李 鵬,李永春,史加亮,鄭憲清,武國(guó)干,蔣 瑋,趙 凱,明 鳳,潘愛(ài)虎,呂衛(wèi)光,唐雪明,*

1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,上海 2011062 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 2004383 浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,臨安 3113004 德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,德州 2530005 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所,上海 201403

水稻秸稈還田時(shí)間對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

李 鵬1,2,李永春3,史加亮4,鄭憲清5,武國(guó)干1,蔣 瑋1,趙 凱1,明 鳳2,潘愛(ài)虎1,呂衛(wèi)光5,唐雪明1,*

1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,上海 2011062 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 2004383 浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,臨安 3113004 德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,德州 2530005 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所,上海 201403

為揭示水稻秸稈還田對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期影響,采用熒光定量PCR和PCR-DGGE技術(shù)分析了秸稈還田90,180,270 d和360 d的土壤真菌基因豐度和群落結(jié)構(gòu)組成演變趨勢(shì),并利用冗余分析(RDA)研究土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化與環(huán)境因子的關(guān)系。結(jié)果表明：隨著秸稈還田時(shí)間的增加,土壤真菌群體數(shù)量和多樣性指數(shù)(H、R和E)顯著增加,在360 d時(shí)達(dá)到最高。對(duì)DGGE圖譜的特征條帶進(jìn)行膠回收、測(cè)序,系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,土壤真菌主要種群包括：接合菌(Zygomycetesp.)、鹽腐霉菌(Pythiumsalinum)、肉盤菌(UnculturedSarcosomataceae)、牛糞盤菌(Ascobolusstercorarius)、大鏈壺菌(Lagenidiumgiganteum)、青霉菌(Penicilliumsp.)、曲霉屬真菌(Aspergillussp.)和疏綿狀絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)、灰綠曲霉菌(Aspergillusglaucus)、禾谷多粘菌(Polymyxagraminis)和枝頂孢霉菌 (Acremoniumsp.),其中青霉菌(Penicilliumsp.)、曲霉屬真菌(Aspergillussp.)和枝頂孢霉菌(Acremoniumsp.)具有纖維素降解能力,而枝頂孢霉菌 (Acremoniumsp.)在90 d時(shí)成為新的優(yōu)勢(shì)菌群。RDA分析表明,90 d和180 d秸稈還田與對(duì)照土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)較為類似,270 d和360 d的秸稈還田與對(duì)照土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。土壤有機(jī)碳、pH和速效磷是引起土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性變異的主要因素。

桔稈還田；多樣性；土壤真菌；群落結(jié)構(gòu)；基因豐度

土壤微生物是土壤生物區(qū)系中重要的功能組分和土壤生物群落的重要類群,對(duì)土壤的形成發(fā)育、物質(zhì)循環(huán)和肥力演變等具有重大影響[1],是維持土壤資源持續(xù)性和生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵因素[2]。土壤微生物參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解及腐殖質(zhì)的形成等過(guò)程[3],是土壤養(yǎng)分循環(huán)的主要驅(qū)動(dòng)者,因而土壤微生物的生物量、活性和群落結(jié)構(gòu)是土壤質(zhì)量的重要方面[4]。土壤微生物對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的變化十分敏感,能對(duì)土壤生態(tài)機(jī)制變化和環(huán)境脅迫做出反應(yīng),土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的組成和變化情況,是評(píng)價(jià)土壤健康程度或者土壤質(zhì)量的早期重要指標(biāo)[5]。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中還田秸稈是土壤有機(jī)質(zhì)的重要來(lái)源之一[6],作物秸稈富含碳、氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)元素,是寶貴的自然資源。據(jù)估算世界每年產(chǎn)生約34億t作物秸稈,因各種因素廢棄或者焚燒的秸稈量占總秸稈量的60%以上[7],造成了養(yǎng)分資源的巨大浪費(fèi),并嚴(yán)重污染了環(huán)境。我國(guó)秸稈總產(chǎn)量居世界首位,其總產(chǎn)量已達(dá)6億t,如何合理利用秸稈資源,保護(hù)環(huán)境,是關(guān)系到農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題[8]。秸稈還田可以改善土壤結(jié)構(gòu)[9],提高土壤有機(jī)碳含量[10]和土壤微生物活性[11],進(jìn)而提高作物產(chǎn)量。

作物秸稈主要是由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等聚結(jié)的致密的碳水化合物組成[12],微生物作為產(chǎn)生纖維素酶類、木質(zhì)素酶類的主要來(lái)源,在秸稈物質(zhì)的降解過(guò)程中發(fā)揮了巨大的作用,添加秸稈為土壤微生物提供了豐富的碳源和氮源,促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)繁殖,提高了土壤微生物活性,特別是增加了真菌和細(xì)菌比例[13],引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[14-15]。目前相關(guān)研究表明,秸稈還田會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)以及多樣性發(fā)生顯著變化[16- 18]。土壤真菌由于具有較高的胞外酶活性且其酶種類比較全面,使其有很強(qiáng)的纖維素降解能力,在秸稈還田的過(guò)程中發(fā)揮重要作用,Bardgett等[19]研究表明,在秸稈降解的途徑中,真菌的分解作用占據(jù)優(yōu)勢(shì)。Marschner等[20]采用磷酸脂肪酸(PLFA)和尼龍網(wǎng)袋法對(duì)小麥秸稈降解早期(30 d內(nèi))的土壤進(jìn)行分析,結(jié)果表明在秸稈降解1—2周時(shí),土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著得變化。由于秸稈在土壤中的自然降解是個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程,但目前自然條件下秸稈還田對(duì)土壤真菌群體數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期影響尚鮮見報(bào)道。為此,本研究通過(guò)設(shè)置水稻秸稈還田不同時(shí)間(90,180,270,360 d),采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)-變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 及熒光定量PCR 方法研究真菌群體數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)的演變趨勢(shì),并利用冗余分析(Redundancy Analysis -RDA)研究土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)變化與土壤性質(zhì)的關(guān)聯(lián),為揭示土壤真菌對(duì)秸稈還田引起的微生境變化的適應(yīng)與演變趨勢(shì),維持土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的穩(wěn)定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

土壤樣品采自上海市崇明區(qū)長(zhǎng)江農(nóng)場(chǎng)秸稈還田長(zhǎng)期定位試驗(yàn)田(31°30′ N, 121°31′ E)。試驗(yàn)于2013年10月進(jìn)行秸稈還田試驗(yàn),稻秸還田量為6000 kg/hm2(依據(jù)當(dāng)?shù)厮井a(chǎn)量6000 kg/hm2,并考慮根莖殘茬折算),稻秸稈經(jīng)切碎后耕埋,耕深10 cm,并設(shè)置秸稈不還田對(duì)照。選定小區(qū)面積33 m2,重復(fù)3 次。分別在秸稈還田后90、180、270 d和360 d采集秸稈還田和未秸稈還田土壤樣品。采用五點(diǎn)取樣法采集0—10 cm 土壤,混勻分裝,一部分樣品用液氮速凍后在-20℃保存,供分子生物學(xué)研究；另一部分用于土壤基本理化性質(zhì)分析。土壤理化性質(zhì)參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行分析,結(jié)果見表1。

表1 秸稈還田不同時(shí)間土壤理化性質(zhì)

T代表處理(秸稈還田土壤)Treat (Straw decomposition soil)；C代表對(duì)照(秸稈未還田土壤)Control (No straw decomposition soil);同列不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)

1.2 土壤總DNA 的提取及純化

采用the ISOIL for Beads Beating kit(NipponGeneCo., Ltd.,Toyama, Japan)試劑盒提取土壤總DNA,稱取0.5 g于-20 ℃保存的土壤樣品按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行土壤DNA提取,用30 μL滅菌水溶解DNA,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的DNA片段大小,并用NanoDrop ND- 1000核酸蛋白測(cè)定儀(NanoDrop Technologies,Inc．)測(cè)定DNA的濃度和質(zhì)量,DNA樣品于-20℃保存。

1.3 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的PCR-DGGE 分析

應(yīng)用Veriti 梯度PCR儀(Thermo Fisher Scientific Inc)進(jìn)行真菌18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增,每個(gè)樣品3次重復(fù)。以提取的總DNA為模板,引物為NS7-GC和NS8[22]。PCR體系如下：無(wú)菌雙蒸水31.7 μL, 10×Buffer (-MgCl2) 5.0 μL,dNTPs(各2.5 mmol/L)5.0μL,25 mmol/L MgCl23.0 μL,引物1(10 μmol/L)和引物2(10 μmol/L)各0.5 μL,牛血清血蛋白(BSA- 10 mg/mL)1.0 μL,3%去離子甲酰胺1.0 μL ,Taq酶(5U/μL-寶生物工程 (大連)有限公司)0.3 μL,DNA模板(20ng/μL)2.0μL。PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min；95℃變性45 s,50℃ 退火45 s,72℃延伸45 s(35個(gè)循環(huán));最后72℃延伸10 min。

使用DCodeTMUniversal Mutation Detection System(Bio-Rad Laboratory,Inc．),在變性劑梯度為30%—60%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)。使用40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺凝膠(37.5∶1),電泳緩沖液為1×TAE。電壓80V,60℃,電泳13 h,采用1∶10000(v/v)SYBR Green染色30 min,染色結(jié)果用Gel DocTMEQ (Bio-Rad Laboratory，Inc.) 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

將DGGE 圖譜中的主要條帶進(jìn)行切膠,DNA 回收,然后再分別以不帶GC夾的引物NS7/NS8對(duì)回收條帶DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物利用pMD 18-T 載體進(jìn)行克隆測(cè)序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。登陸NCBI 通過(guò)Blast 軟件將11條測(cè)序序列與GenBank 中的已知序列比對(duì)來(lái)確定測(cè)定序列的微生物種類。利用Sequin軟件向Genbank提交11條測(cè)序序列,并獲得登錄號(hào)(KU510560-KU510570)。利用MEGA 5.0軟件基于DGGE條帶序列,進(jìn)行Bootstrap 驗(yàn)證系統(tǒng)發(fā)育分析,鄰接法(Neighbor-joining,N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 土壤真菌群體數(shù)量的熒光定量PCR分析

應(yīng)用ABI StepOne Plus擴(kuò)增儀(Thermo Fisher Scientific Inc)對(duì)真菌ITS rRNA基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,引物為NSⅠ1和58A2R[23],每個(gè)樣品3次重復(fù)。熒光定量PCR 反應(yīng)體系10 μL,引物NSⅠ1 和58A2R (10 μmol/L)各0．25 μL,2×SYBR Premix Ex TaqTM(寶生物工程 (大連)有限公司)5 μL,模板4 μL,用無(wú)菌ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。采用三步法進(jìn)行熒光定量PCR：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃,30 s；53 ℃,30 s；72 ℃,45 s；40個(gè)循環(huán)。

以混合土樣總DNA 為模板進(jìn)行真菌ITS rRNA基因PCR 擴(kuò)增。將100 μL PCR 產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳,切下含有ITS rRNA基因的條帶,用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司)純化。使用pMD 18-T 載體(寶生物工程 (大連)有限公司)連接PCR 產(chǎn)物,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞,在氨芐青霉素平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆。取部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,作為氨氧化古菌熒光定量PCR 分析的標(biāo)準(zhǔn)DNA。利用Axygen AP-MN-P- 50(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司)試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA,質(zhì)粒DNA 濃度使用Nanodrop ND- 1000 測(cè)定。根據(jù)已知重組質(zhì)粒全序列長(zhǎng)度和阿伏伽德羅常數(shù)計(jì)算對(duì)應(yīng)的ITS rRNA基因拷貝數(shù),以10 倍梯度對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋(拷貝數(shù)為1010—106),進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增,每個(gè)梯度3次重復(fù),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件IBM Group, Inc.進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,使用新復(fù)極差法(SSR)多重比較檢驗(yàn)差異顯著性。采用Quantity One 4.4 軟件(Bio-Rad Laboratory，Inc.)進(jìn)行DGGE 圖譜分析,并采用未加權(quán)算術(shù)平均對(duì)群法(unweighted pair-group method using arithmetic averages,UPGMA)法對(duì)DGGE 圖譜進(jìn)行聚類分析。運(yùn)用Dice Coefficient 法根據(jù)電泳圖譜對(duì)樣品進(jìn)行相似性分析。使用香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener index H)、豐度指數(shù)(R)和均勻度指數(shù)(E)對(duì)真菌群落多樣性進(jìn)行分析[24],其計(jì)算公式為:

H=-∑(ni/N)lg(ni/N)

E=H/lnR

式中,ni為每條電泳條帶光密度峰值；N是同一泳道中所有條帶光密度峰值總和。電泳條帶光密度的峰值通過(guò)分析軟件Quantity one 進(jìn)行讀取。R為每一泳道總的條帶數(shù)。

使用CANOCO 4.5.1軟件(Microcomputer Power,Ithaca,USA)對(duì)DGGE 揭示的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境參數(shù)進(jìn)行冗余分析(Redundancy Analysis-RDA)[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈還田不同時(shí)間土壤真菌的群體數(shù)量變化

圖1 秸稈還田不同時(shí)間土壤真菌的ITS rRNA基因拷貝數(shù)變化 Fig.1 Copy numbers of ITS rRNA genes in the soil DNA extracts as determined by quantitative PCR under different days of rice straw decomposition (mean±SE)不同小寫字母表示不同時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)

由圖1可以看出,秸稈還田和秸稈未還田對(duì)照土壤的真菌ITS rRNA 基因拷貝數(shù)在2.61×107— 6.46×107拷貝/克干土。隨著秸稈還田時(shí)間的增加,土壤真菌群體數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì),360 d的秸稈還田土壤真菌群體數(shù)量最高,90 d的秸稈還田土壤真菌群體數(shù)量最低；90 d和270 d的秸稈還田與各自對(duì)照相比,土壤真菌群體數(shù)量沒(méi)有顯著差異；180 d和360 d秸稈還田與各自對(duì)照相比,土壤真菌群體數(shù)量顯著增加。

2.2 秸稈還田不同時(shí)間土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性

采用真菌特異性引物NS7-GC/NS8對(duì)18S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,純化后進(jìn)行DGGE 分析(圖2)。圖2 中可以看出,隨著秸稈還田時(shí)間的延長(zhǎng),PCR-DGGE圖譜出現(xiàn)了較明顯的差異,表明土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。常見菌群如條帶c,e,f,g,h,k在90,180,270、360 d的稈還田和秸稈未還田的土壤對(duì)照中均存在,但條帶的亮度發(fā)生明顯的變化,說(shuō)明常見菌群數(shù)量發(fā)生了變化；隨著秸稈還田時(shí)間的增加,原有的優(yōu)勢(shì)菌群如條帶a和b減弱或消失,新的優(yōu)勢(shì)菌群如條帶d、i、j出現(xiàn)或增強(qiáng)。

圖2 秸稈還田不同時(shí)間土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的PCR-DGGE分析Fig.2 PCR-DGGE analysis of soil fungal community structures in different days of rice straw decompositionT:處理(秸稈還田土壤)Treat (Straw decomposition soil)；C:對(duì)照(秸稈未還田土壤)Control (No straw decomposition soil)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ:3次重復(fù)；圖中小寫字母代表測(cè)序DGGE 條帶

對(duì)秸稈還田不同時(shí)間土壤真菌的DGGE圖譜條帶進(jìn)行多樣性指數(shù)分析表明(表2),秸稈還田對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯影響,隨著秸稈還田時(shí)間的增加,多樣性指數(shù)(H、R和E)均有升高趨勢(shì),在360 d時(shí),秸稈還田土壤真菌多樣性指數(shù)達(dá)到最高。

選取了11條DGGE圖譜主要條帶進(jìn)行序列切膠回收測(cè)序(圖2),分析秸稈還田后土壤真菌的群落演變過(guò)程。在Genebank 中進(jìn)行Blast 序列比對(duì),利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明,常見種群如條帶c,e,f,g,h,k分別與接合菌(Zygomycetesp.)、鹽腐霉菌(Pythiumsalinum)、肉盤菌(UnculturedSarcosomataceae)、牛糞盤菌(Ascobolusstercorarius)、大鏈壺菌(Lagenidiumgiganteum)、青霉菌(Penicilliumsp.)聚在一起；原有的優(yōu)勢(shì)種群如條帶a和b與曲霉屬真菌(Aspergillussp.)和疏綿狀絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)聚在一起；新的優(yōu)勢(shì)種群如條帶d、i、j與灰綠曲霉菌(Aspergillusglaucus)、禾谷多粘菌(Polymyxagraminis)、枝頂孢霉菌 (Acremoniumsp.)聚在一起。

表2 秸稈還田不同時(shí)間土壤真菌PCR-DGGE圖譜多樣性指數(shù)

T代表處理(秸稈還田土壤)；C代表對(duì)照(秸稈未還田土壤);同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

圖3 秸稈還田不同時(shí)間土壤真菌DGGE 條帶序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on soil fungal DGGE profiles in different days of rice straw decomposition

圖4 秸稈還田不同時(shí)間土壤真菌DGGE條帶與土壤性質(zhì)的冗余分析Fig.4 RDA of soil fungal DGGE profiles and soil chemistry properties in different days of rice straw decompositionT: 代表處理(秸稈還田土壤)Treat (Straw decomposition soil); C: 代表對(duì)照(秸稈未還田土壤) Control (No straw decomposition soil).Avail-K：速效鉀Available K；Avail-P：速效磷Available P；Organ C：有機(jī)碳Organic carbon； Alk-N：堿解氮Alkalize-Hydrolyzed N;Total-N：總氮 Total nitrogen；pH：pH值

2.3 秸稈還田造成土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主因素分析

以秸稈還田不同時(shí)間土壤真菌DGGE 圖譜和土壤理化性質(zhì)為兩個(gè)變量組,進(jìn)行RDA分析(圖4,表3)。結(jié)果表明,水稻秸稈還田后,土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變,而隨著秸稈還田時(shí)間的延長(zhǎng),不同階段土壤真菌群落差異明顯。90 d和180 d秸稈還田和對(duì)照土壤樣地較為接近,說(shuō)明其真菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高,秸稈還田早期還未對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)造成明顯影響；270 d和360 d的秸稈還田和對(duì)照土壤樣地差異較大,說(shuō)明其真菌群落的優(yōu)勢(shì)菌種發(fā)生變化,群落結(jié)構(gòu)相似度較低,隨著秸稈還田時(shí)間的增加,秸稈還田已經(jīng)引起真菌群落結(jié)構(gòu)顯著變化。

由表3可知,RDA排序3個(gè)排序軸的特征值分別為0.309、0.144和0.067,真菌群落組成與環(huán)境因子3個(gè)排序軸的相關(guān)系數(shù)分別為0.867、0.885和0.875。前兩軸的特征值占總特征值80.7%,說(shuō)明排序效果很好。前兩軸的物種與環(huán)境相關(guān)系數(shù)較高,共解釋了物種-環(huán)境關(guān)系總方差的74.8%。圖4表明,土壤有機(jī)碳、pH值和速效磷對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05),是引起土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性變異的主要因素,而速效鉀和總氮的影響最小。

表3 RDA排序結(jié)果

3 討論

本研究采用RDA分析了秸稈還田和對(duì)照土壤的6個(gè)環(huán)境因子對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)土壤土壤有機(jī)碳、pH值和速效磷與真菌群落變化的相關(guān)性大于其他環(huán)境因子,這與近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的土壤的pH值和有機(jī)碳是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素相一致[26- 27]。Sun等[18]研究認(rèn)為,土壤pH值是影響微生物群落結(jié)構(gòu)最重要的因素之一。Lu等[28]研究發(fā)現(xiàn),革蘭氏陰性細(xì)菌的豐富度受到pH值的顯著影響。在本研究中,對(duì)照土壤pH值呈先降低再升高的趨勢(shì),而秸稈還田土壤pH值呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),在360 d時(shí)pH值均達(dá)到最大,表明秸稈還田可以緩解土壤酸化,這也與蘭麗麗等[29]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Liu等[30]研究表明,作物秸稈直接還田可以增加土壤有機(jī)碳含量,從而提高土壤肥力。本研究結(jié)果表明,相對(duì)于秸稈未還田對(duì)照,隨著秸稈還田時(shí)間的增加,秸稈還田土壤有機(jī)碳的含量顯著增加,在還田360 d時(shí)達(dá)到最高值2.58%,而總氮和堿解氮出現(xiàn)下降的趨勢(shì),史央等[31]研究結(jié)果表明,稻草稈物料經(jīng)過(guò)一年的腐解,仍有42.26%未被降解。因次本研究結(jié)果原因可能是秸稈還田后經(jīng)過(guò)360 d的腐解,水稻秸稈未完全被腐解,土壤微生物繼續(xù)可以分解秸稈,促進(jìn)秸稈碳釋放,使土壤有機(jī)碳含量持續(xù)增加,約為還田90 d的近一倍。同時(shí)秸稈的C/N的比值影響秸稈腐解的速度,水稻秸稈C/N 約為100∶1,顯著大于微生物自身的C/N(25∶1到30∶1之間),微生物除了合成自身生長(zhǎng)所需要的C/N,為了利用多余的碳,會(huì)繼續(xù)從土壤中吸收氮,從而造成土壤總氮和堿解氮的損失。張四海等[32]采用磷脂脂肪酸(PLFA)法測(cè)定土壤微生物生物量,結(jié)果表明,添加秸稈配合施入磷素對(duì)微生物總生物量、真菌數(shù)量和真菌/細(xì)菌比值具有顯著的促進(jìn)作用。本研究中土壤速效養(yǎng)分如速效磷的累積與真菌群落結(jié)構(gòu)的變化具有較強(qiáng)的相關(guān)性,可能是由于大量速效養(yǎng)分的明顯變化對(duì)土壤真菌產(chǎn)生了脅迫作用,影響了優(yōu)勢(shì)種群的分布,具體的機(jī)理目前還沒(méi)有明確,有待于進(jìn)一步研究。

由真菌ITS rRNA 基因拷貝數(shù)的熒光定量PCR結(jié)果可知,水稻秸稈還田使得土壤真菌群體數(shù)量發(fā)生顯著變化,180 d和360 d的秸稈還田與各自對(duì)照相比,土壤真菌群體數(shù)量發(fā)生顯著增加；而隨著時(shí)間增加,秸稈未還田對(duì)照土壤的真菌群體數(shù)量表現(xiàn)為升高的趨勢(shì),原因推測(cè)是水稻秸稈未還田試驗(yàn)地的上茬作物是小麥,小麥?zhǔn)斋@后少量秸稈可能殘留在試驗(yàn)地中,從而為秸稈未還田試驗(yàn)地的土壤真菌提供了有機(jī)碳源,促進(jìn)了真菌的生長(zhǎng)。90 d秸稈還田和對(duì)照相比,土壤真菌群體數(shù)量未發(fā)生顯著增加,表明秸稈還田早期未對(duì)其真菌群落結(jié)構(gòu)造成明顯影響；而270 d秸稈還田和對(duì)照相比,土壤真菌群體數(shù)量也未發(fā)生顯著變化,原因可能是第二年7月底采樣時(shí),上海崇明降雨較多,土壤含水量和土壤溫度較高,Brockett等[33]和Buyer等[34]研究表明土壤含水量和土壤溫度可以顯著影響微生物群落結(jié)構(gòu),由此我們推測(cè)此時(shí)期的土壤含水量和土壤溫度對(duì)真菌群體數(shù)量的影響超過(guò)了秸稈還田。

本研究中秸稈還田不同時(shí)間的土壤真菌DGGE圖譜的聚類分析和RDA分析均表明,90 d的秸稈還田和對(duì)照的土壤樣品聚為一類,同時(shí)其真菌群體數(shù)量和多樣性指數(shù)(H、R和E)與對(duì)照均未表現(xiàn)明顯差異,說(shuō)明秸稈還田前期未對(duì)其真菌群落結(jié)構(gòu)造成明顯影響,與90 d定量PCR分析得出的秸稈還田和對(duì)照的真菌群體數(shù)量結(jié)果相一致。隨著秸稈還田時(shí)間的增加,真菌群體數(shù)量和多樣性指數(shù)(H、R和E)均表現(xiàn)升高的趨勢(shì),并在360 d時(shí)達(dá)到最高。劉驍蒨[35]進(jìn)行DGGE條帶測(cè)序發(fā)現(xiàn),秸稈還田和施肥的優(yōu)勢(shì)土壤真菌包含可以降解纖維素的半知菌綱的枝頂孢屬(Acremoniumsp.)。本研究對(duì)DGGE的11條特征條帶進(jìn)行序列切膠回收測(cè)序,結(jié)果表明,土壤真菌主要種群包括了工業(yè)中用以可以生產(chǎn)纖維素酶的真菌：青霉菌(Penicilliumsp.)、曲霉屬真菌(Aspergillussp.)和枝頂孢霉屬 (Acremoniumsp.)[36],其中青霉菌(Penicilliumsp.)在秸稈還田過(guò)程中均為優(yōu)勢(shì)菌群,而枝頂孢霉屬 (Acremoniumsp.)在90 d時(shí)作為新的優(yōu)勢(shì)菌群出現(xiàn),推測(cè)其在降解纖維素的過(guò)程中,種群數(shù)量迅速增加。因而本研究結(jié)果為從這種特定的土壤微生境中分離生產(chǎn)纖維素酶活力較高的真菌提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

綜上所述,水稻秸稈還田可以增加土壤真菌群體數(shù)量和多樣性指數(shù),還田270 d和360 d的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化,土壤有機(jī)碳、pH和速效磷是引起土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性變異的主要因素。

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Rice straw return of different decomposition days altered soil fungal community structure

LI Peng1,2, LI Yongchun3, SHI Jialiang4, ZHENG Xianqing5, WU Guogan1, JIANG Wei1, ZHAO Kai1, MING Feng2,, PAN Aihu1, Lü Weiguang5, TANG Xueming1,*

1 Biotechnology Institute of Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China2 School of Life Science of Fudan University, Shanghai 200438, China3 School of Environmental and Resources of Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin′an 311300, China 4 Dezhou Academy of Agricultural Sciences, Dezhou 253000, China5 Institute of Eco-Environment and Plant Protection of Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China

The decomposition of plant residue is largely mediated by microorganisms, such as soil fungi and bacteria, which are very sensitive to changes in their soil environments. Numerous studies at the microbial community level have emphasized the influence of residue return on functional capacity and the characterization of phenotypic traits. Furthermore, previous studies have also shown that fungi dominate the early stages of decomposition in semi-natural unfertilized soils. The long-term impact of straw return on soil ecosystems, especially fungal gene abundance and community composition, is unclear. In the present study, based on the analysis of soil properties, we investigated the effect of rice straw return on the population size and community structure of soil fungi under different straw return days, using real-time PCR and PCR-DGGE. Subsequently, the correlation between fungal community and soil environmental factors was analyzed using redundancy analysis (RDA). Treatments in the present study were based on different return days (90, 180, 270, and 360 d), and a soil with no straw return and similar topography was used as the control. Each treatment had three replicates. The copy numbers of soil fungal ITS ranged from 2.61×107to 6.46×107per g of dry soil and was greatly influenced by straw return days. The 360-d treatment yielded the highest copy numbers, whereas the 90-d treatment yielded the lowest copy numbers. The diversity indices (H,R, andE) increased significantly with increasing straw decomposition time and reached maximum values under the 360-d treatment. The DGGE patterns suggested that straw return altered the fungal community, and significant differences were observed among the treatments with different return days. Eleven DGGE bands were re-amplified, sequenced, and aligned using BLAST; and phylogenetic analysis revealed that the soil fungal community of the straw return includedZygomycetesp.,Pythiumsalinum, uncultured Sarcosomataceae,Ascobolusstercorarius,Lagenidiumgiganteum,Penicilliumsp.,Aspergillussp.,Thermomyceslanuginosus,Aspergillusglaucus,Polymyxagraminis, andAcremoniumsp., among whichPenicilliumsp.,Aspergillussp., andAcremoniumsp. are able to degrade cellulose. RDA analysis suggested the 90-d and 180-d treatments were similar and clearly distinct from the 270-d and 360-d treatments along both the first and second ordination axes, which indicated a pronounced difference in the community composition of soil fungi at the late straw return stage and a slight difference in the early stage, respectively. The eigenvalues of the first two axes of the fungal RDA results were 0.309 and 0.144 and accounted for 80.7% of the total eigenvalue, which suggested qualified ordination results. The first two axes of the species-environment relationship from the RDA results explained 74.8% of the total variance. Among the six soil parameters measured, the influence of available K, alkaline-hydrolyzed N, total N were not significant (P<0.05), but soil organic carbon, pH, and available P were the main factors that influenced the variation of fungal community structure and diversity. The results suggested that long-term straw return had a significant impact on soil fungal composition and that soil organic carbon, pH, and available P are important factors in the dynamics of soil fungal communities.

straw return；diversity；soil fungi；community structure；gene abundance

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31500461)；上海市農(nóng)委科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(滬農(nóng)科攻字(2015)第4-3號(hào))；上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長(zhǎng)計(jì)劃(滬農(nóng)青字(2015)第1-30號(hào))；上海市農(nóng)科院青年科技人員“助跑”計(jì)劃(ZP17)；上海市農(nóng)科院科技發(fā)展基金(農(nóng)科發(fā)2013(03)

2016- 03- 11; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2017- 02- 23

10.5846/stxb201603110431

*通訊作者Corresponding author.E-mail: saas_xmtang@foxmail.com

李鵬,李永春,史加亮,鄭憲清,武國(guó)干,蔣瑋,趙凱,明鳳,潘愛(ài)虎,呂衛(wèi)光,唐雪明.水稻秸稈還田時(shí)間對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(13):4309- 4317.

Li P, Li Y C, Shi J L, Zheng X Q, Wu G G, Jiang W, Zhao K, Ming F, Pan A H, Lü W G, Tang X M.Rice straw return of different decomposition days altered soil fungal community structure.Acta Ecologica Sinica,2017,37(13):4309- 4317.