崔秀琴，張勱

? 論著 ?

泛素活化酶、端粒酶檢測(cè)在冠心病心力衰竭患者中的應(yīng)用價(jià)值

崔秀琴1，張勱1

目的 分析冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┬牧λソ呋颊邫z測(cè)胸腹水細(xì)胞中泛素活化酶（UBE1）、端粒酶的應(yīng)用價(jià)值。方法 選取2013年1月～2016年1月于新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科保存的57例胸腹水標(biāo)本，其中30例為冠心病心力衰竭，15例為冠心病（非心力衰竭，死因?yàn)轱B腦外傷或機(jī)械性損傷），12例正常對(duì)照（無(wú)心臟病史、無(wú)心臟器質(zhì)性病變、死因?yàn)轱B腦外傷或機(jī)械性損傷）。免疫組化染色檢測(cè)各組UBE1和端粒酶表達(dá)情況。結(jié)果 心力衰竭組UBE1免疫組化染色陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性比例明顯高于冠心病組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與冠心病組和正常對(duì)照組比較，心力衰竭組端粒酶免疫組化染色陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。心力衰竭組UBE1和端粒酶IOD值分別為1201.14（943.19～1672.31）和12 643.81（11 231.07～13 519.31），明顯高于冠心病組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論 冠心病心力衰竭患者胸腹水細(xì)胞中泛素活化酶、端粒酶表達(dá)明顯增強(qiáng)，二者在冠心病心力衰竭診斷中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

泛素活化酶E1；端粒酶；心力衰竭；冠心病

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┦怯晒跔顒?dòng)脈粥樣硬化引起，動(dòng)脈逐漸狹窄導(dǎo)致心臟缺氧和心肌功能障礙。糖尿病、高血壓、肥胖等都是該病的誘發(fā)因素，另外，冠心病的發(fā)作還與大量吸煙和飲酒，情緒激動(dòng)、飽食、體力活動(dòng)增加等有關(guān)。冠心病治療不當(dāng)會(huì)發(fā)展成心力衰竭。目前臨床常用的心肌損傷標(biāo)志物主要有心肌肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶、腦鈉肽等，但均存在一定局限性。因此，尋找能夠早期診斷冠心病心力衰竭的生物學(xué)指標(biāo)具有重要意義。研究表明[1,2]，泛素活化酶（UBE1）是廣泛存在于胸腹水細(xì)胞中的一種蛋白酶，在心力衰竭的早期即被激活，參與胸腹水細(xì)胞蛋白質(zhì)的降解過(guò)程，導(dǎo)致胸腹水細(xì)胞壞死。端粒酶由催化蛋白與RNA組成，也廣泛存在于胸腹水細(xì)胞中，其活性與細(xì)胞增殖及程序性死亡密切相關(guān)[3]。本研究選擇UBE1與端粒酶，觀察其在冠心病心力衰竭患者胸腹水中的表達(dá)變化，以探討其診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 選取標(biāo)本 選取2013年1月～2016年1月于新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科保存的57例胸腹水標(biāo)本，其中30例為冠心病心力衰竭，15例冠心?。ǚ切牧λソ?，死因?yàn)轱B腦外傷或機(jī)械性損傷），12例正常對(duì)照（無(wú)心臟病史，無(wú)心臟器質(zhì)性病變，死因?yàn)轱B腦外傷或機(jī)械性損傷）。

1.2 免疫組化檢測(cè)UBE1和端粒酶表達(dá) 將標(biāo)本制成4 μ m的石蠟切片，置于67℃的烘箱中，脫蠟置水。高壓修復(fù)抗原后冷卻至室溫，3%H2O2處理10 min。PBS沖洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)稀釋倍數(shù)的一抗（分別用淋巴瘤和乳腺癌陽(yáng)性片做梯度實(shí)驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果找出最佳稀釋濃度），放入4℃冰箱孵育過(guò)夜。PBS沖洗3次，每次5 min。滴加聚合物增強(qiáng)劑，37℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加酶標(biāo)二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗4次，每次5 min。DAB鏡檢顯色35 min，自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。UBEI以淋巴瘤陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照；端粒酶用乳腺癌陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。UBEI抗體購(gòu)自百奇生物科技公司，端粒酶抗體購(gòu)自北京中山生物公司，二步法試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 由2名檢驗(yàn)科技師采用雙盲法隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)UBE1和端粒酶的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分，參照Axiotis標(biāo)準(zhǔn)[4]，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%或染色強(qiáng)度不著色為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在10%～30%或染色強(qiáng)度為淡黃色為1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在31%～70%或染色強(qiáng)度為黃色為2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)70%或染色強(qiáng)度為棕黃色為3分?？偡?陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)+染色強(qiáng)度得分，陰性為0～1分，弱陽(yáng)性為2分，陽(yáng)性為3～4分，強(qiáng)陽(yáng)性為5～6分。圖像分析：用Olympus顯微鏡觀察各組切片，選出陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)，隨機(jī)選5個(gè)視野，用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對(duì)累積光密度（IOD）進(jìn)行測(cè)量，減去IOD背景，剩余值即可反映選定區(qū)域蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件，偏態(tài)分布資料采用M（Q1～Q3）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)/百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UBE1在各組的表達(dá)比較 心力衰竭組UBE1陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性比例明顯高于冠心病組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表1）。

2.2 端粒酶在各組的表達(dá)比較 與冠心病組和正常對(duì)照組比較，心力衰竭組端粒酶陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表2）。

2.3 各組UBE 1和端粒酶IOD值比較 心力衰竭組UBE 1和端粒酶IOD值分別為1201.14 （943.19～1672.31）和12 643.81（11 231.07～ 13 519.31），明顯高于冠心病組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表3）。

3 討論

近年來(lái)有關(guān)心力衰竭早期診斷標(biāo)記物的研究，主要有兩方面，一是胸腹水細(xì)胞內(nèi)蛋白的缺失，二是胸腹水細(xì)胞外成分在細(xì)胞內(nèi)的異常表達(dá)，但這些研究大部分來(lái)源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，假陽(yáng)性率較高[5]。急性心肌缺血可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)迅速降解，造成細(xì)胞壞死。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是蛋白質(zhì)降解的重要方式，UBE1是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的關(guān)鍵因素，能夠與泛素相結(jié)合，從而激活級(jí)聯(lián)的反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)的降解過(guò)程產(chǎn)生直接影響[6]。端粒酶能夠通過(guò)攜帶的RNA模板，合成端粒DNA添加至細(xì)胞染色體末端，填補(bǔ)DNA復(fù)制的缺陷，其活性水平的變化可影響細(xì)胞的增殖與死亡。大多數(shù)人體細(xì)胞端粒酶沒(méi)有活性或活性很低，而冠心病心力衰竭患者胸腹水細(xì)胞中卻高表達(dá)，提示其潛在的應(yīng)用價(jià)值。我們推測(cè)UBE1與端粒酶可能參與胸腹水細(xì)胞的死亡過(guò)程，在冠心病心力衰竭中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示，與冠心病組和正常對(duì)照組比較，心力衰竭組胸腹水細(xì)胞UBE1和端粒酶表達(dá)陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性比例明顯升高，提示胸腹水UBEI和端粒酶表達(dá)水平的升高可能為早期冠心病心力衰竭的診斷提供可靠的依據(jù)。UBE1廣泛存在于胸腹水細(xì)胞中[7]，冠心病心力衰竭患者UBE1升高的機(jī)制可能為：①在心肌缺血的情況下，低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)增加，而泛素-蛋白酶體是其主要降解途徑，因此，相應(yīng)上調(diào)[8]；②NF-κ B信號(hào)通路具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而泛素-蛋白酶體系統(tǒng)也參與激活NF-κ B的過(guò)程[9]。當(dāng)心肌缺血導(dǎo)致細(xì)胞壞死時(shí)，UBE1表達(dá)水平上升，啟動(dòng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，激活NF-κ B信號(hào)通路，抑制細(xì)胞進(jìn)一步凋亡[10]。端粒酶在保持基因完整性與細(xì)胞增殖能力方面具有重要作用，我們推測(cè)，在冠心病心力衰竭初期存活的細(xì)胞開(kāi)始自我修復(fù)進(jìn)程，因此端粒酶被激活，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖，參與組織修復(fù)。因此，端粒酶水平升高可能是冠心病心力衰竭早期診斷的敏感指標(biāo)。

表1 各組UBE1表達(dá)情況比較（n，%）

表2 各組端粒酶表達(dá)情況比較（n，%）

表3 各組UBE1和端粒酶IOD值比較

綜上所述，冠心病心力衰竭患者胸腹水細(xì)胞質(zhì)中UBE1、端粒酶表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示二者均參與了冠心病心力衰竭過(guò)程，并在診斷中具有重要潛在價(jià)值。

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本文編輯：姚雪莉

Application values of detection of ubiquitin activating enzyme E1 and telomerase to heart failure of coronary heart disease

Cui Xiuqin*, Zhang Mai.*Department of Clinical Laboratories, First People's Hospital of Xinxiang City, Henan Province, Xinxiang 453000, China.

Objective To analyze the application values of detection of ubiquitin activating enzyme E1 (UBE1) and telomerase in pleural-peritoneal fluid cells in patients with heart failure of coronary heart disease (CHD). Methods The samples of pleural-peritoneal fluid from 57 patients saved in the Department of Clinical Laboratories of the First People’s Hospital of Xinxiang City were chosen from Jan. 2013 to Jan. 2016. All samples were divided into heart failure group (n=30) collected from the patients with grades from Ⅲ to Ⅳ coronary stenosis (excluding other death causes), CHD group (n=15) from the patients with grades from I to Ⅳ coronary stenosis (without heart failure, and death causes being craniocerebral trauma or mechanical injury) and normal control group (n=12) from the patients without heart disease history and cardiac organic lesions, and death causes being craniocerebral trauma or mechanical injury. The expressions of UBE1 and telomerase were detected by using immunohistochemistry staining method in all groups. Results The percentages of UBE1 with positive and strongly positive immunohistochemistry staining were significantly higher in heart failure group than those in CHD group and normal control group (all P<0.05). The percentages of telomerase with positive and strongly positive immunohistochemistry staining increased significantly in heart failure group compared with CHD group and normal control group (all P<0.05). The value of integral optical density (IOD) of UBE1 was 1201.14 (943.19～1672.31) and that of telomerase was 12 643.81 (11 231.07～13 519.31) in heart failure group, which were significantly higher than those in CHD group and normal control group (all P<0.05). Conclusion The expressions of UBE1 and telomerase increase significantly in pleural-peritoneal fluid cells in patients with CHD heart failure, and they have potential application values in diagnosis of CHD heart failure.

Ubiquitin activating enzyme E1; Telomerase; Heart failure; Coronary heart disease

R541.61

A

1674-4055(2017)07-0856-03

1453000 新鄉(xiāng),河南省新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.07.27