王文文，張 賽，朱曉卉，仇欣然，馬中軒，申夢(mèng)麗，劉星宇，鐘雅男，張 瀟，印曉星，魯 茜

(徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省新藥研究與臨床應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004)

桑葉總黃酮對(duì)1型糖尿病小鼠腎間質(zhì)纖維化的防治作用及機(jī)制

王文文，張 賽，朱曉卉，仇欣然，馬中軒，申夢(mèng)麗，劉星宇，鐘雅男，張 瀟，印曉星，魯 茜

(徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省新藥研究與臨床應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004)

目的觀察桑葉總黃酮對(duì)1型糖尿病小鼠腎間質(zhì)纖維化的防治作用及其可能機(jī)制。方法采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)150 mg·kg-1制備糖尿病小鼠模型，造模成功后分為模型組、桑葉總黃酮低(0.25 g·kg-1)、中(0.5 g·kg-1)、高(1 g·kg-1)劑量組各10只，另設(shè)正常對(duì)照組8只。每日灌胃1次，連續(xù)給藥12周后，測(cè)定各組小鼠空腹血糖(FBG)、血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿微量白蛋白(mAlb)；Masson染色、天狼星紅(Sirus red)染色以及IV型膠原蛋白(collagen Ⅳ)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠腎皮質(zhì)中膠原蛋白表達(dá)；層黏連蛋白(laminin)染色評(píng)估小鼠腎小球及腎小管基底膜的增厚程度。Western blot 檢測(cè)小鼠腎皮質(zhì)中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR的相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果中、高劑量的桑葉總黃酮能夠明顯降低糖尿病小鼠血糖、血清肌酐、尿素氮及尿微量白蛋白水平，并通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活，增加上皮型標(biāo)志物E-cadherin，降低間質(zhì)型標(biāo)志物α-SMA的蛋白表達(dá)，改善腎臟組織的病理形態(tài)變化。結(jié)論中、高劑量桑葉總黃酮能減輕1型糖尿病小鼠腎間質(zhì)纖維化水平，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活有關(guān)。

桑葉總黃酮；糖尿病腎??；腎間質(zhì)纖維化；腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化；磷酸肌醇-3激酶；蛋白激酶B；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，主要的病理特征為腎纖維化，其中占據(jù)整個(gè)腎臟體積90%的腎間質(zhì)纖維化是決定DN進(jìn)展的關(guān)鍵因素[1]。腎小管上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制之一。在各種致纖維化因子的作用下，腎小管上皮細(xì)胞逐漸失去上皮細(xì)胞表型，并獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，導(dǎo)致腎小管基底膜破壞，并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，最終引起腎間質(zhì)纖維化[2]。由此可見(jiàn)，腎小管EMT在DN腎纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。因此，深入探討腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制，對(duì)于探尋延緩DN病理進(jìn)程的藥物作用靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)DN的防治藥物具有非常重要的意義。

DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，高血糖被認(rèn)為是DN形成過(guò)程中的主要始動(dòng)因子。在高血糖的長(zhǎng)期刺激下，細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子激活，最終導(dǎo)致靶器官的損害。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是生長(zhǎng)因子受體超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要激酶。PI3K激活后可以促進(jìn)下游蛋白激酶B(Akt)的磷酸化激活，活化的Akt與PI3K一同促進(jìn)下游靶蛋白的磷酸化，參與調(diào)控細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，與惡性腫瘤、糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K/Akt通路下游的重要效應(yīng)蛋白[5]。在多種慢性腎臟疾病中，mTOR的激活可促使腎臟出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚及腎間質(zhì)纖維化，促進(jìn)蛋白尿的形成。雷帕霉素作為mTOR的特異性抑制劑，無(wú)論對(duì)1型還是2型糖尿病動(dòng)物模型，均可減輕早期DN的腎臟或腎小球的肥大，阻止系膜細(xì)胞的延伸、遷移，改善腎臟纖維化[6-7]。然而，由于其具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，大大限制了雷帕霉素作為防治DN藥物的臨床應(yīng)用。因此，從阻斷PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的角度，開(kāi)發(fā)抑制腎間質(zhì)纖維化的DN防治藥物將成為可能性較強(qiáng)的新思路。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物能促進(jìn)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，抑制血管發(fā)生和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。黃酮在發(fā)揮藥理作用的機(jī)制之一正是通過(guò)抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C、PI3K的活性實(shí)現(xiàn)的。本課題組長(zhǎng)期從事糖尿病并發(fā)癥的藥物防治研究，結(jié)果證實(shí)以黃酮類為主要成分的銀杏葉提取物能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激以及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，改善腎小球肥大、細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，以及腎間質(zhì)的纖維化，對(duì)糖尿病引起的腎損害具有較好的保護(hù)作用[8-9]。那么，同樣以黃酮類為主的桑葉總黃酮是否對(duì)DN也具有同樣的藥理作用，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)一次性腹腔注射鏈脲佐菌素法建立在體1型糖尿病小鼠模型，觀察桑葉總黃酮對(duì)小鼠的血糖、腎功能、腎臟病理變化的影響，并對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行測(cè)定，闡明桑葉總黃酮對(duì)腎間質(zhì)纖維化的防治作用及機(jī)制，為進(jìn)一步研發(fā)有效的糖尿病防治藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.1材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康♂KM小鼠，體質(zhì)量18 ～ 22 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SCXK(滬)2013-0016。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.1.2藥物與試劑 桑葉總黃酮(上海博蘊(yùn)生物有限公司，批號(hào)：ZL150306)，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：S0130)，葡萄糖試劑盒(上海榮盛生物科技有限公司，貨號(hào)：361500)，肌酐試劑盒(南京建成生物研究所，貨號(hào)：C011-2)，尿素氮試劑盒(南京建成生物研究所，貨號(hào)：C013-2)，尿微量白蛋白試劑盒(上海古朵生物科技有限公司，貨號(hào)：GD-VN9853)，Masson三色染色試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：16071)，天狼星紅染色試劑盒(上海博古生物科技有限公司，貨號(hào)：C035-2)?？贵wLaminin(貨號(hào)：ab11575)、Collagen IV(貨號(hào)：ab6586)、α-SMA(貨號(hào)：ab32575)和PI3K(貨號(hào)：ab86714)均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，抗體p-mTOR(Ser2448)(貨號(hào)：5536)、mTOR(貨號(hào)：2983)、E-cadherin(貨號(hào)：3195)購(gòu)于美國(guó)CST公司，抗體β-actin(貨號(hào)：AP0060)、Akt(貨號(hào)：BS1810)和phospho-Akt(Ser473)(貨號(hào)：BS4007)購(gòu)于Bioworld公司。

1.1.3儀器 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司，5804R)，電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司，AL104)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司，Elx808)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司，IX53)，雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司，odyssey Sa 700，800雙通道)，SDS-PAGE電泳裝置、電轉(zhuǎn)移裝置及分析系統(tǒng)為Bio-Rad產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1模型建立 采用單次大劑量150 mg·kg-1腹腔注射STZ建立1型糖尿病小鼠模型，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組(N)，STZ注射3 d后進(jìn)行空腹血糖監(jiān)測(cè)，將空腹血糖水平>13.9 mmol·L-1作為模型建立成功的依據(jù)。

1.2.2動(dòng)物分組 將1型糖尿病模型成功小鼠隨機(jī)分為4組：模型組灌胃給予溶劑對(duì)照(DM)；灌胃給予桑葉總黃酮0.25 g·kg-1劑量組(ML)；灌胃給予桑葉總黃酮0.5 g·kg-1劑量組(MM)；灌胃給予桑葉總黃酮1 g·kg-1劑量組(MH)；N組灌胃給予溶劑對(duì)照。每日給藥1次，連續(xù)灌胃給藥12周后，處理動(dòng)物進(jìn)行取材。

1.2.3血清肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白的測(cè)定 在給藥12周后，隨機(jī)收集尿液，利用ELISA方法測(cè)定尿微量白蛋白的含量。摘眼球取血，3 000×g離心15 min，分離血清后測(cè)定血清肌酐、尿素氮。

1.2.4腎臟形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察 取小鼠腎臟常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片4 μm，進(jìn)行Masson、Sirus red染色和IV型膠原、層黏連蛋白的免疫組織化學(xué)染色觀察。

1.2.5Western blot 法檢測(cè)腎皮質(zhì)組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 稱取50～100 mg腎皮質(zhì)組織，加入0.5～1 mL RIPA組織裂解液(1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1Na3VO4、20 mmol·L-1NaF)，用組織勻漿機(jī)在冰浴中勻漿，并在冰上裂解30 min。吸出并置于冰上裂解30 min。將組織勻漿液于4℃、12 000×g離心15 min。吸出上清，并用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定樣本中蛋白濃度。等量的樣品經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜、3%封閉液封閉1～2 h，分別進(jìn)行一抗孵育4℃過(guò)夜，二抗室溫避光孵育1 h，清洗后拍照。蛋白表達(dá)水平用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1小鼠一般情況小鼠造模后，出現(xiàn)多飲、多食、多尿及體質(zhì)量減輕。在實(shí)驗(yàn)期間，模型組和高劑量組，各有2只小鼠死亡；低劑量和中劑量組，各有3只小鼠死亡，系死于糖尿病，與灌胃、桑葉總黃酮無(wú)關(guān)。

2.2桑葉總黃酮對(duì)小鼠血糖、體質(zhì)量的影響由Tab 1可知，DM小鼠的空腹血糖明顯高于正常小鼠(P<0.01)，而DM小鼠的體質(zhì)量明顯低于正常小鼠(P<0.01)。給予桑葉總黃酮低、中、高劑量12周后，與模型組相比，3個(gè)劑量桑葉總黃酮的空腹血糖均有所下降(P<0.05或P<0.01)，而對(duì)體質(zhì)量無(wú)明顯影響(P>0.05)。

Tab 1 Effects of total flavonoid from Mori folium on FBG and body weight in diabetic mice(±s)

**P<0.01vsN;#P<0.05,##P<0.01vsDM

Tab 2 Effects of total flavonoid from Mori folium on kidney index,Cr, BUN and mAlb in diabetic mice(±s)

*P<0.05,**P<0.01vsN;##P<0.01vsDM

2.3桑葉總黃酮對(duì)糖尿病小鼠腎功能的影響腎重指數(shù)(kidney index)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和尿微量白蛋白(mAlb)是反映腎功能的重要指標(biāo)。Tab 2結(jié)果顯示，糖尿病小鼠用桑葉總黃酮治療12周后，與正常組小鼠相比，模型組小鼠在飼養(yǎng)12周后腎指數(shù)、Cr、BUN以及mAlb總量均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，中、高劑量桑葉總黃酮可以明顯降低糖尿病小鼠腎指數(shù)(P<0.01)，且3個(gè)劑量桑葉總黃酮均可降低糖尿病小鼠Cr、BUN以及mAlb水平(P<0.01)，從而發(fā)揮改善腎功能的作用。

2.4桑葉總黃酮對(duì)糖尿病小鼠腎纖維化的影響為了觀察桑葉總黃酮對(duì)糖尿病小鼠腎纖維化的影響，我們使用腎臟切片的Masson染色、天狼星紅染色以及IV型膠原免疫組化染色，評(píng)估小鼠的腎纖維化水平。如Fig 1A、1B顯示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠腎臟切片中腎小球及腎間質(zhì)區(qū)域Masson和天狼星紅染色陽(yáng)性區(qū)域面積明顯增多(P<0.01)，表明糖尿病小鼠腎臟中膠原蛋白沉積增多。給予桑葉總黃酮后可以不同程度地減少膠原蛋白的沉積(P<0.05或P<0.01)。對(duì)腎臟切片中的Ⅳ型膠原免疫組織化學(xué)研究結(jié)果(Fig 2A)顯示，糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中IV型膠原表達(dá)增多(P<0.01)，低、中、高劑量的桑葉總黃酮可以降低糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中Ⅳ型膠原的表達(dá)(P<0.01)，從而減輕了小鼠腎纖維化的程度。

層黏連蛋白(laminin)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。我們運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法來(lái)評(píng)估糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)的水平。與正常組相比，在糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中，尤其是在腎小管基底膜以及腎小管間質(zhì)區(qū)域，層黏連蛋白表達(dá)增多(P<0.01,Fig 2B)。各濃度的桑葉總黃酮治療組的小鼠都表現(xiàn)出層黏連蛋白沉積的減少(P<0.01)。以上結(jié)果表明桑葉總黃酮可以改善糖尿病所致的小鼠間質(zhì)纖維化。

2.5桑葉總黃酮對(duì)糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中E-cadherin以及α-SMA蛋白表達(dá)的影響腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是腎間質(zhì)纖維化的早期過(guò)程，為了進(jìn)一步證實(shí)桑葉總黃酮對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用，我們檢測(cè)了腎皮質(zhì)中EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況。與正常組小鼠相比，模型組小鼠腎皮質(zhì)中上皮細(xì)胞表型蛋白E-cadherin表達(dá)減少(P<0.05)，中、高劑量的桑葉總黃酮可以有效逆轉(zhuǎn)此變化(P<0.05,Fig 3A)。模型組小鼠間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白α-SMA與正常對(duì)照組相比，表達(dá)明顯增多(P<0.01)，低、中、高劑量組桑葉總黃酮均可逆轉(zhuǎn)此變化(P<0.05或P<0.01，F(xiàn)ig 3B)。以上結(jié)果表明，桑葉總黃酮可以改善糖尿病狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。

2.6桑葉總黃酮對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響為了探討桑葉總黃酮改善腎間質(zhì)纖維化的分子機(jī)制，我們觀察了糖尿病狀態(tài)下PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的變化，以及桑葉總黃酮對(duì)該信號(hào)通路中PI3K的蛋白表達(dá)及Akt和mTOR的磷酸化水平的影響。與正常組小鼠相比，糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中PI3K的蛋白表達(dá)、Akt及mTOR的磷酸化水平均明顯增高(P<0.01)，表明糖尿病狀態(tài)下小鼠腎皮質(zhì)中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被激活。給予桑葉總黃酮干預(yù)后我們發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的桑葉總黃酮可以明顯降低糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中PI3K的蛋白表達(dá)(P<0.05)；同時(shí)低、中、高3個(gè)劑量的桑葉總黃酮均可以降低糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中Akt及mTOR的高磷酸率(P<0.05或P<0.01)(Fig 4A～4C)。以上結(jié)果表明，中、高劑量桑葉總黃酮可以抑制糖尿病狀態(tài)下小鼠腎皮質(zhì)中PI3K/Akt/mTOR的激活。

Fig 1 Effects of total flavonoid from Mori folium ondegree of collagen deposition in renal cortex ofdiabetic mice

Fig 2 Effects of total flavonoid from Mori foliumon degree of renal fibrosis in diabetic mice

Fig 3 Effect of total flavonoid fromMori folium on expression of E-cadherin and α-SMAin renal cortex of diabetic mice(±s,n=6)

3 討論

?？浦参?Morus alba L.)的藥材——桑葉是一種干燥葉，其有效成分主要為總生物堿、總黃酮及多糖類等，其中桑葉的莖葉中黃酮類化合物含量較高[10]。韓國(guó)和日本學(xué)者已經(jīng)從桑葉中分離出9種類黃酮，包括蕓香苷、槲皮素、異槲皮苷、槲皮素-3-三葡糖苷等化合物，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等廣泛的藥理作用[11-12]。由于其許多藥理作用皆與DN發(fā)病環(huán)節(jié)相關(guān)，我們對(duì)其進(jìn)行了初步的研究。在本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病小鼠經(jīng)每日給藥1次，連續(xù)灌胃低、中、高劑量[13]桑葉總黃酮12周后，中、高劑量組可有效降低糖尿病小鼠血糖、腎重指數(shù)、血清肌酐、尿素氮以及尿微量白蛋白，提示其對(duì)糖尿病引起的腎功能損害具有一定的保護(hù)作用。

膠原蛋白和層黏連蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。為了觀察糖尿病小鼠腎纖維化的嚴(yán)重程度，我們采用Masson染色、Sirus red染色和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中膠原的生成情況。糖尿病小鼠飼養(yǎng)12周后，腎小球及腎小管間質(zhì)區(qū)域膠原蛋白，尤其是IV型膠原蛋白的沉積增多，并且存在層黏連蛋白的表達(dá)增多。桑葉總黃酮的治療不僅對(duì)糖尿病小鼠血糖、腎重指數(shù)、腎功能有所改善，而且還可以減少腎小球及腎小管間質(zhì)的膠原纖維的蓄積，降低層黏連蛋白的表達(dá)，減緩腎纖維化的進(jìn)程。

考慮到腎小管EMT是導(dǎo)致腎纖維化的重要機(jī)制之一，我們推測(cè)，在糖尿病腎病小鼠中，桑葉總黃酮可能通過(guò)抑制EMT過(guò)程，從而改善腎功能，并延緩腎纖維化的發(fā)生與發(fā)展。對(duì)此，我們對(duì)小鼠腎皮質(zhì)中的EMT標(biāo)志蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，DN小鼠腎皮質(zhì)中上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)降低，而間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)增多。給予桑葉總黃酮治療后，可以逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中E-cadherin表達(dá)下調(diào)以及α-SMA的沉積。由此我們認(rèn)為，中、高劑量的桑葉總黃酮可以有效地保護(hù)或延緩糖尿病狀態(tài)下腎小管EMT過(guò)程。

Cho等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)了纖維化的發(fā)展。我們前期研究也表明，在大鼠腎小球系膜細(xì)胞與db/db小鼠中，PI3K抑制劑LY-294002能抑制高糖誘導(dǎo)的Akt磷酸化和EMT的發(fā)生，說(shuō)明PI3K/Akt通路的激活促進(jìn)了EMT的發(fā)生，在糖尿病腎病的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[15]。mTOR是Akt通路下游的一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是控制細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的中心環(huán)節(jié)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和代謝，廣泛參與DN發(fā)生發(fā)展的不同環(huán)節(jié)。并且我們以往的研究也證實(shí)，在糖尿病大鼠中Akt/mTOR信號(hào)通路被激活，進(jìn)一步發(fā)展形成EMT[9]。本實(shí)驗(yàn)中，DM組小鼠腎皮質(zhì)中PI3K蛋白表達(dá)、Akt及mTOR磷酸化水平明顯增加，表明PI3K/Akt/mTOR信號(hào)參與了糖尿病狀態(tài)下腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。給予桑葉總黃酮后，PI3K蛋白表達(dá)及Akt、mTOR磷酸化水平均明顯下降，表明中、高劑量桑葉總黃酮可能是通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路改善了腎間質(zhì)纖維化。

Fig 4 Effect of total flavonoid from Mori folium on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway(±s,n=6)

綜合以上實(shí)驗(yàn)研究可見(jiàn)，中、高劑量的桑葉總黃酮能夠降低血糖，改善糖尿病大鼠腎臟功能，減少腎臟組織中膠原的沉積形態(tài)，具有較好的腎臟保護(hù)作用。這種作用可能是桑葉總黃酮通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活，進(jìn)而阻抑腎小管EMT過(guò)程而起效的，從而改善了糖尿病腎間質(zhì)纖維化。如能充分應(yīng)用和發(fā)揮桑葉總黃酮的藥理作用，將為我國(guó)開(kāi)發(fā)新的防治DN的天然藥物提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，推動(dòng)中藥現(xiàn)代化的發(fā)展。

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ProtectiveeffectsoftotalflavonoidfromMorifoliumonrenalfibrosisintype1diabeticmiceandspecificmechanismsoftheseeffects

WANG Wen-wen, ZHANG Sai, ZHU Xiao-hui, QIU Xin-ran, MA Zhong-xuan, SHEN Meng-li, LIU Xing-yu, ZHONG Ya-nan, ZHANG Xiao, YIN Xiao-xing, LU Qian
(JiangsuKeyLabofNewDrugResearchandClinicalPharmacy，XuzhouMedicalUniversity，XuzhouJiangsu221004，China)

AimTo observe the effect of total flavonoid fromMorifolium(TFMF) on renal interstitial fibrosis in type 1 diabetic mice and its possible mechanism.MethodsDiabetic mice were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ) dissolved in 0.01 mol·L-1citrate buffer(pH 4.5) at 150 mg·kg-1body weight after 12 h of food deprivation. Forty model mice were divided randomly into four groups: model group, and low-(0.25 g·kg-1), moderate-(0.5 g·kg-1), high-dose groups(1 g·kg-1) fed with TFMF once daily. In addition, eight normal mice were used as normal group. After 12 weeks, the fasting blood glucose(FBG), serum creatinine(Cr), blood urea nitrogen(BUN) and microalbuminuria(mAlb) were measured. Masson staining, Sirius red staining and collagen type Ⅳ immunohistochemical staining were used to detect the expression of collagen protein in the cortex, while laminin staining to assess the degree of glomerular and renal tubular basement membrane thickening. The protein expressions related to epithelial-mesenchymal transition and PI3K/Akt/mTOR in the renal cortex of mice were detected by Western blot.ResultsThe moderate and high dose of TFMF could significantly decrease the levels of FBG, Cr, BUN and mAlb in diabetic mice, meanwhile decreasing the expression of α-SMA protein by inhibiting the activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, which led to the amelioration of the pathological alterations of renal tissue.ConclusionsThe moderate and high dose of TFMF can reduce the level of renal interstitial fibrosis in type 1 diabetic mice, and its mechanism may be related to the inhibition of activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

total flavonoid fromMorifolium; diabetic nephropathy; renal interstitial fibrosis; epithelial-mesenchymal transition; PI3K; Akt; mTOR

時(shí)間：2017-8-20 16:47 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.036.html

2017-04-09,

2017-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81473257)；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No 201510313049Y)

王文文(1990-)，女，碩士生，研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥的防治，E-mail：xzmcwww@sina.cn; 魯 茜(1978-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥的防治，通訊作者，Tel/ Fax：0516-83262630，E-mail：prairy@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.018

A

：1001-1978(2017)09-1278-08

R-332；R284.1；R322.61；R587.1；R692.320.22；R692.320.531