趙肖涯，陸仲夏，杜麗君，梁浩威，陳宜濤

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

雷丸蛋白pPeOp誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡機(jī)制研究

趙肖涯，陸仲夏，杜麗君，梁浩威，陳宜濤

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

目的探究雷丸蛋白pPeOp誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡機(jī)制。方法采用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的pPeOp(30、60、90 mg·L-1)對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的活性抑制和凋亡誘導(dǎo)作用；qRT-PCR和Western blot檢測(cè)死亡受體通路和線粒體通路TNF-R1、Fas/FasL、Bcl-2、caspase-3、caspase-8的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果CCK-8結(jié)果顯示，與Control組相比，陰性對(duì)照聚乙烯吡咯烷酮(PVP)組細(xì)胞存活率差異無(wú)顯著性；陽(yáng)性對(duì)照5-氟尿嘧啶(5-Fu)組細(xì)胞存活率為(53.71±7.34)%，存活率明顯下降(P<0.05)；30、60、90 mg·L-1的 pPeOp組細(xì)胞存活率分別為(80.95±6.25)%、(53.48±5.70)%、(44.61±6.50)%，存活率降低且與濃度呈負(fù)相關(guān)(r=0.984，P=0.016)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，PVP組與Control組相比差異無(wú)顯著性，5-Fu組細(xì)胞凋亡率為(39.30±3.34)%(P<0.05)，30、60、90 mg·L-1pPeOp組細(xì)胞凋亡率分別為(10.90±1.25)%、(28.80±2.70)%、(32.00±3.50)%，差異存在顯著性(P<0.05)。TNF-R1、Fas/FasL、caspase-3及caspase-8的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，差異存在顯著性(P<0.05)；Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異存在顯著性(P<0.05)。結(jié)論pPeOp能明顯抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，死亡受體通路和線粒體通路與pPeOp誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡有關(guān)。

凋亡；caspases；胃癌；SGC-7901；線粒體通路；死亡受體通路；雷丸

胃癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，每年全球10萬(wàn)人中有13 860人患胃癌，發(fā)病率居惡性腫瘤第4位，死亡率居第2位[1]。目前，胃癌的治療主要以手術(shù)及放化療為主，但其復(fù)發(fā)率高。細(xì)胞凋亡異常、過(guò)度增殖是胃癌發(fā)生的機(jī)制之一[2]。因此，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡是胃癌治療的重要方向。細(xì)胞凋亡是由多種癌基因、抑癌基因及細(xì)胞因子共同調(diào)控的結(jié)果[3]。研究藥物靶向調(diào)控相關(guān)分子表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤治療具有重要的臨床意義。

中醫(yī)藥具有數(shù)千年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，其在抗腫瘤、減毒增效、預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面具有明顯的效果[4-6]，可有效改善患者的生存質(zhì)量。雷丸(OmphalialapidescensSchroet)是我國(guó)常用傳統(tǒng)驅(qū)蟲(chóng)中藥，主要用于驅(qū)除蛔蟲(chóng)、絳蟲(chóng)和鉤蟲(chóng)等[7]。尚有研究報(bào)道，雷丸還具備較好的抗腫瘤作用[8-9]，中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)已經(jīng)批準(zhǔn)了雷丸片和雷丸膠囊作為治療腫瘤的輔助用藥[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)室前期從雷丸中分離純化得到了一種含量豐富的小分子抗腫瘤蛋白pPeOp(purified PVP-extractedOmphalialapideacensprotein)，研究證明其對(duì)人胃癌細(xì)胞有較好的凋亡誘導(dǎo)作用和直接殺傷作用，而對(duì)正常胃黏膜細(xì)胞無(wú)毒副作用[9，12]。本文將通過(guò)研究pPeOp對(duì)死亡受體通路和線粒體通路的影響，探究其誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的分子機(jī)制。

1 材料

1.1細(xì)胞與藥物人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞株，浙江省疾病控制預(yù)防中心提供；雷丸購(gòu)自方回春堂；聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)購(gòu)自Biosharp；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)購(gòu)自Sigma。

1.2試劑與儀器Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞裂解液、GAPDH抗體(鼠抗人)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、ECL反應(yīng)液，均購(gòu)自碧云天；兔抗人Bcl-2、TNF-R1、Fas/FasL、caspase-3和caspase-8抗體，均購(gòu)自Cell Signaling Technology；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自聯(lián)科生物；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo；相關(guān)基因引物均購(gòu)自生工生物工程股份有限公司；SYBR Green?Premix Ex TaqTM購(gòu)自TaKaRa。流式細(xì)胞儀(Beckman FC500)；熒光定量PCR儀(型號(hào)：Eppendorf Realplex 4)；冷凍離心機(jī)(型號(hào)：5417R，Eppendorf)。

2 方法

2.1雷丸蛋白pPeOp的分離純化按Chen等[9]方法分離純化雷丸蛋白pPeOp。以小牛血清體積分?jǐn)?shù)為0.05的RPMI 1640培養(yǎng)液配制30、60、90 mg·L-13個(gè)終濃度備用。以90 mg·L-1PVP提取液為陰性對(duì)照組，100 mg·L-15-Fu為陽(yáng)性對(duì)照組。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞SGC-7901，以1×104個(gè)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h；設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，加藥培養(yǎng)24 h；每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育1 h，于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，以1×106個(gè)接種于6孔板，培養(yǎng)24 h；加藥培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞懸液，離心棄上清，加2 mL冷的PBS洗滌，加1 mL 1×Binding buffer重懸，吸取100 μL上述液于離心管中，每管加5 μL FITC Annexin V和5 μL PI；微離心，25℃避光孵育15 min；每管加400 μL 1×Binding buffer，1 h內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.4qRT-PCR檢測(cè)死亡受體通路和線粒體通路相關(guān)基因表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，以1×106個(gè)接種于6孔板，培養(yǎng)24 h；加藥培養(yǎng)24 h，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA；用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，半定量分析基因mRNA表達(dá)水平。通過(guò)CT值比較反映相應(yīng)基因mRNA表達(dá)量的高低。引物序列見(jiàn)Tab 1。

2.5Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，以1×106個(gè)接種于6孔板，培養(yǎng)24 h；加藥培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞懸液，離心棄上清；2 mL PBS清洗細(xì)胞，加200 μL含PMSF的裂解液，冰上裂解10 min；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，繼續(xù)裂解25 min，每10 min彈1次；4℃ 12 000 r·min-1離心15 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后移入封閉液，室溫封閉2 h；TBST洗滌3次，4℃一抗孵育過(guò)夜，用TBST洗膜3次；室溫二抗孵育2 h，用TBST再次洗膜3次。用ECL發(fā)光后，在暗室中進(jìn)行膠片顯影。

Tab 1 qRT-PCR primer sequence

3 結(jié)果

3.1SGC-7901細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化給藥培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察，各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為：Control組與PVP組細(xì)胞形態(tài)正常，呈梭形，排列緊密；5-Fu組細(xì)胞形態(tài)異常，排列疏松，少數(shù)細(xì)胞懸浮。pPeOp作用于細(xì)胞后，細(xì)胞貼壁情況下降、增殖受抑、數(shù)目減少、形態(tài)變圓甚至破裂，且隨著藥物濃度的增加，圓形細(xì)胞數(shù)逐漸增多(Fig 1)。

Fig 1 Effect of pPeOp on morphology of SGC-7901 cells

3.2pPeOp對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901活性的抑制作用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，與Control組相比，不同濃度pPeOp(30、60、90 mg·L-1)作用于SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞存活率明顯降低，分別為(80.95±6.25)%(P<0.05)、(53.48±5.70)%(P<0.01)、(44.61±6.50)%(P<0.01)，PVP組和5-Fu組分別為(99.72±6.48)%、(53.71±7.34)%(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pPeOp對(duì)SGC-7901細(xì)胞的活性具有明顯的抑制作用，并與濃度呈正相關(guān)性(r=0.984，P=0.016)。見(jiàn)Fig 2。

3.3pPeOp對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響Fig 3流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示， pPeOp作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后，30、60、90 mg·L-1組總凋亡率分別為(10.90±1.25)%、(28.80±2.70)%、(32.00±3.50)%，相比Control組均明顯上升(P<0.01)。PVP組則無(wú)明顯變化，5-Fu組總凋亡率為(39.30±3.34)%，與Control組差異存在顯著性(P<0.01)。結(jié)果提示，pPeOp對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901具有明顯的促凋亡作用。

Fig 2 Effect of pPeOp on cell viability of SGC-7901 cells

3.4pPeOp對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901死亡受體通路的影響Fig 4A結(jié)果顯示，藥物處理組Fas/FasL和TNF-R1 mRNA表達(dá)水平較Control組明顯上調(diào)，并與濃度呈正相關(guān)性(FasL：r=0.986，P=0.014；TNF-R1：r=0.928，P=0.032)；蛋白表達(dá)水平較Control組也明顯上調(diào)，并與濃度呈正相關(guān)性(FasL：r=0.917，P=0.043；TNF-R1：r=0.957，P=0.041)，見(jiàn)Fig 4B。結(jié)果提示，pPeOp對(duì)細(xì)胞死亡受體通路信號(hào)傳導(dǎo)具有一定的調(diào)控作用。

3.5pPeOp對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901線粒體通路的影響Fig 5的qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，30 mg·L-1pPeOp組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平較Control組表達(dá)無(wú)變化，60、90 mg·L-1pPeOP組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平較Control組表達(dá)下調(diào)，且與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)(r=0.935，P=0.034)；蛋白表達(dá)水平較Control組也明顯下調(diào)。結(jié)果表明，pPeOp通過(guò)下調(diào)促癌蛋白Bcl-2的表達(dá)，參與了線粒體通路信號(hào)傳導(dǎo)。

3.6pPeOp對(duì)caspase蛋白表達(dá)的影響Fig 6結(jié)果顯示，與Control組相比，pPeOp組caspase-3的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，caspase-8的mRNA表達(dá)在30、60 mg·L-1組無(wú)變化，在90 mg·L-1組表達(dá)上調(diào)；caspase-3及caspase-8的蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)，且caspase-8的蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)性(r=0.993,P=0.02)。

4 討論

細(xì)胞凋亡是一種ATP依賴(lài)性的并由細(xì)胞嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡[13]。在正常情況下，機(jī)體通過(guò)細(xì)胞凋亡來(lái)消除體內(nèi)過(guò)量、冗余和其它不健康細(xì)胞以維持機(jī)體的平衡和穩(wěn)定。而在胃癌細(xì)胞中，這一平衡被打破，抗凋亡基因明顯上調(diào)，促凋亡基因明顯下調(diào)，細(xì)胞凋亡被抑制，細(xì)胞過(guò)度增殖[14]。因此，研究腫瘤細(xì)胞凋亡的基本機(jī)制，尋找特異性藥物靶向抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。

Fig 3 Effect of pPeOp on apoptosis rate of SGC-7901 cells

根據(jù)凋亡信號(hào)的來(lái)源可將凋亡途徑分為兩條[15]：死亡受體途徑(即外源性途徑)和線粒體途徑(即內(nèi)源性途徑)。死亡受體途徑由TNF超家族成員與其相對(duì)應(yīng)的TNFR超家族成員特異結(jié)合[16]，活化胞質(zhì)中銜接分子(adapter molecule)，如FADD、TRADD等，招募活化caspase-8等蛋白質(zhì)形成死亡復(fù)合體，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TNF超家族成員包括Fas、TNF-α、TRAIL等配基；TNFR超家族成員包括FasL、TNFRI、TRID等。線粒體途徑中最重要的調(diào)控因子是Bcl-2家族蛋白[17-18]，其中包括抗凋亡因子(Bcl-2、Bcl-X、Mcl-1等)、促凋亡因子(Bax、Bak等)和只含BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白(Bim、Bid等)。促凋亡蛋白與線粒體外膜結(jié)合，細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞質(zhì)，細(xì)胞色素C與Apaf-1、caspase-9前體、ATP / dATP形成凋亡體(alxzome)，招募并激活caspase-3、caspase-7，進(jìn)而引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。除細(xì)胞色素C 外，線粒體還可通過(guò)釋放Smac/DIABLO、Omi/HtrA2、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)和EndoG等，誘導(dǎo)非caspase依賴(lài)的DNA斷裂?；罨腸aspase-8還可以通過(guò)切割胞質(zhì)內(nèi)Bid，產(chǎn)生tBid，移位至線粒體，使Bak和Bax寡聚體化形成孔隙，以利于細(xì)胞色素C從線粒體釋放，并級(jí)聯(lián)放大caspase激活后的下游信號(hào)。Bcl-2和Bcl-XL通過(guò)抑制細(xì)胞色素C的釋放和阻止Bak、Bax蛋白的移位，從而發(fā)揮其抗凋亡作用。雖然兩條凋亡途徑上游事件不同，但是他們最終激活的凋亡效應(yīng)物相同，即caspase[20]。

本研究結(jié)果顯示，pPeOp蛋白可明顯抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)活性并誘導(dǎo)其凋亡。主要表現(xiàn)為：與Control組相比，pPeOp蛋白作用后，細(xì)胞出現(xiàn)排列疏松，呈圓形或團(tuán)塊狀，貼壁數(shù)目明顯減少等細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；細(xì)胞的凋亡率檢測(cè)結(jié)果也呈現(xiàn)較高水平。結(jié)合qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果分析， TNF-R1、Fas/FasL、caspase-3、caspase-8 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加；Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，與細(xì)胞的凋亡有關(guān)，并且與藥物呈劑量依賴(lài)性。以上結(jié)果表明，pPeOp可能通過(guò)激活死亡受體通路和線粒體通路中相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。pPeOp對(duì)死亡受體通路和線粒體通路其它相關(guān)蛋白的調(diào)控，有待進(jìn)一步研究。

Fig 4 Effect of pPeOp on expression levels of Fas/FasL and TNF-R1

Fig 5 Effect of pPeOp on expression levels of Bcl-2

Fig 6 Effect of pPeOp on expression levels of caspase-3 and caspase-8

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ApoptosismechanismofgastriccancercellSGC-7901inducedbyOmphalialapidescensproteinpPeOp

ZHAO Xiao-ya, LU Zhong-xia, DU Li-jun, LIANG Hao-wei, CHEN Yi-tao
(CollegeofLifeScience,ZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310053,China)

AimTo investigate the apoptosis mechanism of human gastric cancer cell SGC-7901 induced byOmphalialapidescensprotein pPeOp.MethodsCCK-8 and flow cytometry were used to detect the inhibitory effect of different concentrations of pPeOp(30, 60, 90 mg·L-1) on SGC-7901. The mRNA and protein expression of TNF-R1, Fas/FasL, Bcl-2, caspase-3 and caspase-8 were detected by qRT-PCR and Western blot.ResultsSGC-7901 cells were treated with different concentrations of pPeOp(30, 60, 90 mg·L-1) for 24 h. CCK-8 test showed that there was no significant difference between PVP group and the control group. The survival rate of the 5-Fu group was(53.71±7.34)% (P<0.05). The survival rates of pPeOp group(30, 60, 90 mg·L-1) were(80.95±6.25)%, (53.48±5.70)% and(44.61±6.50)%(r=0.984,P=0.016),respectively. Flow cytometry showed that the apoptosis rate of PVP group had no significant difference with control group, and the apoptosis rate of 5-Fu group was about(39.30±3.34)%(P<0.05). The apoptotic rates of pPeOp group(30, 60, 90 mg·L-1) were(10.90±1.25)%, (28.80±2.70)% and (32.00±3.50)%,respectively(P<0.05). The mRNA and protein expression levels of Bcl-2 were down-regulated,whereas the expression of TNF-R1, Fas/FasL, caspase-3 and caspase-8 were significantly up-regulated(P<0.05).ConclusionspPeOp can significantly inhibit the proliferation of gastric cancer cell line SGC-7901 and induce apoptosis in a dose-dependent manner. Death receptor pathway and mitochondrial pathway may be related to pPeOp-induced apoptosis of gastric cancer SGC-7901.

apoptosis; caspases; gastric cancer; SGC-7901; mitochondrial apoptosis pathway; death receptor apoptosis pathway;Omphalialapidescens

時(shí)間：2017-8-20 16:47 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.034.html

2017-06-10,

2017-07-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81374023)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No Y207765)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目(No 2016R410039)

趙肖涯(1995-)，女，研究方向：抗腫瘤藥用真菌，E-mail: 17826865936@163.com； 陳宜濤(1977-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：抗腫瘤藥用真菌，通訊作者，E-mail: cytworld@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.017

A

：1001-1978(2017)09-1271-07

R282.71；R329.25；R392.11；R735.202.2；R977.6；R979.1