, 基因組信息完善等優(yōu)點[18], 是研究基因功能及魚類遺傳育種的重要材料[19—21]。目前青鳉的胚胎干細胞[22]、單倍體干細胞[23]、生殖干細胞[24]均已獲得, 它是除小鼠之外研究干細胞和生殖細胞調控機制的理想模式生物。由于在高等動物中prdm14是干細胞多能性網(wǎng)絡的一個重要調控因子, 因此青鳉的prdm14基因也可能參與了細胞多能性的調控和生殖細胞的特化等過程, 這有待進一步的分析和驗證。前期我們已經(jīng)鑒定了青鳉的prdm14基因(結果另文發(fā)表), 本實驗制備了特異性的兔抗青鳉源Prdm14多克隆抗體, 該抗體能有效地檢測內源的和過表達的青鳉Prdm14蛋白。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌DH5α、Rosetta(DE3)購自北京全式金生物技術有限公司; 質粒pIRES-DsRed、pET32a、pCAG-EGFP均由本實驗室構建或保存; 野生型青鳉從中國科學院水生生物研究所獲得; 人肝癌細胞系HepG2由本實驗室保存。

1.2 Prdm14原核表達載體的構建與鑒定

根據(jù)Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫中青鳉prdm14基因的序列(ENSORLG 00000008105)設計引物F1(5′-AAAGAATTCATGT GGCTGTCCCTCTCCTGCTC-3′)和R1582(5′-AAACCGCGGTTAATTCCAGGGTCGATATT CAGAATT-3′), 以青鳉卵巢的cDNA為模板通過PCR擴增得到prdm14全長編碼序列(1761 bp), 并構建真核表達載體pPrdm14-IRES。將pET32a載體及pPrdm14-IRES質粒分別取1 μg用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ (NEB, 美國)雙酶切, 所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切取prdm14目的片段以及pET32a骨架質粒進行膠回收, 再用T4 DNA連接酶(NEB, 美國)進行連接。將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α, 挑取克隆后用Omega (美國)質粒提取試劑盒提質粒, 并用HindⅢ、NotⅠ和EcoRⅤ, PmlⅠ和EcoRⅠ分別酶切鑒定。經(jīng)驗證的pET32a-prdm14質粒取1 μg, 酶切去除兩個SacⅠ位點之間的600 bp序列, 切膠回收剩余片段, 再通過DNA連接酶環(huán)化,得到包含部分prdm14 CDS (1161 bp)的原核表達載體pET32a-prdm14?600。最后用擴增CDS全長的引物F1和R1582以1 ng質粒為模板進行PCR驗證, 反應條件為: 94℃預變性5min; 94℃變性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸2min, 30個循環(huán); 72℃ 10min。

1.3 誘導Prdm14原核表達

將pET32a-prdm14及pET32a-prdm14?600質粒分別轉入Rosetta (DE3)菌中, 涂含Amp (100 μg/mL)的抗性平板, 挑取單克隆至3 mL LB培養(yǎng)液, 于37℃下200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12h, 再按1‰、2‰、3‰、5‰、7‰和10‰體積分別轉入含有2 mL LB培養(yǎng)液的搖菌管中, 37℃培養(yǎng)2h后加入0.6 mmol/L異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)誘導, 同時以未誘導組及轉入pET32a空載體組為對照。誘導3h后取1 mL菌液離心沉淀, 加入80 μL Tris-EDTA以及20 μL SDS蛋白上樣緩沖液煮沸10min, 1000 r/min離心5min后取上清進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE, 康為世紀), 最后用考馬斯亮藍染色并觀察菌體蛋白表達情況。

1.4 融合蛋白純化及抗體制備

將Prdm14融合蛋白條帶從膠上切下, 放入液氮中充分研磨, 加入等體積的PBS緩沖液混勻至乳膠狀態(tài)。取1只家兔, 腹部多點皮下注射抗原200 μg。每隔2周時間, 按照以上步驟進行加強免疫注射, 共免疫注射3次; 另取1只家兔不做任何處理, 作為陰性對照。第3次免疫后7d, 對家兔進行頸動脈采血。將離心管中的血液室溫靜置2h后, 再置4℃冰箱內過夜。待血液凝固血塊收縮后, 2500 r/min離心30min, 取上清分裝于干凈的離心管中, –20℃保存, 同時取部分抗血清經(jīng)抗原親和純化抗體, 再經(jīng)ELISA檢測抗體效價。實驗中抗體的免疫制備過程由上海佑隆生物有限公司完成。

1.5 Prdm14: EGFP融合表達載體構建及鑒定

為進一步驗證抗體的特異性, 我們構建了融合EGFP的表達系統(tǒng)。設計引物fusion-F (5′-CATC ATTTTGGCAAAGAATTCATGTCGGTGTC CCTCTCCTG-3′)、fusion-R (5′-GCTCACCATGG TGGCGAATTCATTCCAGGGTCGATATTCAG-3′), 去除prdm14基因的TAA終止密碼子以便將基因閱讀框融合到EGFP蛋白中, 并在連接處各設計1個EcoRⅠ酶切位點。以pPrdm14-IRES質粒為模板擴增prdm14 基因CDS, 同時將pCAG-EGFP載體用EcoRⅠ酶切, PCR產(chǎn)物及線性化質粒通過1%瓊脂糖凝膠電泳、切膠回收后用一步法In-Fusion PCR擴增試劑盒(Vazyme, 南京)融合, 構建Prdm14: EGFP融合表達載體, 最后再用EcoRⅠ單酶切鑒定。將鑒定正確的質粒擴大培養(yǎng)后, 大量提取質粒以備后用。

1.6 細胞培養(yǎng)及轉染

將HepG2細胞按1×106個/孔接種于六孔板中,培養(yǎng)條件: DMEM(Hyclone, 美國)培養(yǎng)液, 含10%已滅活胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, 四季青, 杭州)及100 kU/L青霉素和100 kU/L鏈霉素; 37℃, 5%CO2。培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)液為不含血清的DMEM以提高轉染效率, 然后用LipofectamineTM2000(Invitrogen, 美國)轉染試劑進行轉染, 每孔加入6 μL轉染試劑及2 μg去除內毒素的pCAG-prdm14EGFP質粒, 對照組加入pCAG-EGFP空載體; 處理3h后, 再次更換培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,將細胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng); 48h后在倒置熒光顯微鏡(Ti-S, Nikon)下觀察并拍照。

1.7 動物組織及細胞總蛋白提取

分別取性成熟青鳉精巢(Testis)、卵巢(Ovary)、腦(Brain)組織各0.5 g, 以及上述轉染后2種細胞各1×107個, 用動物組織或細胞蛋白提取試劑盒(生工,上海)提取總蛋白, 經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀, 北京)測定蛋白濃度, 最后加入1/4體積SDS上樣緩沖液, 煮沸10min, 于1000 r/min離心5min, 取上清液置–20℃保存待用。

1.8 Western blot檢測

將菌體蛋白或組織及細胞蛋白經(jīng)10% SDSPAGE電泳后, 置半干電轉儀(Bio-Red, 美國)中18 V電壓轉膜25min, 5%脫脂奶粉封閉過夜; 再加入制備的兔多抗αPrdm14 (1鯰1000)或其他一抗(αHis, 1鯰1500; αβ-Actin, 1鯰1200; αGFP, 1鯰1000, Vazyme)置3D搖床上孵育2h (室溫)或4℃過夜; 用Tris-HCl吐溫緩沖溶液(TBS+0.1% Tween, TBST)洗膜6次, 每次10min; 隨后用辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)標記的羊抗兔二抗(1鯰10000)或鼠二抗(1鯰10000)室溫孵育1h; 再經(jīng)TBST洗膜3次, 每次10min; 最后用ECL發(fā)光試劑盒(Thermo, 美國)顯色并用GE化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)成像觀察。

2 結果

2.1 原核重組載體構建

如圖 1A所示。通過酶切pPrdm14-IRES質粒得到含prdm14全長編碼序列(1761 bp)的片段, 并將該片段插入pET-32a載體(圖 1B), 構建重組載體pET32a-prdm14。質粒分別經(jīng)HindⅢ、NotⅠ和EcoRⅤ, PmlⅠ和EcoRⅠ酶切, 分別得到預期大小的片段。構建的載體經(jīng)測序分析, 確認插入片段序列無移碼突變。大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最為常用的外源蛋白表達系統(tǒng), 但是在實踐過程中外源重組蛋白極易形成沒有生物活性的包涵體[25], 而且復雜的mRNA二級結構會導致重組蛋白表達效率降低, 因此本實驗同時構建了一個相對較短的重組蛋白載體pET32a-prdm14?600, 以獲得足量高純度的目的蛋白, 該重組蛋白包含Prdm14的N端及PR結構域, 并能翻譯386個氨基酸殘基。進一步的實驗證實了pET32a-prdm14和pET32a-prdm14?600質粒構建成功。重組載體結構如圖 1B所示, pET32a-prdm14載體包含prdm14 CDS全長, 含8個外顯子共1761 bp; pET32a-prdm14?600載體中刪除了prdm14 CDS第4個外顯子后部至第7個外顯子之間的600 bp。

2.2 誘導重組蛋白表達、純化及抗體制備

圖 1 prdm14基因原核表達載體構建示意圖Fig.1 Construction of prdm14 prokaryotic expression vector

轉入pET32a-prdm14載體的細菌在IPTG誘導后, 經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯現(xiàn)1條83 kD的特異性條帶, 轉入pET32a-prdm14?600載體的細菌則誘導出1條約60 kD的條帶, 均與預期目的條帶大小一致。同時, 未加IPTG誘導的菌和空載體對照組沒有出現(xiàn)相應的條帶。因此, 確認Prdm14融合蛋白在Rosetta (DE3)中正確表達。不同接種濃度的誘導結果均顯示表達Prdm14全長的菌體產(chǎn)生融合蛋白的量明顯比短片段的低, 且按5‰比例接種時表達量最高。大量誘導Prdm14?600重組蛋白后切膠純化, 共得到5 mg純化蛋白, 純度>95 %, 滿足后續(xù)實驗要求。

免疫家兔6周后獲得多克隆抗體, 經(jīng)ELISA檢測效價為1鯰243000, 陽性判定點為OD陽/OD陰>2.5。

2.3 多克隆抗體特異性檢測

以轉入pET32a載體的細菌為空白對照, αHis (1鯰1500)為陽性對照, Western blot結果顯示, 青鳉Prdm14多克隆抗體(1鯰1000)能夠特異性識別Prdm14及Prdm14?600重組蛋白(圖 2A)。對表達Prdm14?600重組蛋白的細菌裂解物進行10、100、1000和10000倍稀釋, 經(jīng)Western blot檢測, 結果表明在1鯰1000稀釋的抗體條件下, 該多克隆抗體可識別1000倍稀釋的Prdm14?600重組蛋白(圖 2B)。此外,青鳉精巢、卵巢、腦蛋白樣品的Western blot檢測結果均顯示單一的64 kD條帶, 與青鳉內源的Prdm14蛋白大小一致, 而且采用免疫前血清作為一抗時未出現(xiàn)任何條帶(圖 2C)。以上結果均證明兔抗青鳉多克隆抗體能夠特異性識別青鳉Prdm14蛋白。

圖 2 多克隆抗體特異性檢測Fig.2 Examination of the specificity of Prdm14 polyclonal antibody

2.4 多克隆抗體對過表達蛋白的檢測

為進一步檢測抗體是否能特異識別過表達的Prdm14蛋白, 我們構建了pCAG-prdm14EGFP融合表達載體。用高保真PCR聚合酶(Vazyme)擴增得到的prdm14編碼序列經(jīng)fusion PCR與線性化的pCAG-EGFP質粒連接(圖 3A), 構建Prdm14與EGFP融合的表達載體pCAG-prdm14EGFP (圖 3B)。所獲質粒用EcoRⅠ酶切得到約1.8 kb及6.6 kb的片段, 與預期大小一致, 說明pCAG-prdm14EGFP載體構建成功。

圖 3 EGFP及Prdm14融合EGFP表達載體圖譜Fig.3 Maps of pEGFP and Prdm14: EGFP fusion protein expression vector

在倒置熒光顯微鏡下觀察, 轉染pCAG-prdm 14EGFP質粒的HepG2細胞約30%呈現(xiàn)明亮的綠色(圖 4A、B和C), 表明Prdm14融合EGFP載體構建成功且能正常表達。同時, 轉入pCAG-EGFP質粒的對照組細胞也有約50%能觀察到綠色熒光(圖 4D、E和F)。后期提取細胞總蛋白進行Western blot檢測(圖 5), 同時以αβ-Actin (1鯰1200)為內參(圖 5C)。以αPrdm14為一抗時, 轉染pCAG-prdm14EGFP的細胞出現(xiàn)一條約90 kD的條帶以及一條63 kD的條帶(圖5A), 分別與融合蛋白及人的PRDM14蛋白大小相符, 而對照組在相應位置沒有條帶出現(xiàn), 這說明αPrdm14可特異性識別細胞中過表達的青鳉Prdm14鯰EGFP融合蛋白。以αGFP (1鯰1000)為一抗時, 僅有對照組出現(xiàn)一條約26 kD的條帶(圖 5B), 大小與EGFP蛋白一致。因此, 該多克隆抗體能用于鑒定體外過表達的青鳉Prdm14蛋白。

3 討論

在人和小鼠中的研究表明, PRDM14是干細胞多能性維持, 生殖細胞形成, 體細胞重編程過程中的關鍵轉錄調節(jié)因子, 但在斑馬魚中的研究發(fā)現(xiàn)其與初級運動神經(jīng)元的生長有關[16], 是否在細胞的多能性調控中有重要作用尚不得而知, 而且魚類干細胞的多能性調控分子機理目前鮮有報道。因此本實驗以模式魚類青鳉為對象, 開展青鳉Prdm14原核表達的研究并制備兔抗青鳉多克隆抗體, 為進一步研究prdm14基因的功能奠定基礎。

本實驗構建了含基因全長的重組質粒和含較短基因片段的重組質粒, 并誘導得到高效表達的重組蛋白。在原核表達系統(tǒng)中外源重組蛋白由于缺乏所需要的酶和輔助因子, 溫度、培養(yǎng)基等的影響,或蛋白質合成太快不能正確的折疊而容易形成包涵體。包涵體具有高密度, 易于分離純化的優(yōu)點,但是不具有生物學活性[26]。過大的目的蛋白分子量會使得其難以誘導表達, 或表達效率降低, 更容易形成包涵體, 而且抗原過大時免疫所產(chǎn)生的抗體特異性不佳。因此本實驗最終采用小片段的蛋白進行免疫并獲得抗體。由短片段得到的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗體能特異性識別Prdm14重組蛋白(83 kD)及Prdm14?600重組蛋白(60 kD)。

圖 4 pCAG-prdm14EGFP載體在HepG2細胞中的表達Fig.4 Expression of pCAG-prdm14EGFP vector in HepG2

研究表明prdm14在小鼠原始生殖細胞中特異性表達[10,27], 而且斑馬魚prdm14在神經(jīng)系統(tǒng)中有表達[16]。本實驗中對青鳉精巢、卵巢、腦組織總蛋白進行Western blot檢測, 結果均出現(xiàn)一條64 kD條帶, 與預期的青鳉Prdm14蛋白大小一致, 說明制備的多克隆抗體能特異性識別魚體中表達的Prdm14蛋白, 同時證明Prdm14在青鳉性腺和腦中都有表達, 與我們所檢測的其RNA的表達結果一致(結果另文發(fā)表)。

圖 5 Prdm14: EGFP融合蛋白在HepG2細胞中的檢測Fig.5 Western blot analysis of Prdm14: EGFP fusion protein in HepG2

在HepG2細胞中轉染pCAG-prdm14EGFP融合表達載體及pCAG-EGFP空載體時, 細胞都表達綠色熒光。與對照組EGFP蛋白廣泛表達在細胞質和細胞核中不同的是, 融合蛋白主要被定位在細胞核中, 這與人類PRDM14作為轉錄因子的細胞核定位的特性一致。以αPrdm14為一抗對細胞總蛋白進行Western blot檢測時, 實驗組出現(xiàn)約90和63 kD的條帶, 分別與Prdm14鯰EGFP融合蛋白和人源PRDM14蛋白大小一致, 這說明該抗體可以用來鑒定體外表達的Prdm14蛋白。值的一提的是, 63 kD條帶的出現(xiàn), 可能是由于HepG2細胞內源人屬PRDM14活化上調而被檢測到, 但其中的機制仍需要進一步探究。此外, 在顯微鏡下能觀察到細胞核中表達的融合蛋白的熒光, 但是以GFP抗體進行蛋白雜交時卻不能檢測到預期的融合蛋白的條帶, 僅在對照組檢測到26 kD的EGFP蛋白。在其他試驗中我們也發(fā)現(xiàn)當目的基因在EGFP的N端進行融合表達時, GFP抗體經(jīng)常不能檢測到EGFP融合片段, 而當目的基因在C端融合時卻能被檢測到?；赟DSPAGE是蛋白變性后的電泳結果, 理論上不論N端或C端的融合, EGFP抗體都應該能檢測到融合蛋白, 因此N端融合不能被檢測的原因尚有待研究。

綜上所述, 本實驗構建了青鳉Prdm14原核表達載體, 誘導表達并純化了重組蛋白, 制備了兔抗青鳉源Prdm14多克隆抗體, 并應用該抗體識別了內源的Prdm14蛋白和細胞中過表達的Prdm14鯰EGFP融合蛋白。該特異性抗體的獲得為下一步闡明青鳉prdm14基因的功能奠定了基礎。

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PROKARYOTIC EXPRESSION, PREPARATION AND APPLICATION OF ANTIPRDM14 POLYCLONAL ANTIBODY OF MEDAKA (ORYZIAS LATIPES) PRDM14

LI Ling-Yu, FANG Jian, YU Miao and CHEN Tian-Sheng
(Key Laboratory of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture, College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

PRDM14, a member of PRDM family, plays an important role in germ cells and the maintenance of pluripotency in embryonic stem (ES) cells in mice and humans, but its functions in other species are largely unknown.Medaka (Oryzias latipes) is an excellent fish model to study the developmental biology and stem cell pluripotency.In order to study the potential function of medaka prdm14, the recombinant medaka Prdm14 protein was expressed and used to generate the rabbit anti-Prdm14 polyclonal antibody.First, the recombinant expression vector pET32a-prdm14?600was constructed by inserting a part of prdm14 CDS into pET32a vector.Second, the vector was transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) and the protein (60 kD) was induced by isopropyl-β-d-thiogalactoside (IPTG).Third, the protein was purified and used as the antigen to immunize rabbit (Oryctolagus cuniculus).Last, six weeks after injection, the antiserum was collected, and the antibody titer and specificity were detected by ELISA and Western blot.The results showed the recombinant Prdm14 could be highly induced at 37℃ with 0.6 mmol/L IPTG for 3h.The polyclonal anti-Prdm14 antibody reacted specifically with Prdm14 in medaka adult tissues or Prdm14: EGFP fusion protein ectopically expressed in HepG2.In conclusion, we generated a polyclonal antibody for medaka Prdm14, which provides a powerful tool to analyze the underlying function of prdm14 in fish stem cells.

Medaka (Oryzias latipes); Prdm14; Prokaryotic expression; Polyclonal antibody; Stem cells

Q786

A

1000-3207(2017)04-0748-07

10.7541/2017.93

2016-08-03;

2016-11-23

國家重點基礎研究計劃(2013CB967700); 華中農業(yè)大學自主科技創(chuàng)新基金(2013RC014和2662015PY049)資助 [Supported by the State Key Development Program for Basic Research of China (2013CB967700); the Fundamental Research Funds for the Central Universities (2013RC014, 2662015PY049)]

李玲玉(1991—), 女, 河南信陽人; 碩士研究生; 研究方向為魚類遺傳育種及干細胞。E-mail: lilingyu@webmail.hzau.edu.cn

陳天圣, 教授; E-mail: tiansheng.chen@mail.hzau.edu.cn