李虹霞 ,郭麗萍,張 君,周 璐

(1.天津市泰達醫(yī)院 消化內(nèi)科，天津 300457；2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院 消化內(nèi)科)

CD40、HLA-DR在自身免疫性肝病Kupffer細胞的表達變化

李虹霞1,郭麗萍2,張 君2,周 璐2

(1.天津市泰達醫(yī)院 消化內(nèi)科，天津 300457；2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院 消化內(nèi)科)

目的 研究自身免疫性肝病Kupffer細胞抗原呈遞分子的表達變化。方法 按照自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性膽管炎的診斷標準進行分組，脂肪肝作為對照組。入選患者的肝穿石蠟切片進行CD40、HLA-DR免疫組化染色，隨機選取10個顯微鏡高倍視野(×400倍)，觀察染色情況，并統(tǒng)計CD40+、HLA-DR+細胞數(shù)目。結(jié)果 CD40在自身免疫性肝病組的陽性細胞數(shù)低于對照組。CD40免疫組化陽性產(chǎn)物呈棕褐色或棕黃色顆粒狀著色，主要位于細胞膜，少部分位于細胞質(zhì)。分別計算自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性膽管炎和脂肪肝3組肝穿標本中的CD40陽性的kupffer細胞數(shù)絕對值，結(jié)果顯示： 3組間CD40陽性的kupffer細胞的計數(shù)絕對值比較具有統(tǒng)計學意義(P=0.04，P<0.05)。AIH與PBC組比較無統(tǒng)計學差異(P=0.428,P>0.05)；AIH與脂肪肝組比較具有統(tǒng)計學意義(P=0.02，P<0.05)。免疫組化中，HLA-DR在自身免疫性肝病組的陽性細胞數(shù)低于對照組，HLA-DR免疫組化染色陽性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒，主要位于細胞膜。分別統(tǒng)計AIH、PBC和脂肪肝3組的HLA-DR陽性的kupffer細胞計數(shù)的絕對值，結(jié)果顯示3組比較其結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P=0.015，P<0.05)，AIH與脂肪肝組比較具有統(tǒng)計學意義(P=0.017，P<0.05)。CD40、HLA-DR結(jié)果與肝功能、凝血功能化驗檢查結(jié)果進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示具有相關(guān)性。結(jié)論 自身免疫性肝病患者組的肝穿石蠟切片免疫組化染色顯示CD40及HLA-DR表達較脂肪肝組數(shù)量減少，且 CD40、HLA-DR與自身免疫性肝病的轉(zhuǎn)氨酶變化相關(guān)，提示自身免疫性肝病可能存在kupffer細胞抗原呈遞功能減弱，是導致自身免疫性肝病肝損害的原因之一。

自身免疫性肝??；抗原呈遞；肝功能損害

(ChinJLabDiagn,2017,21:1350)

自身免疫性肝病的發(fā)病機制目前尚未完全清楚，多數(shù)研究認為其發(fā)病過程可能為遺傳、環(huán)境、自身抗原、免疫功能紊亂等多種因素聯(lián)合作用，最終導致免疫機制損傷，產(chǎn)生肝臟組織的免疫反應(yīng)，造成肝細胞炎癥壞死，并逐步進展為肝纖維化、肝硬化[1]。近期研究提示單核-巨噬細胞功能異常與自身免疫性肝病的發(fā)病密切相關(guān)。有研究顯示證實自身免疫性肝病動物模型的單核-巨噬細胞的吞噬能力降低[2]，并且近期科研數(shù)據(jù)顯示固有免疫是導致自身免疫性肝病肝臟損傷的重要因素，肝臟單核-巨噬細胞功能已成為目前自身免疫性肝病的研究熱點[3-5]。CD40、HLA-DR是抗原呈遞分子，具有抗原呈遞功能，本研究擬討論CD40、HLA-DR在自身免疫性肝病的表達變化。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2015年1月至6月期間在天津市醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內(nèi)科住院并進行肝臟穿刺病理活檢的患者共27例，其中自身免疫性肝炎(AIH)患者14例，男3例，女11例，年齡34-68歲，中位年齡為45±2歲；原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)患者7例,男1例，女6例，年齡26-59歲，中位年齡為47±1歲；對照組脂肪肝患者共6例，男3例，女3例，年齡31-64歲，中位年齡為51±3歲。所有入選病例均具有完整的血生化、自身抗體、病毒學等檢查資料，并全部行肝穿刺活檢檢查，經(jīng)病理診斷確診，并經(jīng)HE染色復查認定。所有患者均簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 診斷標準 AIH采用美國肝病學會2010年推薦的診斷標準[6]；PBC采用歐洲肝病學會和美國肝病學會2009年診斷標準[7]。

1.3 方法 采用免疫組化SP方法將入選病例的肝穿石蠟切片進行染色，一抗：CD40(購自美國Santa公司)，工作濃度1∶1 000,；HLA-DR(購自美國Abcam公司)，工作濃度1∶1 500。二抗(以辣根過氧化物酶標記)：酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。試驗結(jié)果的判斷方法：在高倍鏡視野(400倍)隨機選擇10個視野，計數(shù)每個高倍視野CD40、HLA-DR陽性細胞數(shù)，取均值。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0 for Windows作統(tǒng)計學處理。CD40、HLA-DR的陽性細胞數(shù)采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，CD40、HLA-DR與臨床生化、免疫指標的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)系數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 CD40免疫組化染色結(jié)果 光鏡下觀察CD40免疫組化陽性產(chǎn)物：呈棕褐色或棕黃色顆粒狀著色，主要位于細胞質(zhì)，少部分位于細胞膜。CD40在AIH、PBC及對照組肝臟病理標本的表達：分別統(tǒng)計AIH、PBC、和對照組3組病例的CD40+細胞的數(shù)量絕對值，分別為:AIH為10±2；PBC為12±3；對照組為21±3。CD40在AIH、PBC、對照組患者3組間比較，其結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P=0.04，P<0.05)。AIH與PBC組比較無統(tǒng)計學差異(P=0.428,P>0.05)；AIH與對照組比較具有統(tǒng)計學意義(P=0.02，P<0.05)。

2.2 HLA-DR染色結(jié)果 光鏡下觀察HLA-DR免疫組化染色陽性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒，主要位于細胞膜，少部分位于細胞質(zhì)。HLA-DR在肝穿病理組織中表達局部可成片表達。HLA-DR在AIH、PBC及脂肪肝肝臟病理標本的表達：分別計算AIH、PBC和脂肪肝組3組病例的HLA-DR表達的陽性細胞計數(shù)絕對值，AIH為9±2；PBC為8±3；對照組患者中為17±1。HLA-DR在AIH、PBC及脂肪肝組3組患者比較其結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P=0.015，P<0.05)，AIH與脂肪肝組比較具有統(tǒng)計學意義(P=0.017，P<0.05)。

2.3 CD40與HLA-DR的相關(guān)性分析顯示CD40與HLA-DR呈正相關(guān)，(r=0.851)。

2.4 CD40、HLA-DR與自身免疫性肝病患者的臨床化驗因素的關(guān)系 入選患者的基本情況見表1。CD40與肝病患者的生化結(jié)果相關(guān)性比較見表2。HLA-DR與肝病患者的生化結(jié)果相關(guān)性比較見表3。

3 討論

自身免疫性肝病的具體發(fā)病機制至今未明,但有證據(jù)顯示自身免疫性肝病中單核-巨噬細胞的吞噬能力下降[8]，抗原提呈能力減低，從而造成自身免疫功能的紊亂。近期研究提示單核-巨噬細胞功能異常與自身免疫性肝病的發(fā)病密切相關(guān)。正常人群的單核-巨噬細胞可吞噬抗原，以人白細胞抗原分子呈遞給T淋巴細胞，激活細胞因子，啟動特異性免疫-T細胞介導的抗原細胞凋亡，同時激活B細胞分泌特異性抗體。有研究顯示自身免疫性肝病動物模型的單核-巨噬細胞的吞噬能力降低[8]，使細胞凋亡降解的產(chǎn)物，即凋亡小體大量不能及時被吞噬，導致凋亡小體大量積累、破裂，釋放自身抗原，啟動自身免疫反應(yīng)。不僅如此，近期研究還發(fā)現(xiàn)自身免疫性肝病動物模型和患者血清的單核-巨噬細胞抗原提呈能力亢進，繼而刺激T細胞及B細胞大量增殖亦加重了自身免疫反應(yīng)。由此可見固有免疫中單核-巨噬細胞的功能紊亂是導致自身免疫性肝病發(fā)病的重要因素。

表1 入選病例的基本情況

注：ALT:谷丙轉(zhuǎn)氨酶，AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶，ALP：堿性磷酸酶，GGT：谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，TBIL：總膽紅素，ALB：白蛋白，TP：總蛋白。

表2 CD40與肝病患者的生化結(jié)果相關(guān)性

CD40與AIH的ALT、AST具有相關(guān)性(*P<0.05)。

表3 HLA-DR與肝病患者的生化結(jié)果相關(guān)性

HLA-DR與AIH的ALT、SAT具有相關(guān)性(*P<0.05)。

CD40的分子質(zhì)量為48-50 KD，屬I型跨膜糖蛋白，是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一[9]。主要表達于不同分化階段的B細胞、T細胞、單核-巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)等[10]。CD40與其配體(CD40L)相互作用，廣泛參與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)，包括細胞增殖、成熟、凋亡，以及調(diào)節(jié)包括細胞因子、趨化因子和黏附分子在內(nèi)的炎癥介質(zhì)的表達。CD40-CD40L共刺激途徑是指在首先未活化的抗原提呈細胞處理抗原，形成MHC-抗原肽復合物，再以MHC-抗原肽復合物的形式向幼稚的T淋巴細胞傳遞信號(第一信號)，上調(diào)T淋巴細胞表面CD40L分子的水平；其次T淋巴細胞表面的CD40L分子與抗原呈遞細胞CD40相結(jié)合，經(jīng)活化的抗原呈遞細胞可以上調(diào)B7-1、B7-2等共刺激分子，增強了共刺激的活性，傳遞第二信號，進一步以活化T淋巴細胞[9]。專職抗原呈遞細胞表面的MHC -II類分子結(jié)合其相應(yīng)配體，發(fā)生交聯(lián)以后可以通過激活不同的信號轉(zhuǎn)導途徑來引起其效應(yīng)細胞的某些功能的改變，引起各種效應(yīng)發(fā)生，參與效應(yīng)細胞的活化、增殖、分化，上調(diào)協(xié)同刺激分子的表達、分泌細胞因子以及細胞凋亡等生物行為和功能的變化。

Schmilovitz的研究發(fā)現(xiàn)慢性病毒性肝炎、爆發(fā)性肝炎和肝細胞癌患者血清sCD40的濃度較健康人顯著增高(P<0.001)[11]。研究發(fā)現(xiàn)血清sCD40的濃度與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AsT)明顯正相關(guān)，提示血清sCD40可作為肝損傷的評價指標[11]。HLA-DR是一種MHC-II類分子，含有2個分子量分別為36kD和27kD的亞基(α亞基和β亞基)；HLA-DR表達于B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、活化T淋巴細胞、活化NK淋巴細胞等[12]。

本實驗中，我們觀察到自身免疫性肝病肝臟kupffer細胞表面抗原提呈分子HLA-DR類分子較非自身免疫性肝病患者數(shù)量減少，而協(xié)同刺激分子CD40表達較非自身免疫性肝病患者亦減少，兩組試驗結(jié)果均具有統(tǒng)計學意義。比較CD40與HLA-DR的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)CD40與HLA-DR呈正相關(guān)，提示在MHC-Ⅱ類分子表達下降的同時，共刺激分子CD40的表達也下降。我們推測自身免疫性肝病患者的抗原呈遞分子HLA-DR及其共刺激分子CD40數(shù)量減少，表達下降，導致不能正常啟動免疫應(yīng)答反應(yīng)，使免疫功能發(fā)生紊亂。單核-巨噬細胞抗原提呈功能的下降會導致非致病性外來抗原、病毒或細菌以及自身凋亡小體不能及時被吞噬、清理，而在體內(nèi)堆積，引起并加重炎癥反應(yīng)，導致肝臟功能進一步損傷。

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Expression of CD40 and HLA-DR in Kupffer Cells of Autoimmune Liver Disease

LIHong-xia,GUOLi-ping,ZHANGJun,etal.

(TianjinTEDAHospital,Tianjin300457,China)

Objective To study the expression changes of Kupffer cell antigen presenting molecules in autoimmune liver disease.Methods Patients were divided into autoimmune hepatitis (AIH) group,primary biliary cholangitis(PBC) group,while fatty liver l hepatitis as a control group.Immunohistochemical staining of CD40 and HLA-DR were performed,random selection of 10 high-power mirror field of vision (400 times),then compare the differences with variance analysis.Results The number of the positive cells in the autoimmune liver disease group was lower than that in the control group.The positive product is brown granular or brown stain,mainly located in the cell membrane,little part is located in the cytoplasm.The results showed that there was statistical significance (P=0.04,P< 0.05)among the three groups.There was no significant difference between the AIH group and the PBC group (P=0.428,P>0.05).There was significant difference between AIH and NALD(P=0.02,P<0.05).(3) HLA-DR in autoimmune hepatitis group,the positive cells was lower than the control group,the staining positive products were brown particles,mainly located in the cell membrane.The absolute value of HLA-DR positive Kupffer cell count was calculated and the results showed that the 3 groups had statistical significance (P=0.015,P<0.05),There was no statistically significant between AIH and NALD (P=0.017,P<0.05).(4) CD40 and HLA-DR showed a positive correlation.(5) CD40,HLA-DR showed correlation withALT/AST in AIH.Conclusion CD40 and HLA-DR in patients with autoimmune liver disease was less than that of non autoimmune liver disease,and CD40,HLA-DR and liver function damage is correlated.It suggested that autoimmune liver disease may be weakened by Kupffer cell antigen presenting function,which is one of the causes of liver damage in autoimmune liver diseases.

autoimmune hepatitis disease;antigen-presenting;liver disfunction

天津市濱海新區(qū)衛(wèi)生局科技項目(2013BWKY017)

1007-4287(2017)08-1350-04

R575.1

A

2016-12-10)