李 楊,桓明輝,高曉梅,劉曉輝,敖 靜,朱巍巍,池景良

遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧 朝陽 122000

一株產(chǎn)纖維素酶菌株的鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

李 楊,桓明輝,高曉梅,劉曉輝,敖 靜,朱巍巍,池景良

遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧 朝陽 122000

從土壤中篩選出一株產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，編號為X-2。該菌株為革蘭氏陽性菌，好氧，可生成芽孢。根據(jù)其菌體形態(tài)、菌落形態(tài)、生理生化特征作為初步分類依據(jù)，并通過16S rDNA分子生物學(xué)鑒定的技術(shù)手段，鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。液體發(fā)酵試驗(yàn)表明，其產(chǎn)酶的最適條件為：發(fā)酵時間為72 h，培養(yǎng)溫度35°C，轉(zhuǎn)速130 rpm、接種量6%以及初始pH 7.2，在該條件下其羥甲基纖維素酶（CMCase）活性可達(dá)10.89 U/mL。

纖維素酶;鑒定;蘇云金芽孢桿菌;產(chǎn)酶條件優(yōu)化

纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生能源物質(zhì)，由于其存在很多的高能氫鍵難以水解，因此很難被人類或動物直接利用[1]。我國是農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)玉米秸稈超過7億t，玉米秸稈是一種纖維素含量很高的農(nóng)作物廢棄物，目前對玉米秸稈的處理大部分是丟棄或者焚燒，產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境問題[2-4]。如何使玉米秸稈達(dá)到無害化和資源化利用已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶作用于玉米秸稈，已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，具有效果穩(wěn)定、降解徹底和降低污染的優(yōu)點(diǎn)，因而得到了普遍的認(rèn)可[5,6]。因此，篩選和分離出產(chǎn)纖維素酶的微生物菌株，提高其對纖維素的降解能力，研制出混合菌株的腐熟劑已經(jīng)成為目前利用微生物降解玉米秸稈以及纖維素資源的開發(fā)利用的研究重點(diǎn)，同時對于解決能源危機(jī)和環(huán)境污染等具有重大的意義。纖維素酶是能夠降解纖維素生成葡萄糖的一類酶的總稱，是一個由多種水解酶組成的復(fù)雜酶系[7,8]。在纖維素資源的綜合利用過程中，纖維素酶發(fā)揮重要作用。

過去的研究中，大多數(shù)報(bào)道的纖維素酶來源于絲狀真菌，尤其是木霉屬和曲霉屬，由于這些菌株產(chǎn)纖維素酶種類多、產(chǎn)量高、性質(zhì)多樣，因此成為發(fā)酵法產(chǎn)纖維素酶的主要菌株[9,10]。近幾年人們對產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌產(chǎn)生了濃厚的興趣，因?yàn)榧?xì)菌的一個最大優(yōu)點(diǎn)是易于培養(yǎng)、生長周期和產(chǎn)酶周期短，生產(chǎn)過程中可以降低成本，同時可徹底降解天然纖維素，達(dá)到預(yù)想的效果。隨著對細(xì)菌深入研究，一些新的可降解纖維素的好氧細(xì)菌菌種被發(fā)現(xiàn)和開發(fā)利用。本實(shí)驗(yàn)室從自然界中篩選出了一株好氧、生長速度快且產(chǎn)纖維素酶較高的細(xì)菌菌株X-2，鑒定為蘇云金芽孢桿菌，對其進(jìn)行了進(jìn)一步分子生物學(xué)鑒定，通過測定菌株菌數(shù)和CMCase活力作為指標(biāo)，優(yōu)化其最適產(chǎn)酶條件，為后期深入研究該菌株的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，同時為微生物秸稈腐熟劑提供一株后備菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

從土壤中分離一株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌，命名為X-2。

1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；3,5-二硝基水楊酸顯色劑（DNS顯色劑）；pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液；1%CMC-Na溶液。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基[11]。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨l0.0 g，酵母提取物l0.0 g，(NH4)2S042.0 g，KH2PO44.0 g，CaCl2?2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g,CMC-Na l0.0 g，蒸餾水 l000 mL，pH7.2。

V-P培養(yǎng)基；甲基紅（M.R.）培養(yǎng)基；明膠液化培養(yǎng)基；淀粉水解培養(yǎng)基；葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基（休和利夫森培養(yǎng)基）；檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基[12]。

甘露醇卵黃多粘素瓊脂培養(yǎng)基（MYP）、胰酪胨大豆羊血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基和無菌脫纖維羊血購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 菌種鑒定方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)特征和生理生化試驗(yàn) 根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13,14]，對分離得到的菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.2 16S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析 用細(xì)菌16 S rDNA的引物，即上游引物F：5′-CAGAGT TTGATCCTGGCT-3′，下游引物 R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，進(jìn)行 16S rDNA 的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：rTaq 酶(5 U/μL)12.5 μL，上游引物和下游引物（2.5 μmol/L）各 1 μL，模板 DNA 2 μL，最后加雙蒸水至50 μL，混合后瞬間離心，置于PCR儀上98℃變性3 min，然后98℃變性25 s，5 5℃退火25 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min反應(yīng)結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。委托上海生工進(jìn)行測序。將測序結(jié)果輸入GenBank進(jìn)行同源性分析。利用Mega、Clustal等軟件進(jìn)行比對，構(gòu)建進(jìn)化樹，重復(fù)次數(shù)為1000次。

1.4 產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1 產(chǎn)CMCase的測定

1.4.1.1 剛果紅平板法檢測菌株產(chǎn)纖維素酶能力 將菌株接種于CMC-Na培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3 d，用0.1%的剛果紅染色30 min后用1 M NaCl溶液洗脫，觀察是否出現(xiàn)透明圈。

1.4.1.2 CMCase的測定

(1)粗酶液的制備：將發(fā)酵液于4°C、5000 rpm條件下離心l0 min，所得上清液即為粗酶液。

(2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：取8支20 mL的具塞刻度試管，分別加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，加入蒸餾水 2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6 mL，1.5 mL 的 DNS 顯色劑，混合液搖勻后于沸水浴中煮沸5 min，迅速置于涼水中冷卻，定容到l0 mL，搖勻，540 nm處測定吸光值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)羧甲基纖維素酶活力（CMCase）的測定[15,16]。取4支試管編號。其中1-3號為反應(yīng)管，4號為對照管。取0.5 mL粗酶液加入1-3號試管中，加入1%CMC-Na溶液1.5 mL；4號管中加入0.5 mL經(jīng)高溫滅活的粗酶液和1%CMC-Na溶液1.5 mL。將上述試管置于50°C水浴30 min，立即加入1.5 mL DNS顯色劑終止反應(yīng)。再將上述試管一同沸水浴5 min后，迅速冷卻并定容至l0 mL，搖勻，540 nm波長處測定吸光度，記錄各管的吸光值。

CMCase酶活力定義:在上述反應(yīng)條件下,纖維素酶液每分鐘催化底物1%CMC-Na溶液生成l μg葡萄糖所需酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.4.2 產(chǎn)酶發(fā)酵時間的優(yōu)化 將菌株X-2接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30°C、130 rpm條件下培養(yǎng)24 h、36 h、48h、60 h、72 h、84 h及96 h后測發(fā)酵液在570 nm的OD值并測定CMCase活力，重復(fù)3次。

1.4.3 溫度的優(yōu)化 設(shè)25°C、30°C、35°C、40°C 4個溫度條件，130 rpm振蕩培養(yǎng)72 h后測發(fā)酵液的OD值和CMCase活力，重復(fù)3次。

1.4.4 接種量的優(yōu)化 按1%、2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種，在35°C、130 rpm的條件下培養(yǎng)72 h后測發(fā)酵液的OD值和CMCase活力，重復(fù)3次。

1.4.5 轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 設(shè)定搖床轉(zhuǎn)速在100 rpm、130 rpm、150 rpm、180 rpm，于35°C培養(yǎng)72 h后測發(fā)酵液的OD值和CMCase活力，重復(fù)3次。

1.4.6 初始pH的優(yōu)化 設(shè)定培養(yǎng)基初始pH為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0，于35°C、130 rpm培養(yǎng)72 h后測發(fā)酵液的OD值和CMCase活力，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征

對X-2細(xì)菌形態(tài)特征進(jìn)行觀察（表1），結(jié)果表明菌株X-2為革蘭氏陽性菌，24 h后可形成穩(wěn)定的菌落。X-2細(xì)菌菌體為桿狀，側(cè)生鞭毛，產(chǎn)中生芽孢。

表1 細(xì)菌X-2的形態(tài)觀察Table 1 The morphological observation of X-2

2.2 生理生化反應(yīng)

X-2菌生理生化反應(yīng)見（表2）。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》所列的芽孢桿菌屬形態(tài)學(xué)和生理生化性狀的描述，初步認(rèn)為X-2為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

表2 細(xì)菌X-2生理生化性狀鑒定Table 2 Identification of X-2 physiological and biochemical characters

2.3 PCR反應(yīng)擴(kuò)增后各菌株的16 S rDNA片斷

從圖1可以看出，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量在1500 bp左右，符合16 S rDNA片斷大小，說明該擴(kuò)增片斷是16S rDNA片斷。

圖1 細(xì)菌X-2的16 S rDNA M 泳道為marker，點(diǎn)樣量為5 μLFig.1 16 s rDNA of X-2 M lane was marker,sample dosage was 5 μL

2.4 細(xì)菌X-2的16 S rDNA鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

測序測得16 S rDNA大部分序列為1494 bp。登陸NCBI，使用BLAST在線將得到的16 S rDNA序列提交進(jìn)行BLAST在線分析。將測出的序列通過16 S rDNA序列同源性比較，X-2與Bacillus thuringiensis的16 S rDNA序列相似性均達(dá)到100%。根據(jù)同源性比較結(jié)果，可以初步確認(rèn)細(xì)菌X-2為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

從Genbank中選擇了11個菌株，應(yīng)用Mega、Clustal軟件進(jìn)行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，菌株X-2和蘇云金芽孢桿菌在一個分支中，且菌株X-2與蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis（FN433030.1）和Bacillus thuringiensis（GU471753.1）的親緣關(guān)系較近。進(jìn)一步證明菌株X-2為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

圖2 細(xì)菌X-2基于16 S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phulogenetic tree of X-2 based on the 16 S rDNA sequence

2.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

不同含量的葡萄糖對應(yīng)的吸光值和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如下所示。吸光值與葡萄糖含量成正比例關(guān)系，且R2=0.995，因此可以通過測定溶液的吸光值OD計(jì)算出相應(yīng)的葡萄糖含量。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard carve of Glucose

2.6 菌株X-2產(chǎn)纖維素酶能力的測定

菌株培養(yǎng)3 d后，結(jié)果如圖4。剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，因此通過是否產(chǎn)生透明圈可以判定菌株是否產(chǎn)纖維素酶。測量X-2透明圈的直徑（12.72±3 mm），D1/d1是3.24。故X-2是一株可以產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌。

圖4 菌株X-2產(chǎn)纖維素酶的定性分析Fig.4 Qualitative analysis on CMCase of X-2

圖5 培養(yǎng)時間對菌株X-2生長和產(chǎn)CMC酶的影響Fig.5 Culturing time effect on growth and CMCase of X-2

2.7 培養(yǎng)條件對生長速率和產(chǎn)酶量的影響

2.7.1 發(fā)酵時間對生長速率和產(chǎn)酶量的影響 結(jié)果如圖5所示，接種后24 h內(nèi)，菌株生長比較緩慢，24 h后菌株快速生長，培養(yǎng)72 h后發(fā)酵液OD值達(dá)最大，產(chǎn)酶量達(dá)到10.31 U/mL，為纖維素酶的最佳收獲期。72 h后隨著時間的延長，生長速率逐漸減小趨于平衡。由于養(yǎng)分的消耗和代謝產(chǎn)物的分泌，菌絲老齡化嚴(yán)重，慢慢解體，故發(fā)酵液的OD值有所下降。

2.7.2 發(fā)酵溫度對生長速率和產(chǎn)酶量的影響 結(jié)果如圖6所示，X-2在30～35°C代謝最旺盛，可見其最適生長溫度為30～35°C。隨著溫度升高生長速率均受到抑制，說明培養(yǎng)溫度對細(xì)菌X-2的CMCase影響效果顯著。產(chǎn)酶量隨著溫度的升高呈上升趨勢，在35°C時達(dá)到最高，超過35°C，隨溫度升高，酶活力有所下降。綜合考慮其生長曲線和產(chǎn)酶能力，確定X-2最適宜的發(fā)酵產(chǎn)酶溫度為35°C。

圖6 發(fā)酵溫度對菌株X-2生長和產(chǎn)CMC酶的影響Fig.6 Temperatures effects on growth and CMCase of X-2

圖7 接種量對菌株X-2生長和產(chǎn)CMC酶的影響Fig.7 Inoculum effects on growth and CMCase of X-2

2.7.3 接種量對生長速率和產(chǎn)酶量的影響 結(jié)果表明，如圖7，隨著接種量的增加，菌株的生長代謝呈現(xiàn)較好狀態(tài)，菌數(shù)和CMCase的酶活力均增加，OD值均均可達(dá)到1.00以上，接種量對細(xì)菌X-2生長的影響并不顯著。但當(dāng)接種量超過6%的時候，酶活力逐步下降，推測是由于接種量過多導(dǎo)致培養(yǎng)基中溶氧量不足的原因。綜合生長速率和CMC酶活力確定X-2的最適接種量為6%。

2.7.4 轉(zhuǎn)速對生長速率和產(chǎn)酶量的影響 由圖8可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)速為100 rpm時，菌數(shù)和酶活力都較低，生長狀況相對最好的轉(zhuǎn)速條件是130 rpm和150 rpm，此時OD值分別為1.011和1.014。130、150和180 rpm轉(zhuǎn)速條件下，菌株X-2的產(chǎn)纖維素酶能力差別不大，當(dāng)轉(zhuǎn)速在130 rpm時，其菌數(shù)和產(chǎn)纖維素酶能力相對偏高。綜合考慮，菌株X-2的產(chǎn)酶發(fā)酵最佳轉(zhuǎn)速確定為130 rpm。

圖8 轉(zhuǎn)速對菌株X-2生長和產(chǎn)CMC酶的影響Fig.8 Rotate speed effect on growth and CMCase of X-2

圖9 pH對菌株X-2生長和產(chǎn)CMC酶的影響Fig.9 pH effect on growth and CMCase of X-2

2.7.5 初始pH對生長速率和產(chǎn)酶量的影響 從圖9可以看出，初始pH對菌株X-2生長速率和酶活力均有顯著影響。初始pH在6.5時OD值較低，隨著初始pH的增加，OD值呈明顯上升趨勢。初始pH為7.2時，OD值達(dá)最高1.221，進(jìn)一步增加而有所降低。初始pH在7.2～8.0的條件下，菌株X-2的產(chǎn)酶活性均可保持在一個較高的水平。在培養(yǎng)基初始pH為7.2、7.4時，CMCase分別達(dá)10.89 U/mL和10.72 U/mL。因此，菌株X-2的發(fā)酵培養(yǎng)最適pH為7.2。

3 討論

纖維素是年產(chǎn)量巨大的可再生能源物質(zhì)，通過微生物產(chǎn)生的纖維素酶來分解和轉(zhuǎn)化纖維素是纖維素利用的有效途徑，也是多年來研究者的目標(biāo)。已發(fā)現(xiàn)的具有降解纖維素能力的微生物有近200種，分布在真菌、細(xì)菌和放線菌中，其中以真菌類產(chǎn)纖維素酶為主[17-19]，但真菌產(chǎn)纖維素酶的規(guī)模生產(chǎn)較繁瑣、周期長，在很大程度影響了纖維素的酶解效率，增大了生產(chǎn)成本[20,21]，因此篩選出一種周期短、產(chǎn)酶高的菌株至關(guān)重要。本試驗(yàn)對細(xì)菌菌株X-2進(jìn)行了鑒定及產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化。菌株X-2能產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽性，分子生物學(xué)鑒定其為蘇云金芽孢桿菌。其最適產(chǎn)酶條件為:培養(yǎng)基起始pH值為7.2，發(fā)酵溫度35°C，接種量為6%，轉(zhuǎn)速為130 rpm，培養(yǎng)72 h，此條件下產(chǎn)CMCase可達(dá)10.89 U/mL。X-2在72 h即可達(dá)到產(chǎn)酶高峰，大大縮短了生產(chǎn)周期，且產(chǎn)纖維素酶量也較高，這與陳晨[22]等發(fā)現(xiàn)菌株F1即鑒定為蘇云金芽孢桿菌后，其纖維素酶活在72 h可達(dá)到最高的研究一致。到目前為止，對Bacillus agaradhaerens、Bacillus cellulyticus、解淀粉芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶研究比較深入，纖維素酶的純化方法已經(jīng)形成，超過20個編碼纖維素降解酶的基因已經(jīng)被測序和克隆[23]。X-2對纖維素具有較強(qiáng)的降解作用，本實(shí)驗(yàn)只是對其發(fā)酵條件進(jìn)行了初步探索，下一步繼續(xù)研究該菌株產(chǎn)纖維素酶的基因及其纖維素酶的性質(zhì)，期望從基因水平上提高菌株的纖維素酶活，將其應(yīng)用于微生物腐熟劑的制作過程中，為腐熟劑的復(fù)合菌種提供后備菌株，對環(huán)境和生態(tài)問題會有很大的應(yīng)用前景和意義。

4 結(jié)論

(1)根據(jù)其菌體形態(tài)、菌落形態(tài)、生理生化特征作為初步分類依據(jù)，該菌株為革蘭氏陽性菌，桿狀，好氧，可生成芽孢。并通過16S rDNA分子生物學(xué)鑒定的技術(shù)手段，鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

(2)剛果紅平板結(jié)果表明X-2是一株可以產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，透明圈的直徑（12.72±3 mm），D1/d1是3.24。

(3)液體發(fā)酵試驗(yàn)表明，其產(chǎn)酶的最適條件為：發(fā)酵時間為72 h，培養(yǎng)溫度35°C，轉(zhuǎn)速130 rpm、接種量6%以及初始pH7.2，在該條件下其羥甲基纖維素酶（CMCase）活性可達(dá)10.89 U/mL。

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Identification for a Strain of Produce Cellulase and Enzyme ProductionConditionsOptimization

LI Yang,HUAN Ming-hui,GAO Xiao-mei,LIU Xiao-hui,AO Jing,ZHU Wei-wei,CHI Jing-liang
Microbial Research Institute of Liaoning Province,Chaoyang122000,China

This paper screened a strain of cellulose-producing bacteria No.X-2 from the soil.It was an aerobic Gram-positive bacteria and able to generate spore.It had been identified asBacillus thuringiensisin laboratory according to thallus morphology,Colony morphology,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA molecular biology identification.Liquid fermentation test showed that Optimum fermentation conditions of X-2 were 72 h fermentation time,incubation temperature at 35°C,130 rpm of revolving speed,6%of inoculum size and pH7.2 of the initial value.The activity of hydroxymethyl cellulase(CMCase)under this condition reached 10.89 U/mL.

Cellulase;identification;Bacillus thuringiensis;optimization of fermentation conditions

Q93-331

A

1000-2324(2017)04-0556-06

2015-11-09

2015-12-03

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2013GB2B000093)

李 楊(1982-),女,碩士研究生,助理研究員,主要從事農(nóng)業(yè)微生物生理生化方面研究.E-mail:liyang_0223@163.com