李紅梅　朱聿元　韓華

摘 要：該研究建立了高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法測定大米粉中黃曲霉毒素B1含量的方法。色譜柱采用安捷倫C18柱（150mm×4.6mm，5μm），以甲醇[∶]水=40[∶]60為流動(dòng)相，采用熒光檢測器測定大米粉中黃曲霉毒素B1的含量。黃曲霉毒素B1的線性范圍為5～100ng/mL，檢出限為1ng/mL，平均加標(biāo)回收率為94.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.74%。該方法簡單、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適用于大米粉中黃曲霉毒素B1的定量分析。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1；高效液相色譜；柱后衍生；熒光檢測器

中圖分類號 TS272 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）15-0135-3

Abstract：A high performance liquid chromatography method for separation and determination of Aflatoxin B1 in rice meal was established. The analytical column was Agilent C18（150mm×4.6mm，5μm），the mobile phase was methanol-water（40∶60，V/V），the samples were determined by an fluorescence detector with post-column photochemical reaction. The calibration curves had good linearity in the range of 5～100ng /mL for Aflatoxin B1，the detection limit for Aflatoxin B1 was 1ng/mL，the average recoveries of RA were 94.6%（n=6，RSD=0.74%）.The method was a convenient，rapid and effective method for qualitatively analysis of Aflatoxin B1 in rice meal.

Key words：Aflatoxin B1；HPLC；Post-column derivatization；Fluorescence detector

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFTB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀1-3]。黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴(yán)重。黃曲霉毒素耐熱，280℃才可裂解，故一般烹調(diào)加工溫度下難以破壞。黃曲霉毒素B1是已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的分離方法有層析法[4-5]、酶聯(lián)免疫法[5-6]、液相色譜法[7-11]、液質(zhì)聯(lián)用法[12-17]等，其中高效液相色譜法由于具方法簡便、準(zhǔn)確等伏點(diǎn)而被廣泛采用。但由于黃曲霉毒素B1的紫外最大吸收波長為365nm，前處理麻煩，而免疫親和層析-柱后光化學(xué)衍生法能夠定量準(zhǔn)確，適用于食品中黃曲霉毒素B1含量的測定。因此，本研究應(yīng)用高效液相色譜-柱后衍生法對大米粉中黃曲霉毒素B1含量的測定進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（LGC公司）、大米粉（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供）；乙腈（色譜純），Tedia公司；實(shí)驗(yàn)用水，超純水；黃曲霉毒素B1免疫親和柱（美國beacon，3mL）。1200液相色譜-熒光檢測器，安捷倫公司；光化學(xué)衍生器（華安麥科）；Synergy超純水機(jī)，美國密理博公司；BSA224S電子天平，Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件選擇 色譜柱：安捷倫C8柱（150mm×4.6mm，5μm），安捷倫C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇：水=40[∶]60；熒光，激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長大于420nm；進(jìn)樣量10μL；流速0.8mL/min。色譜柱方面，實(shí)驗(yàn)選擇了C8和C18 柱，因?yàn)檫@2種種柱子做黃曲霉毒素B1比較常見，是分析實(shí)驗(yàn)中常用柱子。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素B1在C8柱子中分離效果不好，只有在C18柱子上能夠達(dá)到很好的分離。流動(dòng)相的選擇中，在甲醇[∶]水=40[∶]60時(shí)候，標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到很好的基線分離。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用流動(dòng)相溶解后定容至10mL容量瓶中，搖勻，該溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。準(zhǔn)確移取上述溶液并且用流動(dòng)相稀釋定容為5，10，20，50，100ng/mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液備用，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3 大米粉樣品制備 準(zhǔn)確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及甲醇-水（7+3）至125.0mL，以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取15.0mL濾液并加人30.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1～2次，至濾液澄清，備用。準(zhǔn)確移取15.0mL樣品提取液過美國beacon免疫親和柱，1.0mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系的考察 精密吸取AFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液10[μL]，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到回歸方程：y=0.776846x-0.530622，R2=0.99931。AFTB1在5～100ng/mL之間線性關(guān)系良好。并以信噪比等于3為標(biāo)準(zhǔn)，測得AFTB1的檢出限為1ng/mL。

2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液10[μL]重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積，并測定峰面積的平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，測定結(jié)果見表1。連續(xù)6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，精密度實(shí)驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.45%，本實(shí)驗(yàn)測定AFTB1精密度良好，具有良好的準(zhǔn)確度。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品約25g，精密加入AFTB1約3.5mg，按照1.2.3大米粉樣品制備樣品溶液，供液相色譜進(jìn)行AFTB1分析，外標(biāo)法定量。測定結(jié)果見表3。由表3中可知，回收率在93.5%～96.2%，平均回收率為94.6%，表明高效液相色譜-柱后衍生法檢測大米粉中AFTB1含量具有良好的準(zhǔn)確性。

2.5 樣品測定 取6批樣品按1.3.3方法制備樣品溶液，精密吸取樣品供試液10μL，AFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，分別注入高效液相色譜儀，以外標(biāo)法計(jì)算含量，見表4，樣品中AFTB1含量都在20.046以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74%。AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC色譜圖見圖2、圖3，從圖2和圖3可知，通過上述條件標(biāo)準(zhǔn)品和樣品都能夠達(dá)到很好的基線分離，出峰時(shí)間在7.159min左右，結(jié)果令人滿意。

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法測定大米粉中黃曲霉毒素B1含量，對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用安捷倫C18柱（150mm×4.6mm，5μm），以甲醇[∶]水=40[∶]60為流動(dòng)相分離效果較好，并對該條件了進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)方法的考察和實(shí)際樣品的測定，結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速，適用于大米粉中中黃曲霉毒素B1的含量測定。

參考文獻(xiàn)

[1]馬海華，孫楫周，甄彤，等.我國國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中黃曲霉毒素測定方法綜述[J].食品工業(yè)科技，2016（6）：360-366.

[2]王恒玲，喻理，李培武，等.二氧化硅-氧化石墨烯復(fù)合物固相萃取-高效液相色譜法檢測植物油中黃曲霉毒素 B1、B2[J].分析化學(xué)研究學(xué)報(bào)，2014，42（9）：1338-1342.

[3]蘇建國，劉洋，趙燕，等.甜面醬中黃曲霉毒素B1、B2檢測方法的研究[J].食品工業(yè)，2017，38（5）：304-306.

[4]高秀潔，鄧中平，焦紅，等.黃曲霉毒素B1快速檢測方法的研究進(jìn)展[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008，8（12）：1297-1300.

[5]柳其芳.酶聯(lián)免疫吸附法和薄層色譜法聯(lián)合分析黃曲霉毒素B1的研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2006，6（2）：246-248.

[6]董艾青，劉少文，柏凡，等.不同方法檢測霉菌毒素的比較研究[J].中國飼料，2017（4）：27-30.

[7]黎睿，謝剛，王松雪.高效液相色譜法同時(shí)檢測糧食中常見8種真菌毒素的含量[J].食品科學(xué)，2015，36（6）：206-210.

[8]馮靚，蔡增軒，譚瑩，等.HPLC同時(shí)測定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（3）：511-513.

[9]趙浩軍，王坤，楊衛(wèi)花，等.高效液相色譜柱后光化學(xué)反應(yīng)-熒光檢測茶葉中黃曲霉毒素B1[J].茶葉科學(xué)，2013，33（3）：237-241.

[10]郭金喜，遠(yuǎn)輝.超高效液相色譜法測定新疆巴旦木中黃曲霉毒素B1不確定度評定[J].釀酒科技，2017（5）：107-116

[11]胡佳薇，田麗，王敏娟，等.超高效液相色譜-大體積流通池?zé)晒夥z測食品中的4種黃曲霉毒素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2017，27（8）：1109-1130.

[12]王芹，杭學(xué)宇，宋鑫.農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，26（4）：482-485.

[13]李麗，黎睿，謝剛，等.全自動(dòng)免疫親和在線凈化/高效液相色譜法快速高通量測定飼料中黃曲霉毒素[J].分析測試學(xué)報(bào)，2017，36（6）：800-804.

[14]楊靜，哈益明，王鋒.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測花生中的黃曲霉毒素B1[J].分析試驗(yàn)室，2009，28（6）：35-38.

[15]王浩，楊紅梅，郭啟雷，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定植物油中苯并芘與黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2[J].分析測試學(xué)報(bào)，2014，33（8）：911-916.

[16]吳寒秋，許秀麗，楊曉宇，等.UHPLC-MS/MS法測定山銀花中黃曲霉毒素及其裂解規(guī)律[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2017，36（2）：235-240.

[17]宮小明，任一平，董靜，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定花生、糧油中18種真菌毒素[J].分析測試學(xué)報(bào)，2011，30（1）：6-12.

（責(zé)編：張宏民）