李興月，張 楠，翁麗麗，邱智東，張 強(qiáng)

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

不同提取方法對哈蟆油中雌二醇含量的影響

李興月，張 楠，翁麗麗，邱智東，張 強(qiáng)*

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

目的 利用3種不同方法提取哈蟆油中雌二醇并測定其相應(yīng)雌二醇含量，優(yōu)選出提取哈蟆油中雌二醇最佳方法。方法 采用ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為磷酸水-乙腈-甲醇（63:32:5）；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min。結(jié)果 90%乙醇提取法中雌二醇含量為7.5 μg/g，超臨界提取法中（無夾帶劑）雌二醇含量為1.25 μg/g，超臨界提取法中（有夾帶劑）雌二醇為0.83 μg/g。結(jié)論 利用90%乙醇提取哈蟆油中雌二醇方法最佳。

哈蟆油；雌二醇；超臨界二氧化碳流體萃取

哈蟆油(ovlductus ranae)系蛙科動物中國林蛙（rana temporaria chensitumsis darid.)雌蛙的干燥輸卵管。哈蟆油味甘、咸，性平，歸肺、腎經(jīng)，具補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤肺生津的功效[1-6]。哈蟆油中含有雌二醇，雌二醇除了可以緩解由于年齡增加，身體機(jī)能下降而引起的雌激素分泌不足之外，對肌體的生長、代謝、發(fā)育、繁殖還起到重要的調(diào)節(jié)作用[7]。哈蟆油在作為治療心腦血管疾病、肝病、貧血、癌癥等疾病的輔助用藥方面，可以增強(qiáng)人體免疫力，提供高蛋白營養(yǎng)物質(zhì)，對減肥節(jié)食者大有好處，是臨床常用營養(yǎng)保健品[8]。本研究采用不同提取方法，測定相應(yīng)提取方法中雌二醇含量，篩選出最佳提取方法，為哈蟆油的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀Prominence-ILC-2030（島津企業(yè)管理中國有限公司）；JA2603B萬分之一天平（上海天美天平儀器有限公司）；FA1004B十萬分之一天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；水浴鍋HH-S2（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）；全自動超純水機(jī)（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司）；超臨界二氧化碳流體萃取儀（杭州明凱科技有限公司）。

1.2 試藥 雌二醇（規(guī)格：100 mg，購于中國食品藥品鑒定所）；95%乙醇（500 mL，分析純，北京化工廠）；丙酮（500 mL，分析純，北京化工廠）；甲醇（500 mL，分析純，北京化工廠）；磷酸（500 mL，分析純，北京化工廠）；甲醇（4 L，色譜純，F(xiàn)isher公司）；乙腈（4 L，色譜純，F(xiàn)isher公司）；哈蟆油經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翁麗麗教授鑒定為正品。

2 方法及結(jié)果

2.1 哈蟆油中雌二醇的提取 1）取哈蟆油約20 g，粉碎，過5號篩，精密稱定，置圓底燒瓶中，加20倍90%乙醇加熱回流提取2次，2 h/次，過濾，合并濾液，回收乙醇，蒸干，備用[9-11]。2）取哈蟆油約20 g，粉碎，過2號篩，精密稱定，放入萃取釜中，壓力為300 mPa，溫度為40 ℃，以無水乙醇作為夾帶劑，流速為0.15 mL/min，提取時間1 h。提取完畢，回收乙醇，蒸干，備用。3）取哈蟆油約20 g，粉碎，過2號篩，精密稱定，放入萃取釜中，壓力為300 mPa，溫度為40 ℃，提取時間1 h。提取完畢，回收乙醇，蒸干，備用。

2.2 雌二醇的含量測定

2.2.1 色譜條件 ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相：磷酸水-乙腈-甲醇（63:32:5）；檢測波長：280 nm； 柱溫：30 ℃； 流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL； 理論塔板數(shù)按雌二醇不低于3 000計算[12]。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取雌二醇對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.003 mg的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 1）取2.1.1項(xiàng)下哈蟆油提取物約0.5 g，精密稱定，加50 mL丙酮溶解，過濾，蒸干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜?5 mL容量瓶[13-15]。2）取2.1.2項(xiàng)下哈蟆油提取物約0.5 g，精密稱定，加50 mL丙酮溶解，過濾，蒸干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜?5 mL容量瓶。3）取2.1.3項(xiàng)下哈蟆油提取物約0.5 g，精密稱定，加50 mL丙酮溶解，過濾，蒸干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜?5 mL容量瓶。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性范圍的考察 精密稱取雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品適量，定容至10 mL容量瓶，吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)品溶液制成0.000 375 、0.000 75 、0.001 5、0.003、0.004 5、0.006 mg/mL溶液，分別吸取20 μL注入高效液相色譜儀，測峰面積，分別是2 788、5 925、12 508、25 620、39 614、51 393。以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=8 737 045.554 5X-506.143 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，結(jié)果表明：雌二醇進(jìn)樣量在0.007 5～0.12 μg范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.4.2 精密度考察 精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液20 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定雌二醇峰面積，分別是26 398、26 251、27 077、26 189、25 490、26 830，RSD=2.1%，表明儀器精密度較好。

2.2.4.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批哈蟆油樣品按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，進(jìn)樣20 μL，測定雌二醇的峰面積，分別是25 748、26 478、26 194、26 946、26 253、26 293，RSD=1.5%，表明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次供試品溶液，室溫下放置0、4、8、12、24、36 h，進(jìn)樣20 μL，測定雌二醇峰面積，分別是26 575、26 547、26 145、26 316、26 119、27 089，RSD=1.4%，表明雌二醇在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品6份，精密稱定，加入雌二醇對照品一定量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，測定含量，計算回收率，平均回收率為97.13%，RSD=1.58%。結(jié)果見表1。

表1 雌二醇回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 樣品測定 吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、不同提取方法的供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件進(jìn)行測定，按照外標(biāo)一點(diǎn)法計算哈蟆油中雌二醇的含量，結(jié)果見表2，圖1、圖2。

表2 哈蟆油中雌二醇含量測定結(jié)果

圖1 雌二醇對照品高效液相色譜圖

3 討論

90%乙醇提取法中雌二醇含量為7.5 μg/g，超臨界提取法中（無夾帶劑）雌二醇含量為1.25 μg/g，超臨界提取法中（有夾帶劑）雌二醇為0.83 μg/g，因此利用90%乙醇提取哈蟆油中雌二醇方法最佳。

哈蟆油中含有雌二醇，雌二醇是動物體內(nèi)重要的雌激素，對機(jī)體的代謝有著重要的影響，如雌二醇可以使胰島素水平增加，從而維持血糖濃度相對穩(wěn)定；雌二醇可以使血管壁的通透性和脆性降低，因此當(dāng)雌二醇減少時，常出現(xiàn)血管脆性增加和出血傾向；雌二醇可以升高血漿生長素，促進(jìn)DNA和RNA的合成，又可以加速氨基酸進(jìn)入細(xì)胞，因此能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成；雌二醇可以促進(jìn)膽固醇的降解和排泄，同時又能改變膽固醇在體內(nèi)分布，使血漿和大動脈壁中的膽固醇轉(zhuǎn)移至肝臟，從而降低血漿膽固醇水平；雌二醇可以抗凝血，防止血栓形成而延緩動脈粥樣硬化[16]。哈蟆油是我省的道地藥材，又是滋補(bǔ)身體的佳品，近年來也引來了越來越多的學(xué)者關(guān)注，研究[17-20]表明，哈蟆油可以抗氧化、抗衰老、抗疲勞。但是哈蟆油抗氧化、抗衰老的作用機(jī)制以及哈蟆油中哪一種成分可以評價哈蟆油的真?zhèn)芜€有待于進(jìn)一步研究。

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圖2 哈蟆油藥材樣品高效液相色譜圖

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Effects of different extraction methods on estradiol content

LI Xingyue, ZHANG Nan, WENG Lili, QIU Zhidong, ZHANG Qiang*
(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117 China)

Objective The estradiol in Oviductus Ranae was extracted by three different methods and the corresponding estradiol content was determined to optimize the best method for extracting estradiol from Oviductus Ranae. Methods ODS-C18 chromatographic column (250 mm×4.6 mm, 5μm) was used, the mobile phase consisted of water-acetonitrile-methanol (63: 32: 5); the detection wavelength was 280 nm; the column temperature was 30 ℃; the fow rate was 1.0 mL/min. Results Estradiol content was 7.5μg / g in 90% ethanol extraction method, 1.25μg /g in supercritical fuid extraction method (without entrainer), estradiol in supercritical fuid extraction Was 0.83μg /g. Conclusion The method of extracting estradiol from Oviductus Ranae by 90% ethanol is the best.

Oviductus Ranae; estradiol; supercritical carbon dioxide fuid extraction

R284.2

A

2095-6258(2017)04-0541-03

2017-01-05）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.04.009

吉林省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（20150309009YY）。

李興月（1993-），女，碩士研究生，主要從事中藥學(xué)研究。

*通信作者：張 強(qiáng)，男，電話-13039218920， 電子信箱-735110462@qq.com