楊 勇黃 貝黃文樹(shù)段明珠張芳芳聶 品

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 廈門 361021; 2.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

日本鰻鱺的C-型和G-型溶菌酶研究

楊 勇1,2黃 貝1黃文樹(shù)1段明珠1張芳芳1聶 品2

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 廈門 361021; 2.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

研究以日本鰻鱺(Anguilla japonica Temminck et Schlegel)為研究對(duì)象, 根據(jù)其基因組數(shù)據(jù)庫(kù), 預(yù)測(cè)并擴(kuò)增出2類, 共5個(gè)溶菌酶基因, 包括1個(gè)C-型溶菌酶和4個(gè)G-型溶菌酶, 分別命名為AJLysC、AJLysG1、AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4。它們的cDNA全長(zhǎng)分別為811、749、1352、1175和733 bp, 編碼143、193、185、185和187個(gè)氨基酸。SignalP預(yù)測(cè)表明, AJLysC和AJLysG1的N-端分別包括15和19氨基酸的信號(hào)肽, 另外3種溶菌酶沒(méi)有信號(hào)肽。基因組分析顯示, AJLysC、AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4的基因結(jié)構(gòu)與其他魚(yú)類的同類溶菌酶的基因結(jié)構(gòu)相似, C-型溶菌酶具有4個(gè)外顯子, G-型則具有5個(gè)。但是, AJLysG1的基因結(jié)構(gòu)與其他魚(yú)類G-型溶菌酶不同, 具有6個(gè)外顯子, 與其他魚(yú)類溶菌酶的蛋白序列比較, 發(fā)現(xiàn)AJLysG1缺失其他G-型溶菌酶存在的第2個(gè)酶活性位點(diǎn)氨基酸, 即天冬氨酸Asp。AJLysC與其他很多物種的C-型溶菌酶具有較高的同一性, 如與牙鲆的同一性為72.7%。G-型溶菌酶中AJLysG2、AJLysG3、AJLysG4彼此之間以及與其他物種G-型溶菌酶的同一性相對(duì)較高; 而AJLysG1與其他物種以及與其他3種G-型溶菌酶的同一性均不高, 且都在50%以下。組織表達(dá)分析顯示, 所有5個(gè)溶菌酶基因在12種檢測(cè)的組織中均有表達(dá)。C-型溶菌酶在胃及免疫相關(guān)組織的表達(dá)量較高; G-型溶菌酶在各組織/器官中的表達(dá)則差異較大, AJLysG1在皮膚和肌肉中的表達(dá)量最高, AJLysG2在免疫組織/器官如血液、頭腎、體腎和鰓中表達(dá)量較高。經(jīng)遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)刺激48h后, 這5個(gè)溶菌酶基因在組織/器官中的表達(dá)量均有上調(diào), 其中在血液、腸道和頭腎等的上調(diào)較為顯著。此外, 研究嘗試重組表達(dá)這些抗菌肽, 獲得了AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4基因在鯉上皮瘤細(xì)胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC)細(xì)胞中的表達(dá), 重組蛋白表現(xiàn)出對(duì)溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)生長(zhǎng)的明顯抑制作用。文章較全面地研究了日本鰻鱺溶菌酶基因的組成和類型及其表達(dá)變化, 并重組表達(dá)了部分基因, 這為進(jìn)一步研究這些溶菌酶的功能, 特別是對(duì)病原微生物的作用奠定了基礎(chǔ)。

日本鰻鱺; 溶菌酶; 表達(dá); 重組蛋白; 抑菌活性

溶菌酶廣泛存在于有機(jī)體, 能水解細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖中由N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)形成的β-1,4糖苷鍵, 造成細(xì)胞壁裂解, 引起細(xì)菌死亡, 從而在機(jī)體的防御系統(tǒng)中起著重要作用[1]。脊椎動(dòng)物中有C-型(Chicken-type)和G-型(Goose-type)兩種溶菌酶[2,3]。C-型溶菌酶是最早發(fā)現(xiàn)并且研究最多的一類溶菌酶。最早被測(cè)序的雞蛋蛋白溶菌酶和人的溶菌酶都是C-型溶菌酶, 它們也是應(yīng)用較廣的溶菌酶[4—6]。魚(yú)類C-型溶菌酶的研究涉及許多種類,包括一些重要的經(jīng)濟(jì)種類和模式種類, 如羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus Linnaeus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss Walbaum)、牙鲆(Paralichthys olivaceus Temminck et Schlegel)、鯉(Cyprinus carpio L.)、紅鰭東方鲀(Fugu rubripes Temminck et Schlegel)、斑馬魚(yú)(Danio rerio Buchanan-Hamilton)等[7—11]。所有已發(fā)現(xiàn)的C-型溶菌酶均含有2個(gè)酶活性位點(diǎn), 即第35個(gè)氨基酸谷氨酸(Glu)和第52個(gè)氨基酸天冬氨酸(Asp); 同時(shí)也存在8個(gè)保守的半胱氨酸(Cys), 這些半胱氨酸能形成4個(gè)二硫鍵, 維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[12,13]。C-型溶菌酶的基因結(jié)構(gòu)較為保守, 脊椎動(dòng)物中已報(bào)道的C-型溶菌酶基因均為4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu), 其中第一個(gè)外顯子編碼的蛋白質(zhì)含有信號(hào)肽[14]。

G-型溶菌酶最初由Canfield等[15]于1967年在鵝蛋蛋白中發(fā)現(xiàn), 因此命名為G-型溶菌酶。之后, 在很多其他鳥(niǎo)類中也報(bào)道了G-型溶菌酶, 如鴕鳥(niǎo)(Struthio camelus L.)、黑天鵝(Cygnus atratus L.)和雞(Gallus domesticus L.)等[16—19]。然而, 直到2001年才在魚(yú)類中報(bào)道了G-型溶菌酶[2]。目前, 已在很多魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)了G-型溶菌酶的存在, 包括斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides Temminck et Schlegel)、鱖(Siniperca chuatsi Basilewsky)、大西洋鮭(Salmo salar L.)、大西洋鱈(Gadus morhua L.)等[20—23]。目前, 對(duì)于哺乳動(dòng)物G-型溶菌酶的研究相對(duì)較少。2003年, Irwin等[24]通過(guò)對(duì)基因組的分析, 首次在人(Homo sapiens L.)、鼠(Mus musculus L.)等物種中發(fā)現(xiàn)了G-型溶菌酶基因。在不同物種中, G-型溶菌酶外顯子的數(shù)目差異較大。人的G-型溶菌酶基因有7個(gè)外顯子[24]; 其他哺乳動(dòng)物以及鳥(niǎo)類的G-型溶菌酶均為6個(gè)外顯子, 這些溶菌酶均含有信號(hào)肽[24,25]。在魚(yú)類中, 已經(jīng)報(bào)道的G型溶菌酶基因均為5個(gè)外顯子, 并且很多魚(yú)類的G-型溶菌酶沒(méi)有信號(hào)肽, 因此曾認(rèn)為魚(yú)類G-型溶菌酶基因較少的外顯子數(shù)目是造成魚(yú)類溶菌酶中沒(méi)有信號(hào)肽的原因[24]。然而, 在大西洋鮭和大西洋鱈中的G-型溶菌酶盡管只有5個(gè)外顯子, 但經(jīng)過(guò)變換轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription start site)可以影響其是否分泌到胞外[22,23]。

魚(yú)類C-型溶菌酶和G-型溶菌酶在魚(yú)體的所有組織/器官中都有表達(dá), 如草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella Valenciennes)[26]和菱鲆(Scophthalmus rhombus L.)[12]的肝臟、頭腎、腎、脾、皮膚、肌肉、心臟、腦、腸道和鰓等組織/器官中均有溶菌酶基因的表達(dá)。經(jīng)過(guò)病原或病原相關(guān)分子刺激后, 這兩類溶菌酶基因在檢測(cè)的組織/器官中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[12,26]。已有的研究顯示, 魚(yú)類的溶菌酶對(duì)一些病原細(xì)菌具有明顯的抑制作用。例如, 草魚(yú)的C-型溶菌酶和G-型溶菌酶蛋白對(duì)溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、大腸桿菌(Escherichia coli)及嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等細(xì)菌均表現(xiàn)出溶菌活性[26]。重組的鱖G-型溶菌酶對(duì)溶壁微球菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[21]。斜帶石斑魚(yú)的G-型溶菌酶對(duì)大腸桿菌、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌(P.fluorescens)等多種病原菌均有溶菌活性[20]。

日本鰻鱺(Anguilla japonica)屬于鰻鱺目(Anguilliformes)、鰻鱺科(Anguillidae), 是重要的經(jīng)濟(jì)種類, 也是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象[27]。目前, 我國(guó)東南沿海分布的日本鰻鱺的苗種捕撈量逐年降低, 資源量不斷減少, 無(wú)法滿足養(yǎng)殖生產(chǎn)需求[28]。在日本, 日本鰻鱺已被列為國(guó)際瀕危物種紅色目錄(IUCN Red List of Threatened Species)[29]。我國(guó)鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)也曾一度依賴進(jìn)口的歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla L.), 但其也被列為國(guó)際瀕危物種紅色目錄,其苗種的出口受到了嚴(yán)格限制[30]。因此, 研究日本鰻鱺的生物學(xué)和養(yǎng)殖對(duì)于其種質(zhì)資源保護(hù)、養(yǎng)殖生產(chǎn)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都有重要意義。本研究通過(guò)分析日本鰻鱺的基因組數(shù)據(jù)庫(kù), 發(fā)現(xiàn)了5個(gè)溶菌酶基因, 在此基礎(chǔ)上克隆了它們的基因序列, 揭示了它們的表達(dá)變化規(guī)律, 并在魚(yú)類細(xì)胞系中表達(dá)了其中的3個(gè)溶菌酶基因, 為進(jìn)一步研究這些溶菌酶的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 目的基因的部分序列

根據(jù)日本鰻鱺基因組數(shù)據(jù), 以其他魚(yú)類的C-型和G-型溶菌酶基因作為參照, 用Blast軟件進(jìn)行分析, 獲得日本鰻鱺可能的C-型和G-型溶菌酶基因的部分序列。

1.2 擴(kuò)增目的基因cDNA全長(zhǎng)

為確認(rèn)預(yù)測(cè)的目的基因是否正確以及獲得目的基因完整的cDNA全長(zhǎng)序列, 本研究根據(jù)SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)的說(shuō)明,以預(yù)測(cè)的基因序列為模板設(shè)計(jì)并合成引物, 并對(duì)目的基因的3′及5′端分別進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)用魚(yú)取自于集美大學(xué)海水養(yǎng)殖場(chǎng), 體重約250 g。經(jīng)暫養(yǎng)后, 采集頭腎及肝臟, 采用Trizol?Reagent (Invitrogen)提取總RNA, 然后采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit合成模板?；虻臄U(kuò)增采用槽式PCR,即第一輪采用降落PCR (Touchdown PCR)經(jīng)UPM (Universal Primer Mix)和外引物進(jìn)行擴(kuò)增; 第二輪采用常規(guī)PCR經(jīng)NUP (Nested Universal Primer)和內(nèi)引物進(jìn)行擴(kuò)增。其中, AJLysC、AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4使用Ex taq (TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增; AJLysG1采用擴(kuò)增性能較好的Advantage 2(Clontech)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收?；厥债a(chǎn)物連接至pMD19-T (TaKaRa), 然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli)TOP10感受態(tài)細(xì)胞;轉(zhuǎn)化細(xì)菌的陽(yáng)性克隆被送測(cè)序公司(金斯瑞生物科技或生工生物)進(jìn)行測(cè)序。將5′-RACE和3′-RACE測(cè)序結(jié)果拼接, 即獲得cDNA序列全長(zhǎng)。本研究所有使用的引物見(jiàn)表 1。

1.3 目的基因DNA的擴(kuò)增

為研究分析目的基因, 根據(jù)所獲得的cDNA序列設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增DNA全長(zhǎng)的引物(表 1)。采用QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)從肌肉組織中純化DNA, 目的基因DNA使用LA Taq (TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增, 經(jīng)測(cè)序獲DNA序列。

1.4 生物信息學(xué)分析

目的基因的預(yù)測(cè)采用本地Blast (blast-2.2.22)。引物的設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5.0和6.0。序列經(jīng)查找重疊區(qū)域而拼接完整后采用ORF Finder (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htmL)查找開(kāi)放閱讀框。使用ExPASy網(wǎng)站(http://www.expasy.org)中的Translate軟件推導(dǎo)氨基酸序列。信號(hào)肽的分析采用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。推導(dǎo)出的蛋白的參數(shù)分析采用Ex-PASy網(wǎng)站中ProtParam tool軟件進(jìn)行分析。序列同源性比對(duì)分析采用軟件MatGat 2.02[31]。蛋白質(zhì)二硫鍵的預(yù)測(cè)采用Predict Protein (https://www.predictprotein.org/)。進(jìn)化樹(shù)使用MEGA 5.2經(jīng)鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建, bootstraps設(shè)置為1000?；蚪Y(jié)構(gòu)采用Spidey (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/spideyweb.cgi)進(jìn)行分析。

1.5 溶菌酶基因在正常魚(yú)和受病原刺激魚(yú)體的表達(dá)分析

使用大豆酪蛋白消化液培養(yǎng)基(Tryptic soytone broth medium, TSB), 30℃培養(yǎng)遲緩愛(ài)德華氏菌, 待菌液渾濁后, 測(cè)定OD540值(Spectrumlab 721N型, 上海精密科學(xué)儀器有限公司)。按照比例使用TSB將E.tarda梯度稀釋, 將稀釋后的菌液涂布在大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptic soy agar, TSA)平板上, 生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)過(guò)夜, 第2天對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。經(jīng)計(jì)數(shù)分析顯示, 當(dāng)OD540為0.5時(shí), 每毫升菌液對(duì)應(yīng)的細(xì)菌菌落總數(shù)約為2.5×108。2200×g離心15min回收菌體, 棄培養(yǎng)基后用合適體積的PBS緩沖液(Phosphate buffer saline, pH 7.4)懸浮菌體; 將菌體再次2200×g離心15min, 更換PBS, 將菌液濃度調(diào)節(jié)至1.0×107cfu/mL用于感染魚(yú)體。

表 1 本研究使用的引物Tab.1 Primers used in the current study

將經(jīng)過(guò)暫養(yǎng)2周的日本鰻鱺(購(gòu)自廣東省江門市, 個(gè)體體質(zhì)量約為500 g)隨機(jī)分成4組: 空白組、對(duì)照組和兩個(gè)刺激組, 每組均為4條魚(yú)?？瞻捉M不注射, 對(duì)照組每條魚(yú)腹腔注射1.0 mL滅菌后的PBS緩沖液; 刺激組每條魚(yú)注射1 mL濃度調(diào)節(jié)至1.0×107cfu/mL的遲緩愛(ài)德華氏菌菌液。對(duì)照組在注射PBS緩沖液后24h采樣, 刺激組分別在注射菌液24h和48h后采樣。采樣時(shí), 將日本鰻鱺經(jīng)丁香酚醇溶液麻醉, 分別采集血液、腸道、頭腎、體腎、胃、肝、脾、鰓、腦、心、皮膚和肌肉, 共計(jì)12個(gè)組織/器官。然后, 將樣品浸入冰上預(yù)冷的1 mL Trizol?Reagent中, 提取樣品總RNA或者將樣品保存于超低溫冰箱中備用。

提取總RNA后, 用Nano Drop 2000(Thermo)測(cè)定濃度, 取總RNA 500—1000 ng使用DNaseⅠ(Thermo)處理, 然后用M-MuLV酶逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)合成cDNA。為降低或消除定量分析時(shí)提取總RNA過(guò)程中殘留的基因組DNA的影響, 實(shí)驗(yàn)引物采用跨內(nèi)含子的方法設(shè)計(jì), 采用定量分析引物(表 1)擴(kuò)增目的基因, 連接至pMD18-T, 然后測(cè)序確認(rèn)。將測(cè)序正確的克隆擴(kuò)大培養(yǎng), 提取質(zhì)粒(Plasmid Mini Kit, Omega), 使用分光光度計(jì)(NanoDrop 2000, Thermo)測(cè)定質(zhì)粒的濃度。質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算參照已報(bào)道的方法[32]。將測(cè)定濃度后的質(zhì)粒按照10倍梯度稀釋, 然后使用Bio-rad公司定量PCR系統(tǒng)(CFX96TMReal-Time System)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時(shí)熒光定量分析(Real-time quantitative reverse transcription-PCR, rt-qPCR)的反應(yīng)體系為20 μL, 包括iQTM SYBR Green Super Mix (2×) 10 μL, 正向引物(10 μmol/L) 1 μL, 反向引物(10 μmol/L) 1 μL, 模板1 μL, 和ddH2O 7 μL。rt-qPCR的程序如下: 預(yù)變性95℃ 3min; 95℃變性10s, 60℃退火20s, 72℃延伸20s, 80℃讀板5s, 共41個(gè)循環(huán)。

1.6 溶菌酶基因的重組表達(dá)與重組蛋白的活性分析

分別使用EcoRⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)將AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4的開(kāi)放閱讀框序列(去掉終止密碼子及信號(hào)肽編碼序列)連入pcDNATM3.1/myc-His(-) A (Invitrogen)真核表達(dá)質(zhì)粒。

采用鯉上皮瘤細(xì)胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC)進(jìn)行重組表達(dá)。利用M199培養(yǎng)基+ 10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS), 于28℃在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將構(gòu)建成功的pcDNA3.1-AJLysG2、-AJLysG3、-AJLysG4以及pcDNA3.1空載體質(zhì)粒分別使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染75 cm2培養(yǎng)瓶中的EPC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24h后, 去掉上清培養(yǎng)基并用含有蛋白酶抑制劑cocktail (Roche)的RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。裂解產(chǎn)物經(jīng)12000×g, 4℃離心10min, 獲取上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

轉(zhuǎn)染后的EPC細(xì)胞裂解產(chǎn)物上清液經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜(孔徑0.2 μm), 用含有3%脫脂奶粉的TBS緩沖液常溫封閉1h, 然后使用含鼠抗Myc單抗(Sigma, 1鯰2000)及1.5%脫脂牛奶的TBS緩沖液4℃孵育過(guò)夜。洗膜后, 二抗(羊抗鼠IgG-HP多抗, Pierce, 1鯰5000)孵育1h。TBST緩沖液洗膜后, 在化學(xué)發(fā)光儀(Bio-Rad)中顯色和拍照。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(MagicMarkTMXP Western Protein Standard, Novex)估測(cè)目的蛋白濃度。

溶菌酶抑菌實(shí)驗(yàn)參照Hikima等[2]以及Sun等[21]的方法進(jìn)行。磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)、TSB培養(yǎng)基和瓊脂粉, 以100鯰3鯰1 (v鯰w鯰w)比例混合滅菌。滅菌后, 固體培養(yǎng)基在50℃水浴保溫。TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)溶壁微球菌, 當(dāng)菌液OD600為0.4時(shí), 以1鯰200 (v鯰v)的比例將菌液混入50℃固體培養(yǎng)基中, 倒在9 cm平板上。培養(yǎng)基凝固后打孔并分別加入轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-AJLysG2、-AJLysG3、-AJLysG4和pcDNA3.1空載體質(zhì)粒的EPC細(xì)胞裂解產(chǎn)物上清液以及雞蛋蛋白溶菌酶(Hen egg white lysozyme, HEWL)。然后將平板置于28℃培養(yǎng)約18h。觀察樣品在平板上產(chǎn)生的溶菌環(huán)的大小并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 C-型和G-型溶菌酶基因的cDNA和DNA序列分析

通過(guò)分析基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以及PCR擴(kuò)增, 鑒定了日本鰻鱺的1個(gè)C-型和4個(gè)G-型溶菌酶基因, 將它們分別命名為AJLysC、AJLysG1、AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4。它們的cDNA全長(zhǎng)分別為811、749、1352、1175和733 bp, 編碼143、193、185、185和187個(gè)氨基酸。SignalP預(yù)測(cè)表明, AJLysC和AJLysG1的N-端含有信號(hào)肽, 成熟肽分別為128和174氨基酸; 另外3種溶菌酶沒(méi)有信號(hào)肽(表 2)。在這些基因的3′端非編碼區(qū), 其cDNA序列均有多腺苷酸化信號(hào)(AATAAA), 其中AJLysG1和AJLysG2在ploy A之前分別含有1和4個(gè)不穩(wěn)定信號(hào)(ATTTA)(未顯示, 可見(jiàn)GenBank序列)。

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示, AJLysC與菱鲆的同一性最高, 為76.9%, 其次是牙鲆、紅鰭東方鲀和塞內(nèi)加爾鰨, 分別為72.7%、69.2%和67.8%, 與鯉和草魚(yú)的比較低, 只有38.6%和37.4%。G-型溶菌酶中AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4之間的同一性相對(duì)較高, 在50%以上; 而AJLysG1與其他溶菌酶的則較低, 均在50%以下(表 3)。與其他魚(yú)類的相對(duì)應(yīng)的溶菌酶序列比較發(fā)現(xiàn), 日本鰻鱺的C-型溶菌酶和其他魚(yú)類的C-型溶菌酶都有信號(hào)肽, 有8個(gè)保守的半胱氨酸和2個(gè)保守的催化殘基Glu35和Asp52; 這8個(gè)半胱氨酸能形成4個(gè)二硫鍵(圖 1)。日本鰻鱺的G-型溶菌酶AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4均具有3個(gè)保守的催化殘基, 即Glu73、Asp86和Asp97, 但AJLysG1的第二個(gè)催化殘基, 即Asp86缺失(圖 2)。此外, AJLysG1存在2個(gè)半胱氨酸, 但預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,這2個(gè)半胱氨酸并不形成二硫鍵(圖中未顯示)。

本研究采用鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖 3)。從圖中可以看出, 日本鰻鱺的AJLysC與其他脊椎動(dòng)物的C-型溶菌酶聚為一大支。魚(yú)類的G-型溶菌酶聚為一大支, 而日本鰻鱺的AJLysG2、AJLysG3、AJLysG4與其他硬骨魚(yú)類G-型溶菌酶聚為一支, 再與AJLysG1聚在一起。

2.2 C-型和G-型溶菌酶的基因結(jié)構(gòu)

日本鰻鱺的5個(gè)溶菌酶基因的基因組結(jié)構(gòu)信息見(jiàn)圖 4。這5個(gè)溶菌酶基因的基因組結(jié)構(gòu)均符合經(jīng)典的剪切模式(GT/內(nèi)含子/AG)。AJLysC基因組為1878 bp, 含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。AJLysG1基因組長(zhǎng)3733 bp, 含有6個(gè)外顯子, 5個(gè)內(nèi)含子。AJLys-G2、AJLysG3和AJLysG4的基因組長(zhǎng)度分別為2357、2108和2725 bp, 這3個(gè)G-型溶菌酶基因和其他魚(yú)類同類溶菌酶基因一樣, 均含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,并且對(duì)應(yīng)的外顯子堿基數(shù)目接近, 特別是AJLysG3和AJLysG4, 其對(duì)應(yīng)的外顯子的數(shù)目完全相同。

表 2 日本鰻鱺溶菌酶基因cDNA序列及其氨基酸序列Tab.2 The cDNA sequences and deduced amino acids of lysozyme genes in the Japanese eel

表 3 日本鰻鱺G-型溶菌酶之間以及與其他魚(yú)類G-型溶菌酶的同一性分析Tab.3 Comparison among G-type lysozymes of the Japanese eel and other species of fish

圖 1 日本鰻鱺C-型溶菌酶AJLysC和其他魚(yú)類C-型溶菌酶的氨基酸序列比較Fig.1 Comparison of deduced amino acid sequence of C-type lysozyme, AJLysC of the Japanese eel with homologues of other species of fish

圖 2 日本鰻鱺G-型溶菌酶和其他魚(yú)類G-型溶菌酶氨基酸序列的比較Fig.2 Comparison of deduced amino acid sequences of G-type lysozymes of the Japanese eel with homologues of other species of fish

圖 3 鄰接法構(gòu)建的日本鰻鱺與其他物種的溶菌酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic analysis of lysozymes of the Japanese eel and other vertebrates

圖 4 日本鰻鱺的1個(gè)C-型(AJLysC)和4個(gè)G-型(AJLysG1-4)溶菌酶基因結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Gene organization of the C-type (AJLysC) and four G-type (AJLysG1-4) lysozymes of the Japanese eel

2.3 C-型和G-型溶菌酶基因在健康魚(yú)體組織/器官的表達(dá)

熒光定量PCR分析顯示, 克隆到的1個(gè)C-型溶菌酶和4個(gè)G-型溶菌酶基因在健康魚(yú)體的組織/器官都有表達(dá)(圖 5、圖6)。然而, 這5個(gè)溶菌酶基因的表達(dá)水平及其在不同組織/器官的表達(dá)似乎都不一樣。C-型溶菌酶在所有組織/器官中的表達(dá)量都比相對(duì)應(yīng)的組織/器官中G-型溶菌酶的表達(dá)量高, C-型溶菌酶在胃中的表達(dá)量最高, 是β-actin表達(dá)量的30倍; 在腸和脾中的表達(dá)量也很高, 分別是βactin表達(dá)量的14和2倍(圖 5)。G-型溶菌酶基因在所有組織/器官中的表達(dá)都較低。AJLysG1在各組織/器官中的表達(dá)差異很大, 在皮膚的表達(dá)量最高,卻只有β-actin表達(dá)量的0.011倍, 在頭腎、肝和脾等免疫器官中幾乎不表達(dá)。AJLysG2基因在各組織/器官中的表達(dá)差異較小, 在鰓中表達(dá)量最高, 為βactin表達(dá)量的0.023倍; 在血液、頭腎、鰓和體腎中的表達(dá)量相對(duì)較高。AJLysG3基因在鰓中的表達(dá)量最高, 為β-actin表達(dá)量的0.017倍。AJLysG4基因在在肌肉中的表達(dá)水平最高, 在其他組織/器官中的表達(dá)普遍較低。

2.4 C-型和G-型溶菌酶基因在遲緩愛(ài)德華氏菌感染后的表達(dá)變化

經(jīng)定量分析顯示, 遲緩愛(ài)德華氏菌刺激后, 溶菌酶基因在組織/器官中均有明顯的上調(diào)表達(dá)。刺激后, AJLysC在各組織/器官中的表達(dá)均上調(diào),24h后在脾和腦中表達(dá)量上調(diào)25和22倍(圖 6A)。AJLysG1在刺激48h后上調(diào)更明顯, 其表達(dá)量在胃、腸和頭腎中上調(diào)倍數(shù)分別為50、45和41(圖 6B)。AJLysG2在刺激48h后表達(dá)上調(diào)更明顯, 在腸道、胃和血液中的上調(diào)倍數(shù)分別為18、17和13(圖 6C)。與AJLysG1和AJLysG1相似, AJLysG3在刺激后48h上調(diào)較為明顯, 如血液中表達(dá)上調(diào)27倍(圖 6D)。AJLysG4的表達(dá)量在刺激后24h和48h均有較明顯的上調(diào), 在肝臟中分別上調(diào)了67和50倍(圖 6E)。刺激后, 目的基因在部分組織中表達(dá)量也存在下調(diào)的現(xiàn)象, 如AJLysG1在刺激24h后, 其在鰓和心臟中的表達(dá)量分別下調(diào)了3和3.4倍。

圖 5 日本鰻鱺的1個(gè)C-型(AJLysC)和4個(gè)G-型(AJLysG1-4)溶菌酶基因在健康魚(yú)體組織/器官的表達(dá)分布Fig.5 The expression of the C-type (AJLysC) and four G-type (AJLysG1-4) lysozyme genes in different tissues/organs of the Japanese eel

2.5 溶菌酶重組蛋白表達(dá)及活性分析

使用生物軟件分析顯示, AJLysG2、AJLysG3、AJLysG4蛋白分子量分別為20.7、20.4和20.7 kD;加上真核表達(dá)載體上Myc、His標(biāo)簽以及多克隆位點(diǎn)等堿基表達(dá)的肽鏈, 這3個(gè)重組蛋白的分子量分別為26.3、26.0和26.3 kD, 目的條帶分子量與預(yù)測(cè)的分子量基本相符(圖 7)。

參考Hikima等[2]和Sun等[21]的實(shí)驗(yàn), 本實(shí)驗(yàn)使用溶壁微球菌為底物進(jìn)行溶菌酶重組蛋白對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制作用的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 這3個(gè)重組蛋白對(duì)溶壁微球菌的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用, 抑制作用與雞蛋白溶菌酶的作用基本一致(圖 7B)。

3 討論

多種溶菌酶基因在同一物種中同時(shí)存在的現(xiàn)象極其普遍, 如雞, 除了是最早發(fā)現(xiàn)具有C-型溶菌酶的物種外, 還具有2個(gè)G-型溶菌酶基因[19]; 在一些哺乳類也具有類似的現(xiàn)象, 如人類、鼠等物種同時(shí)具有C-型和G-型溶菌酶基因[5,35,23]。目前研究過(guò)的大部分魚(yú)類均同時(shí)具有C-型和G-型溶菌酶基因, 如牙鲆、草魚(yú)、菱鲆等魚(yú)類[2,10,12,26]。經(jīng)過(guò)將完整的cDNA序列在NCBI上進(jìn)行Blast分析和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),本研究成功地從日本鰻鱺克隆到了C-型和G-型兩類溶菌酶基因, 其中C-型溶菌酶基因1個(gè), G-型溶菌酶基因4個(gè)。這4個(gè)G-型溶菌酶基因的結(jié)構(gòu)極為相似, 這應(yīng)該是基因倍化理論一個(gè)例證。

在同一物種中也有多個(gè)C-型溶菌酶基因的報(bào)道。反芻動(dòng)物中有檢測(cè)到約10個(gè)C-型溶菌酶基因,并且這些基因在胃中大量表達(dá)[36—38]; 魚(yú)類中也有多個(gè)C-型溶菌酶基因的報(bào)道, 如羅非魚(yú)有3個(gè)C-型溶菌酶基因[8]。然而, 本研究只在日本鰻鱺的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)C-型溶菌酶基因, 對(duì)其他鰻鱺種類的研究將有助于揭示鰻鱺這一類群中C-型溶菌酶基因的組成。

雞蛋蛋白溶菌酶具有2個(gè)酶活性位點(diǎn), 即Glu35和Asp52[37]。目前, 所發(fā)現(xiàn)的C-型溶菌酶均具有這2個(gè)酶活性位點(diǎn)。鵝蛋蛋白溶菌酶(Goose egg-white lysozyme, GEWL)的酶活性位點(diǎn)為Glu73、Asp86和Asp97[1]。Weaver等[39]通過(guò)蛋白三維結(jié)構(gòu)證實(shí)GEWL的Glu73和HEWL的Glu35對(duì)應(yīng); Kawamura等[40]以鴕鳥(niǎo)G-型溶菌酶為材料通過(guò)點(diǎn)突變證明Glu73是酶活性位點(diǎn)。Asp86和Asp97的作用尚未得到證明, 僅有部分實(shí)驗(yàn)證明HEWL的Asp97可能與HEWL Asp52對(duì)應(yīng)[11,41]。目前, 鯉、鼠[11,24]等物種和本研究所獲得的AJLysG1均出現(xiàn)第2個(gè)酶活性位點(diǎn)缺失或突變的現(xiàn)象。若能證實(shí)這些G-型溶菌酶具有酶活性, 這對(duì)于溶菌酶的研究將有重要的促進(jìn)作用。

圖 6 日本鰻鱺的1個(gè)C-型(a)和4個(gè)G-型(b、c、d、e)溶菌酶基因在遲緩愛(ài)德華氏菌刺激后的表達(dá)變化(*P<0.05)Fig.6 The expression of the C-type (a) and four G-type (b, c, d, e) lysozyme genes in Japanese eel stimulated by Edwardsiella tarda

圖 7 日本鰻鱺三個(gè)G-型溶菌酶基因(AJLysG2—4)的重組表達(dá)(a)與抗菌活性檢測(cè)(b)Fig.7 Expression (a) and bacterial inhibition (b) of recombinant proteins of three G-type lysozymes from the Japanese eel

進(jìn)化分析顯示, AJLysC與其他脊椎動(dòng)物的C-型溶菌酶聚為一支, 所有AJLysG均和其他物種的G-型溶菌聚為一支。盡管本研究所發(fā)現(xiàn)的AJLysG1和另外3種AJLlysG以及其他魚(yú)類G-型溶菌酶聚在一起, 但自成一支。在基因結(jié)構(gòu)上, AJLysG3和AJLysG4的外顯子數(shù)目完全相同, 但是進(jìn)化樹(shù)的分析顯示AJLysG2和AJLysG3同源性較高, AJLysG4則與前兩者的同源性較低; AJLysG1則在基因組成和蛋白序列上有差異, 這也反映在它們之間的進(jìn)化關(guān)系上。

目前所發(fā)現(xiàn)在脊椎動(dòng)物C-型溶菌酶均為4個(gè)外顯子, 3個(gè)內(nèi)含子結(jié)構(gòu), 基因結(jié)構(gòu)很保守[14]。G-型溶菌酶的基因結(jié)構(gòu)有所不同, 哺乳類和鳥(niǎo)類動(dòng)物G-型溶菌酶有6個(gè)及更多外顯子[24,25]; 已報(bào)道的魚(yú)類G-型溶菌酶則只有5個(gè)外顯子。鳥(niǎo)類和哺乳類的G-型溶菌酶N-端均含有信號(hào)肽結(jié)構(gòu), 魚(yú)類則沒(méi)有, 故Irwin等[24]推測(cè)外顯子的數(shù)目與G-型溶菌酶是否分泌直接相關(guān)。而在大西洋鮭[22]和大西洋鱈[23]中的發(fā)現(xiàn)表明, G-型溶菌酶能否分泌似乎和外顯子的數(shù)目沒(méi)有直接的關(guān)系。本研究所獲得的AJLysG1含有6個(gè)外顯子, 經(jīng)預(yù)測(cè)含有信號(hào)肽。這一發(fā)現(xiàn)部分證實(shí)了Irwin等[24]的推測(cè)。

C-型溶菌酶的作用主要是通過(guò)裂解細(xì)胞壁的組成成分肽聚糖, 而很多動(dòng)物的C-型溶菌酶在一定程度上表現(xiàn)出適應(yīng)性進(jìn)化, 還具有消化等其他的功能。在反芻動(dòng)物中胃中大量表達(dá)的C-型溶菌酶基因被認(rèn)為具有消化的功能[36,37]; 魚(yú)類, 包括虹鱒、菱鲆等物種也在胃中檢測(cè)到C-型溶菌酶基因的表達(dá)。由此可見(jiàn)魚(yú)類的C-型溶菌酶也可能同時(shí)具有免疫和消化的功能。這些發(fā)現(xiàn)可以解釋日本鰻鱺AJLysC在胃中表達(dá)量最高, 同時(shí)在免疫組織中表達(dá)量也較高這一現(xiàn)象。G-型溶菌酶的功能主要表現(xiàn)在免疫方面。根據(jù)表達(dá)規(guī)律, 推測(cè)含有信號(hào)肽的AJLysG1可能是通過(guò)分泌到皮膚表面而發(fā)揮抵御外界病原入侵的作用; AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4不具有信號(hào)肽, 應(yīng)該屬于胞內(nèi)蛋白, 它們?cè)诓煌慕M織/器官表達(dá)豐度不同, 表明它們可能在不同的組織/器官具有不同的作用, 這些都有待實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。經(jīng)病原菌刺激后, 魚(yú)類溶菌酶基因幾乎均呈上調(diào)表達(dá)。注射嗜水氣單胞菌后, 草魚(yú)C-和G-型溶菌酶基因表達(dá)量均有上調(diào)[26]; 人工感染溶藻弧菌72h后, 斜帶石斑魚(yú)胃、脾、腎等組織G-型溶菌酶基因的表達(dá)量均上調(diào)[20]。本實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果, 人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后, 日本鰻鱺的溶菌酶基因都呈上調(diào)表達(dá), 然而它們的不同的上調(diào)表達(dá)的差異可能表明它們?cè)诓煌慕M織/器官具有不同的作用, 這有待進(jìn)一步的研究。

質(zhì)粒pcDNATM3.1是一個(gè)非常完善的真核表達(dá)系統(tǒng), 其人類的CMV啟動(dòng)子使目的蛋白在細(xì)胞中能大量表達(dá)。而在魚(yú)類中, pcDNATM3.1表達(dá)系統(tǒng)也得到廣泛的應(yīng)用。如劉穎等[42]曾用pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染至魚(yú)類細(xì)胞用于斑馬魚(yú)IFIT家族基因啟動(dòng)子的分析, Zou等[43]曾將重組pcDNA3.1/myc-His(-) A轉(zhuǎn)染至EPC, 同樣取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用pcDNATM3.1/myc-His(-) A為表達(dá)載體同樣也獲得了良好的結(jié)果, 3個(gè)溶菌酶基因均能重組表達(dá), 而且重組蛋白對(duì)溶壁微球菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。然而, 本研究嘗試表達(dá)AJLysC和AJLysG1努力沒(méi)有成功(結(jié)果未顯示), 含有信號(hào)肽的AJLysC基因表達(dá)量非常低, AJLysG1的重組表達(dá)則沒(méi)有檢測(cè)到, 從而限制了這5種溶菌酶溶解細(xì)菌功能的比較研究, 這也有待今后的研究探討。

[1]Jollés P, Jollés J.What’s new in lysozyme research? Always a model system, today as yesterday [J].Molecular and Cellular Biochemistry, 1984, 63(2): 165—189

[2]Hikima Jun-ichi, Minagawa S, Hirono I, et al.Molecular cloning, expression and evolution of the Japanese flounder goose-type lysozyme gene, and the lytic activity of its recombinant protein [J].Biochimica et Biophysica Acta - Gene Structure and Expression, 2001, 1520(1): 35—44

[3]Thammasirirak S, Torikata T, Takami K, et al.The primary structure of cassowary (Casuarius casuarius) goose type lysozyme [J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2002, 66(1): 147—156

[4]Canfield R E.Amino acid sequence of egg white lysozyme [J].The Journal of Biological Chemistry, 1963, 238(8): 2698—2707

[5]Peters C W, Kruse U, Pollwein R, et al.The human lysozyme gene.Sequence organization and chromosomal localization [J].European Journal of Biochemistry, 1989, 182(3): 507—516

[6]Callewaert L, Michiels C W.Lysozymes in the animal kingdom [J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, 35(1): 127—160

[7]Liu F, Wen Z.Cloning and expression pattern of the lysozyme C gene in zebrafish [J].Mechanisms of Development, 2002, 113(1): 69—72

[8]Yu S G, Ye X, Zhang L L, et al.Molecular cloning and sequencing of three C-type lysozyme genes from Oreochromis aureus [J].Journal of Agricultural Biotechnology, 2010, 18(1): 66—74 [禹紹國(guó), 葉星, 張莉莉, 等.奧利亞羅非魚(yú)3種C型溶菌酶基因的克隆和序列分析.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2010, 18(1): 66—74]

[9]Dautigny A, Prager E M, Phamdinh D, et al.CDNA and amino-acid-sequences of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) lysozymes and their implications for the evolution of lysozyme and lactalbumin [J].Journal of Molecular Evolution, 1991, 32(2): 187—198

[10]Hikima J, Hirono I, Aoki T.Molecular cloning and novel repeated sequences of a C-type lysozyme gene in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) [J].Marine Biotechnology, 2000, 2(3): 241—247

[11]Fujiki K, Shin D H, Nakao M, et al.Molecular cloning of carp (Cyprinus carpio) leucocyte cell-derived chemotaxin 2, glia maturation factor β, CD45 and lysozyme C by use of suppression subtractive hybridization [J].Fish and Shellfish Immunology, 2000, 10(7): 643—650

[12]Jiménez-Cantizano R M, Infante C, Martin-Antonio B, et al.Molecular characterization, phylogeny, and expression of c-type and g-type lysozymes in brill (Scophthalmus rhombus) [J].Fish and Shellfish Immunology, 2008, 25(1-2): 57—65

[13]Ye X, Gao F Y, Zheng Q M.Cloning and characterization of the tiger shrimp lysozyme [J].Molecular Biology Reports, 2008, 36(6): 1239—1246

[14]Liu M, Zhang S, Liu Z, Li H, et al.Characterization, organization and expression of AmphiLysC, an acidic c-type lysozyme gene in amphioxus Branchiostoma belcheri tsingtauense [J].Gene, 2006, 367(15): 110—117

[15]Canfield R E, McMurry S.Purification and characterization of a lysozyme from goose egg white [J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 1967, 26(1): 38—42

[16]Schoentgen F, Jolles J, Jolles P.Complete amino acid sequence of ostrich (Struthio camelus) egg-white lysozyme, a goose-type lysozyme [J].European Journal of Biochemistry, 1982, 123(3): 489—497

[17]Thammasirirak S, Torikata T, Takami K, et al.The primary structure of cassowary (Casuarius casuarius) goose type lysozyme [J].Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2002, 66(1): 147—156

[18]Pooart J, Torikata T, Araki T.The primary structure of a novel goose-type lysozyme from rhea egg white [J].Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2004, 68(1): 159—169

[19]Nile C J, Townes C L, Michailidis G, et al.Identification of chicken lysozyme g2 and its expression in the intestine [J].Cellular and Molecular Life Sciences, 2004, 61(21): 2760—2766

[20]Yin Z X, He J G, Deng W X, et al.Molecular cloning, expression of orange spotted grouper goose-type lysozyme cDNA, and lytic activity of its recombinant protein [J].Diseases of Aquatic Organisms, 2003, 55(2): 117—123

[21]Sun B J, Wang G L, Xie H X, et al.Gene structure of goose-type lysozyme in the mandarin fish Siniperca chuatsi with analysis on the lytic activity of its recombinant in Escherichia coli [J].Aquaculture, 2006, 252(2-4): 106—113

[22]Kyomuhendo P, Myrnes B, Nilsen I W.A cold-active salmon goose-type lysozyme with high heat tolerance [J].Cellular and Molecular Life Sciences, 2007, 64(21): 2841—2847

[23]Larsen A N, Solstad T, Svineng G, et al.Molecular characterisation of a goose-type lysozyme gene in Atlantic cod (Gadus morhua L.) [J].Fish and Shellfish Immunology, 2009, 26(1): 122—132

[24]Irwin D M, Gong Z.Molecular evolution of vertebrate goose-type lysozyme genes [J].Journal of Molecular Evolution, 2003, 56(2): 234—242

[25]Nakano T, Graf T.Goose-type lysozyme gene of the chicken: sequence, genomic organization and expression reveals major differences to chicken-type lysozyme gene [J].Biochimica et Biophysica Acta - Gene Structure and Expression, 1991, 1090(2): 273—276

[26]Ye X, Zhang L L, Tian Y Y, et al.Identification and expression analysis of the g-type and c-type lysozymes in grass carp Ctenopharyngodon idellus [J].Developmental and Comparative Immunology, 2010, 34(5): 501—509

[27]Hu Y, Zhou C S, Hu L H, et al.Comparative analysis of the nutritional composition in the muscles and skins of Anguilla japonica cultured in the seawater and freshwater [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(4): 730—739 [胡園, 周朝生, 胡利華, 等.海、淡水養(yǎng)殖日本鰻鱺肌肉和魚(yú)皮營(yíng)養(yǎng)分析比較.水生生物學(xué)報(bào), 2015, 39(4): 730—739]

[28]Yu H Z, Li Q Y, Zhang K.Nutrition of eels, breeding status and the countermeasures [J].Journal of Anhui Agriculture Science, 2014, 42(20): 6632—6633, 6664 [于海振, 李秋云, 張坤.鰻鱺的營(yíng)養(yǎng)成分·養(yǎng)殖現(xiàn)狀與對(duì)策.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42(20): 6632—6633, 6664]

[29]The IUCN Red List of Threatened Species [DB/OL].Version 2014.3.Available at: www.iucnredlist.org/details/ 166184/0

[30]The IUCN Red List of Threatened Species [DB/OL].Version 2014.3.Available at: www.iucnredlist.org/details/ 60344/0

[31]Campanella J J, Bitincka L, Smalley J.MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences [J].BMC Bioinformatics, 2003, 4: 29

[32]Qi Z T, Nie P.Comparative study and expression analysis of the interferon gamma gene locus cytokines in Xenopus tropicalis [J].Immunogenetics, 2008, 60(11): 699—710

[33]Schmittgen D T, Livak J K.Analyzing real-time PCR data by the comparative CTmethod [J].Nature Protocols, 2008, 3(6): 1101—1108

[34]Bustin S A, Benes V, Garson A J, et al.The MIQE Guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments [J].Clinical Chemistry, 2009, 55(4): 1—12

[35]Yeh T C, Wilson A C, Irwin D M.Evolution of rodent lysozymes: isolation and sequence of the rat lysozyme genes [J].Molecular Phylogenetics and Evolution, 1993, 2(1): 65—75

[36]Irwin M D.Evolution of the bovine lysozyme gene gamily: Changes in gene expression and reversion of function [J].Journal of Molecular Evolution, 1995, 41(3): 299—312

[37]Irwin M D.Evolution of cow nonstomach lysozyme genes [J].Genome, 2004, 47(6): 1082—1090

[38]Cheetham J C, Artymiuk P J, Phillips D C.Refinement of an enzyme complex with inhibitor bound at partial occupancy [J].Journal of Molecular Biology, 1992, 224(3): 613—628

[39]Kawamura S, Ohno K, Ohkuma M, et al.Experimental verification of the crucial roles of Glu73 in the catalytic activity and structural stability of goose type lysozyme [J].Journal of Biochemistry, 2006, 140(1): 75—85

[40]Hirakawa H, Ochi A, Kawahara Y, et al.Catalytic reaction mechanism of goose egg white lysozyme by molecular modelling of enzyme-substrate complex [J].Journal of Biochemistry, 2008, 144(6): 753—761

[41]Helland R, Larsen R L, Finstad S, et al.Crystal structures of g-type lysozyme from Atlantic cod shed new light on substrate binding and the catalytic mechanism [J].Cellular and Molecular Life Sciences, 2009, 66(15): 2585—2598

[42]Liu Y, Zhang Y B, Liu K T, et al.Identification and promoter analysis of an IFIT family gene from zebrafish Danio rerio [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(1): 1—8 [劉穎, 張義兵, 劉庭凱, 等.斑馬魚(yú)一個(gè)IFIT 家族基因的鑒定及啟動(dòng)子分析.水生生物學(xué)報(bào), 2012, 36(1): 1—8]

[43]Zou P F, Chang M X, Xue N N, et al.Melanoma differentiation-associated gene 5 in zebrafish provoking higher interferon-promoter activity through signalling enhancing of its shorter splicing variant [J].Immunology, 2013, 141(2): 192—202

CHICKEN- AND GOOSE- TYPE LYSOZYME GENES IN THE JAPANESE EEL ANGUILLA JAPONICA

YANG Yong1,2, HUANG Bei1, HUANG Wen-Shu1, DUAN Ming-Zhu1, ZHANG Fang-Fang1and NIE Pin2
(1.Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2.State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

Based on genomic database of the Japanese eel (Anguilla japonica), two types of lysozyme genes including one C-type and four G-type lysozyme genes were found and named as AJLysC, AJLysG1, AJLysG2, AJLysG3, and AJLysG4, which consisted of 809, 732, 1352, 1177 and 731 nucleotides that encode 143, 193, 185, 185 and 187 amino acids, respectively.AJLysC and AJLysG1 have 15 and 19 amino acids signal peptides, respectively, but other three lysozymes have no signal peptide.The gene structure of AJLysC, AJLysG2, AJLysG3 and AJLysG4 is similar to their corresponding lysozyme genes in other species in terms of exon-intron organization, with 4 exons for the C-type and 5 exons for the G-type.However, the gene structure of AJLysG1 differed from other fishes, with 6 exons, representing the first report in fish.Compared with other species, second catalytic residue, Asp, in AJLysG1 is missing.AJLysC shares high identity with C-type lysozymes of other species, having 72.7% identity with Japanese flounder (Paralichthys olivaceus).AJLysG2, AJLysG3 and AJLysG4 share high identity with each other and with those in other species, while AJLysG1 does not share high identity with neither G-type lysozymes of other species nor the other three, with the identity lower than 50%.The real-time quantitative PCR analysis showed that all five genes were expressed in all examined organs/tissues of eels.The C-type lysozyme gene expressed highly in stomach and modestly in immune related tissues.The expression of the four G-type lysozymes was tissue-dependent.AJLysG1 highly expressed in skin and muscle, while AJLysG2 highly expressed in blood, head kidney, trunk kidney and gills.All five genes were up-regulated in many organs/tissues by Edwardsiella tarda infection, especially in blood, intestine and head kidney.In addition, the recombinant proteins of AJLysG2, AJLysG3 and AJLysG4 obviously repressed the growth of Micrococcus lysodeikticus, however, their roles in inhibiting pathogenic bacteria of the Japanese eel need further investigation.

Japanese eel; Lysozyme; Expression; Recombinant protein; Antimicrobial activity

Q344+.1

A

1000-3207(2017)04-0807-12

10.7541/2017.101

2016-03-12;

2016-12-28

國(guó)家自然科學(xué)基金(31402329); 海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(14PYY050SF03)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31402329); the Regional Project of Marine Economic Development (14PYY050SF03)]

楊勇(1988—), 男, 湖北仙桃人; 碩士研究生; 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物病害防治。E-mail: sterny@aliyun.com

聶品, 男, 研究員; E-mail: pinnie@ihb.ac.cn