● 李夢(mèng)瑤 李向榮 高瓊玨 劉 戀

電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血中EPCs含量及其神經(jīng)功能缺損程度的影響※

● 李夢(mèng)瑤*李向榮▲高瓊玨 劉 戀

目的：觀察電針?biāo)年P(guān)穴對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血中EPCs含量及其神經(jīng)功能缺損程度的影響。方法：將120只SD大鼠隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組、模型組及電針組，每組劃分成24h、48h和72h三個(gè)亞組，各10只。模型組及電針組用線栓法建立大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注模型。電針組各亞組在造模成功后即刻行電針?biāo)年P(guān)穴干預(yù)(疏密波，20min/次)，48h組在24h再次電針干預(yù)，72h組在24h和48h各電針干預(yù)1次。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采集抗凝腹主動(dòng)脈血分離單個(gè)核細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表型標(biāo)記為CD34+/KDR+細(xì)胞的EPCs含量。各組均在造模后即刻、24h、48h和72h按Longa評(píng)分進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。結(jié)果：造模后24h，電針組Longa評(píng)分有所下降，與模型組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，模型組血中EPCs含量較其它各組顯著增加(P<0.01)。造模后48h，電針組Longa評(píng)分較模型組明顯降低(P<0.05)，其血中EPCs含量較其它各組明顯增加(P<0.01)。72h時(shí)，電針組Longa評(píng)分較模型組明顯降低(P<0.05)，其血中EPCs含量與正常組及假手術(shù)組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，而模型組仍高于其它各組(P<0.01)。結(jié)論：電針?biāo)年P(guān)穴能讓局灶性腦缺血再灌注大鼠內(nèi)源性EPCs含量增加，并能促進(jìn)恢復(fù)其神經(jīng)功能，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

腦缺血再灌注 電針 內(nèi)皮祖細(xì)胞 神經(jīng)功能缺損

目前，針灸調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)以修復(fù)損傷血管及促進(jìn)血管再生已成為缺血性腦血管病治療的熱點(diǎn)之一。通過(guò)利用電針動(dòng)員骨髓中的內(nèi)源性EPCs遷移入血、歸巢至缺血性卒中后的腦損傷區(qū)域，從而促進(jìn)血管新生，繼而改善血供，可能成為一條保護(hù)缺血腦組織并促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)的新手段。本文將就電針與腦缺血再灌注損傷后機(jī)體內(nèi)EPCs含量及神經(jīng)功能缺損程度的關(guān)系進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源 健康SD雄性大鼠150只，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(SPF級(jí))，大鼠許可證號(hào)0617462。購(gòu)買回來(lái)嚴(yán)格按照規(guī)則適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%，體重250～300g，鼠齡9周，自由攝食飲水。

1.2 造模

1.2.1 造模方法 將禁食24h(不禁水)的大鼠參照改良Longa線栓法制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注模型大鼠模型：①稱重并腹腔注射10%的水合氯醛(350mg/kg)麻醉；②仰臥固定后頸部消毒，正中切開鈍性分離后暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，將頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及翼腭動(dòng)脈分離；③結(jié)扎頸總和翼腭動(dòng)脈，從頸外動(dòng)脈處將預(yù)備的線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，在進(jìn)深至大腦中動(dòng)脈的起始端時(shí)，當(dāng)插入約(18.5±0.5)mm時(shí)遇阻力則止，在用頸外動(dòng)脈掛線結(jié)扎固定后縫合傷口，造成左側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的局灶性缺血；④缺血2h后，將栓線拔出建立缺血-再灌注模型。將術(shù)后老鼠放置在干燥清潔的加熱墊上，室溫控制在26～30℃。1.2.2 模型成功標(biāo)準(zhǔn) 待大鼠完全清醒后，參照經(jīng)典Zea-Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(5級(jí)4分法)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0分(不存在偏癱肢體功能缺失)；1分(不能完全伸展右前肢)；2分(爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，追尾)；3分(爬行時(shí)向右側(cè)傾倒)；4分(不能自主行走，或伴有意識(shí)障礙)。

評(píng)分為1～3分為成功模型，入選實(shí)驗(yàn)。如果術(shù)中出血量大、出現(xiàn)呼吸異常、蛛網(wǎng)膜下腔出血或大鼠還未到時(shí)間點(diǎn)提前死亡者剔除，并將相應(yīng)只數(shù)補(bǔ)足。

1.3 分組及處理方法 本實(shí)驗(yàn)采用先造模后分組的方法，隨機(jī)抓取大鼠后用藍(lán)色記號(hào)筆在鼠尾標(biāo)記數(shù)字，用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行分組，隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組、模型組及電針組，每組劃分成24h、48h和72h三個(gè)亞組，每組10只。均在造模后即刻、24h、48h和72h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分并在造模后24h、48h和72h分別采集腹主動(dòng)脈血。

A.正常組：予常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。

B.假手術(shù)組：分離頸部動(dòng)脈，不插栓線、不結(jié)扎，在將切口縫合后，將其同期同步進(jìn)行飼養(yǎng)；該組不行電針治療，僅與電針組同時(shí)捆綁在鼠板上20min。

C.模型組：在造模后只與電針組同時(shí)間捆綁于鼠板上20min而不行電針治療。

D.電針組：電針組在大鼠未清醒時(shí)選取大鼠四關(guān)穴行針刺后接電針干預(yù)。三個(gè)亞組均在造模后即刻電針干預(yù)1次，48h組在造模后24h再次電針干預(yù)1次，72h組在造模后24h及48h再次電針干預(yù)1次。

1.4 選穴依據(jù) 四關(guān)一詞始于《靈樞·九針十二原》，明代徐鳳《針灸大全》注曰：“四關(guān)者占，五臟有六腑，六腑有十二原，十二原出于四關(guān)，太沖、合谷是也?！钡谝淮螌⑺年P(guān)定位為太沖、合谷。太沖為足厥陰肝經(jīng)的原穴。古文有云：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，治療中風(fēng)病，應(yīng)從肝論治，因其病位在腦，而太沖穴所在的足厥陰經(jīng)是唯一一條循行于頭部的陰經(jīng)，肝腦相通，故刺激該穴可推動(dòng)全身氣血運(yùn)行，平調(diào)陰陽(yáng)寒熱虛實(shí)，起到醒神開竅，痛經(jīng)活絡(luò)的作用。合谷是手陽(yáng)明大腸經(jīng)的原穴，是臟腑原氣經(jīng)過(guò)和留止的穴位，在穴性上，合谷穴可補(bǔ)可散，益氣升陽(yáng)，行氣散滯，開竅啟閉，鎮(zhèn)驚安神，可用于厥證、脫證、閉證等急癥。太沖、合谷兩穴升降相宜，氣血相依，臟腑相合，陰陽(yáng)相配，此乃一組治療中風(fēng)病的經(jīng)典絕妙配穴。

1.5 治療方法 用華佗牌0.25mm×13mm毫針在四關(guān)穴(兩側(cè)的“合谷”穴及“太沖”穴)進(jìn)針3mm后連接華佗牌電針治療儀(“太沖”接負(fù)極，“合谷”接正極，)以疏密波(電流強(qiáng)度1mA，頻率為2/15Hz)持續(xù)刺激20min。穴位的選取參照李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及華興邦主編的大鼠穴位圖譜[1]。

1.6 試劑及儀器

1.6.1 主要試劑 FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD34(AbD serotec)，小鼠VEGFR-2單克隆抗體(Abcam)，陰性對(duì)照小鼠IgG-FITC及PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG(晶美生物)；淋巴細(xì)胞分解液、4%多聚甲醛、2%小牛血清及PBS磷酸鹽緩沖液(長(zhǎng)沙駿宏)。

1.6.2 主要儀器 FC-500流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司)；高速低溫離心機(jī)1-14型(德國(guó)Sigma公司)；南京前沿儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)純水儀；平安醫(yī)械生產(chǎn)的真空肝素鈉抗凝管；冰箱BCD-218A/B(海爾股份有限公司)；移液器(芬蘭DRAGON公司)；華佗牌0.25×13mm毫針及SDZ-V型電針儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司)。

1.7 檢測(cè)步驟

1.7.1 血樣的采集 在完成規(guī)定時(shí)間的治療觀察后，重新依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法在造模后的24、48和72h分別對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行麻醉后的固定。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)正常組與假手術(shù)組及模型組與針刺組同時(shí)剖腹分離腹主動(dòng)脈，用肝素鈉抗凝管采集腹主動(dòng)脈血3ml，做好時(shí)間及代號(hào)標(biāo)記后放置在4℃冰箱內(nèi)保存待分離。

1.7.2 血樣的分離 ①先取淋巴細(xì)胞分離液放入滅菌管中；②按照1：1比例將腹主動(dòng)脈血與注射用生理鹽水混勻后添置到淋巴細(xì)胞分離液的液面上；③以400g(1500轉(zhuǎn)/分)的速度，15cm水平轉(zhuǎn)子為半徑離心配平好的標(biāo)本20分鐘；④離心取出棄血漿層，取乳白色環(huán)狀的淋巴細(xì)胞層放到含有2%小牛血清100μl+PBS5ml的普通試管中，充分混勻后再以同樣速度離心20分鐘；⑤4%多聚甲醛固定經(jīng)2次反復(fù)清洗離心后所得沉淀；⑥-20℃冰箱中保存，最長(zhǎng)可達(dá)1個(gè)月。

1.7.3 EPCs檢測(cè)前準(zhǔn)備 ①加抗體孵育以確定方案：標(biāo)記4只管，管1和管2中各取90μl解凍后標(biāo)本放入，后將KDR抗體及CD34抗體各5μl添入管1中，同時(shí)將二種抗體的同型對(duì)照各5μl添入管2中；管3和管4中各取95μl解凍后標(biāo)本，后在管3中添入CD34抗體5μl，在管4中添入KDR抗體5μl。②確定檢測(cè)方案后，將兩只標(biāo)記好的管中各加入打散后標(biāo)本90μl，管1再分別取KDR及CD34兩種抗體各5μl，管2再取二種抗體的同型對(duì)照各5μl加入，混勻后避光孵育約30分鐘～1小時(shí)。③重懸：孵育后兩管均加入PBS600μl充分混勻，再次等速等時(shí)離心，棄上清液后加4%多聚甲醛重懸，最后以4°C保存待測(cè)。

1.7.4 EPCs檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+/KDR+細(xì)胞表達(dá)雙陽(yáng)性的細(xì)胞，即被標(biāo)記為EPCs。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)定結(jié)果 腦缺血再灌注后即刻模型組、電針組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)；造模后24h，電針組神經(jīng)功能缺損評(píng)分有所下降，與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后48h，電針組神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，與模型組相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；72h時(shí)，電針組神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，與模型組相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明造模后大鼠出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，而在造模后48h和72h電針組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)程度及其活躍性均優(yōu)于模型組，提示電針?biāo)年P(guān)穴可以促進(jìn)腦缺血損傷后大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(分，±s)

注：*與假手術(shù)組比較，P<0.01；▲與模型組比較，P<0.05。

2.2 治療后外周血中EPCs含量的變化 每100個(gè)細(xì)胞中EPCs的個(gè)數(shù)為EPCs所占的百分比，造模后24h，模型組血中EPCs含量顯著增加，相較于其它各組，其差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。造模后48h，電針組血中EPCs含量明顯增加，相較其它各組，其差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。造模后72h時(shí)，電針組血中EPCs含量和正常組及假手術(shù)組比較其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而模型組仍高于其它各組(P<0.01)。說(shuō)明電針?biāo)年P(guān)穴能在大鼠腦缺血損傷后48h更明顯促進(jìn)其EPCs含量增加。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間外周血EPCs含量變化比較±s)

注：*與同時(shí)段其它組比較,P<0.01。

3 討論

缺血性腦卒中的發(fā)病率逐年上升且日益年輕化，嚴(yán)重影響了個(gè)人及家庭的身心健康。研究表明，及早改善缺血區(qū)域的血供是治療缺血性腦血管病的關(guān)鍵。而促進(jìn)腦缺血后半暗帶區(qū)腦組織的血管新生及其側(cè)枝血管的形成，從而改善其血供，可能成為一種保護(hù)缺血的腦組織和促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)的新手段[2]。研究證實(shí)，在急性的缺血性腦卒中發(fā)生后48h，其外周血中EPCs的數(shù)量和其神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度呈負(fù)性相關(guān)[3-5]。因此，通過(guò)動(dòng)員與增殖骨髓內(nèi)的EPCs并將其遷移入血、歸巢到缺血性卒中后的腦損傷區(qū)域，可促進(jìn)血管新生、建立缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)，這將可能成為一種改善腦組織供血與促進(jìn)恢復(fù)其神經(jīng)功能的新手段。

針灸療法治療缺血性卒中歷史悠久，其中電針療法可通過(guò)發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多水平、多途徑的調(diào)節(jié)作用來(lái)治療缺血性卒中，作為一種傳統(tǒng)的非藥物治療方法在防治缺血性卒中方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者的肢體運(yùn)動(dòng)功能、神經(jīng)功能缺損程度及日常生活活動(dòng)能力能通過(guò)針刺治療得以明顯改善[8-10]。電針可使缺血性卒中缺血半暗帶區(qū)內(nèi)微血管數(shù)明顯增多，促進(jìn)血管新生，增加血氧供應(yīng)，達(dá)到治療缺血性卒中的目的。足厥陰的原穴太沖和手陽(yáng)明的原穴合谷穴即為四關(guān)穴，兩穴升降相宜，氣血相依，臟腑相合，陰陽(yáng)相配，此乃一組經(jīng)典絕妙配穴。針刺雙側(cè)合谷和太沖穴可以通過(guò)交感神經(jīng)來(lái)調(diào)節(jié)大腦血管管徑，使腦血流的阻力降低，從而改善顱內(nèi)血液循環(huán)[11-12]。針刺四關(guān)穴能有效地使中風(fēng)患者的日常生活能力及質(zhì)量得以改善，同時(shí)有益于患者更好的回歸于社會(huì)[13]。

本研究立于觀察電針?biāo)年P(guān)穴對(duì)局灶性腦缺血大鼠血中EPCs含量及其神經(jīng)功能缺損程度的影響，從結(jié)果中我們不難看出，通過(guò)針刺治療后，電針組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)程度及其活躍性均優(yōu)于模型組；而外周血中EPCs的含量在腦缺血損傷后均有所增加，然而再灌注后48h，經(jīng)電針干預(yù)后其EPCs含量明顯高于模型組。結(jié)果證明電針?biāo)年P(guān)穴不僅可以促進(jìn)腦缺血損傷后大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，亦能促進(jìn)其外周血中EPCs含量增加，二者呈正相關(guān)。同時(shí)結(jié)果也顯示，電針組24h和72h時(shí)血中EPCs含量低于模型組，且與正常組和假手術(shù)組無(wú)明顯差異，其機(jī)理尚未明確，有學(xué)者研究提出這可能與損傷早期機(jī)體內(nèi)的炎性反應(yīng)及VEGF的表達(dá)有關(guān)，有待于進(jìn)一步深入研究和闡明。

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湖南省科技廳資助項(xiàng)目(No.2013109)

李夢(mèng)瑤，女，醫(yī)學(xué)碩士。研究方向：針灸治療腦病的研究。

▲通訊作者 李向榮，男，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：針灸治療腦病的研究。E-mail：txmm819@sohu

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦病科(410005)