杜金戈，王應(yīng)軍，武陽，成晶星

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，成都 611130）

釔（Y3+）對缺氮、缺磷脅迫下銅綠微囊藻生長和生理特性及藻毒素釋放的影響

杜金戈，王應(yīng)軍*，武陽，成晶星

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，成都 611130）

為探究稀土元素釔（Y3+）對缺氮、缺磷脅迫下銅綠微囊藻生長的影響，測定了缺素脅迫下不同Y3+濃度時藻的生長量、葉綠素a、可溶性糖、可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、過氧化物酶POD）以及丙二醛（MDA）和藻毒素（MC-LR）含量。結(jié)果表明：在缺氮、缺磷脅迫下，Y3+對銅綠微囊藻的生長表現(xiàn)出低促高抑的“Hormesis”現(xiàn)象。低濃度Y3+（0.10～0.20 mg·L-1）能維持銅綠微囊藻的生長，增強(qiáng)抗氧化酶活性，減輕缺素脅迫造成的損傷；高濃度Y3+（0.50～2.00 mg·L-1）則加劇缺氮、缺磷脅迫對藻的迫害，光合色素、可溶性糖及可溶性蛋白含量呈明顯的下降趨勢，抗氧化酶活性受到抑制，膜質(zhì)過氧化程度加重，MC-LR含量增加。

釔；稀土元素；銅綠微囊藻；微囊藻毒素-LR；生理特性

氮、磷是藻類維持正常生命活動的必需元素[1]。過量氮、磷進(jìn)入水體后引起藻類及浮游植物等迅速繁殖，自然生態(tài)平衡遭到破壞，富營養(yǎng)化程度日益加劇，造成一系列嚴(yán)重的水體污染問題[2-3]。但在缺氮、缺磷脅迫下，藻類光合作用中的卡爾文循環(huán)受到抑制，生長代謝緩慢，細(xì)胞生物量維持在較低水平[4]。銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）是我國湖泊水體富營養(yǎng)化的主要優(yōu)勢種群之一[5]，大量增殖易引發(fā)藍(lán)藻水華并釋放危害人體健康的微囊藻毒素[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，在貧營養(yǎng)湖泊中藍(lán)藻細(xì)胞能有效利用并儲存環(huán)境中少量的營養(yǎng)元素，某些微量元素的輸入也可能造成低營養(yǎng)水體水華爆發(fā)[7]。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，進(jìn)入環(huán)境中的微量元素稀土總量不斷增加，大量研究表明，稀土對植物的生長有重要作用。稀土鑭能提高植物葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與光合強(qiáng)度，從而促進(jìn)植物對營養(yǎng)元素的吸收、刺激幼苗的萌發(fā)生長[8]。鈰能增強(qiáng)植物幼苗細(xì)胞的抗氧化酶活性，維持細(xì)胞內(nèi)ROS平衡，緩解外界脅迫的毒害作用[9]。由于與Ca2+具有相似的理化性質(zhì)，稀土離子能取代Ca并與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，通過Ca2+-CaM信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成。稀土對藻類的影響同植物類似，與糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝密切相關(guān)。

釔（Y）是重稀土金屬元素之一，本課題組已就稀土釔（Y3+）對銅綠微囊藻生長的影響作了系列報道。已有的結(jié)果表明：適度濃度的外源Y3+（0.05～0.20 mg· L-1）可以促進(jìn)藍(lán)藻增殖，提高其生理代謝水平[7]，并緩解重金屬的毒害效應(yīng)[10]，但尚不能完全揭示和闡明稀土元素與水華藍(lán)藻暴發(fā)之間的相關(guān)性及其影響機(jī)制。基于此，本研究設(shè)置缺氮、缺磷脅迫等實驗條件以模擬貧營養(yǎng)水體環(huán)境，通過測定稀土Y3+對銅綠微囊藻生長狀況的影響、抗氧化酶活等生理指標(biāo)的變化以及對藻毒素含量的影響，進(jìn)一步探究稀土元素對水體富營養(yǎng)化形成的影響及作用機(jī)制，也為全面評估稀土元素的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種

實驗所用銅綠微囊藻FACHB912，購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所。該株系采自太湖，實驗前在BG11培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)備用。

接種過程：對數(shù)期時離心收集藻細(xì)胞，并用不含氮磷的BG11培養(yǎng)基洗滌3次，將各個處理組的細(xì)胞密度調(diào)整在相當(dāng)水平上。再重新接種到以下3個處理組的培養(yǎng)基中：空白對照組CK（BG11培養(yǎng)基）、缺氮脅迫的實驗組DN（不含氮源的BG11培養(yǎng)基）和缺磷脅迫的實驗組DP（不含磷源），培養(yǎng)基中藻密度約為1.2×106cells·mL-1。

培養(yǎng)過程：將接種后的培養(yǎng)基置于無菌光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置光照強(qiáng)度為2000～2500lx，溫度為（25±0.5）℃，光暗比12 h∶12 h，每日早中晚搖動錐形瓶，并隨機(jī)更換位置，防止因光照不均勻帶來影響。

1.2 Y3+貯備液

稱取一定量Y2O3粉末（AR，成都恒瑞新材料有限公司），加入少量蒸餾水和濃鹽酸（AR），加熱溶解使多余的鹽酸充分揮發(fā)后，用蒸餾水稀釋配制成1000 mg·L-1（以Y3+計）的貯備液高壓滅菌后備用。

1.3 實驗設(shè)計

向?qū)嶒灲M中加入Y3+貯備液，使各實驗組每個錐形瓶中Y3+的濃度為0、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg· L-1，每種處理3個平行。以16 d為實驗周期，每日測定藻密度。并分別于第4、8、12、16 d時測定葉綠素a、可溶性糖、可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性、丙二醛及藻毒素MC-LR含量。

1.4 藻密度測定

取1 mL藻液，加1滴魯哥氏液固定藻細(xì)胞，用血球計數(shù)板在Olympus光學(xué)顯微鏡下計數(shù)并計算藻細(xì)胞密度。每個樣品計數(shù)3次，與均值之差在±20%，否則重新計數(shù)，實驗中最大生物量用生長曲線上最大值表示。

1.5 葉綠素a與可溶性糖含量的測定

葉綠素a含量的測定：采用丙酮萃取法[11]。從培養(yǎng)基中取3 mL藻液4℃高速離心10 min，棄去上清液，用去離子水反復(fù)沖洗3次，盡可能減少Y3+的影響。再加入1.5 mL 10%丙酮，用渦旋混勻器混勻。錫箔紙包裹在4℃冰箱中避光萃取24 h。再經(jīng)高速離心10 min后取上清液，以90%丙酮作為參比，分別測定上清液在波長663、750、645、630 nm的吸光度。

式中：V1為提取液體積，mL；V2為藻液體積，mL；ρ為藻細(xì)胞密度，cells·mL-1；Chl-a為葉綠素a含量，μg· （108cells）-1。

可溶性糖含量的測定：取10 mL藻液于離心管中，沸水浴10 min。常溫冷卻后，8000 r·min-1離心10 min，取上清液于10 mL試管中用蒸餾水定容至10 mL搖勻備用。采用蒽酮硫酸比色法[12]，使用南京建成生物工程研究所植物可溶性糖檢測試劑盒進(jìn)行測定。于波長620 nm處讀取吸光度值。

1.6 粗酶液提取與可溶性蛋白含量的測定

粗酶液的提?。涸趯嶒灥牡?、8、12、16 d取10 mL藻液，10 000 r·min-1離心10 min，收集藻細(xì)胞。加0.05 mol·L-1、pH為7.8的磷酸緩沖液1.5 mL（南京建成生物工程研究所），于液氮內(nèi)反復(fù)凍融5次，然后在4℃下10 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。

取上述方法提取的粗酶液，利用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白含量。

1.7 抗氧化酶活性和丙二醛含量的測定

利用1.6中提取的粗酶液測定抗氮化酶活性和MDA含量。SOD的活性采用羥胺法測定[13]。POD利用愈創(chuàng)木酚法測定[13]。CAT利用鉬酸銨比色法測定[14]。MDA采用硫代巴比妥酸TBA比色法測定。以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所測試盒完成測定。

1.8 微囊藻毒素MC-LR的測定

在試驗第4、8、12、16 d時，取10 mL藻液，4℃下10 000 r·min-1離心10 min，取上清。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），用全自動酶標(biāo)儀（Bio-Tek，EL309型）進(jìn)行測定。

1.9 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

對所得數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性檢驗采用Duncan新復(fù)極差法，當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為各組之間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀土Y3+對氮、磷缺乏狀態(tài)下銅綠微囊藻生長的影響

由圖1可知，CK空白對照組的生長期可明顯分為適應(yīng)期、對數(shù)期、穩(wěn)定期以及衰退期。從培養(yǎng)第3 d開始，藻細(xì)胞的生長進(jìn)入指數(shù)增長期。在第9 d時細(xì)胞生物量達(dá)到最大為12.24×106cells·mL-1，在穩(wěn)定期停留4 d后迅速進(jìn)入衰退期。在整個實驗周期內(nèi)，DN、DP實驗組生物量均顯著低于CK空白對照組。表明環(huán)境中營養(yǎng)元素的缺乏確實不利于藻類的增殖生長[6，15]。

缺氮脅迫下，Y3+濃度在0～0.50 mg·L-1的區(qū)間，銅綠微囊藻的生長總體呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。在Y3+濃度為0.10 mg·L-1時，藻細(xì)胞增長幅度顯著高于單一缺氮脅迫對照組（P＜0.01），在第7 d達(dá)到最大生物量3.73×106cells·mL-1，維持3 d穩(wěn)定期后迅速衰減，藻細(xì)胞對數(shù)生長期比單一脅迫組增加2～3 d，且最大生物量提高了20.3%。說明0.10 mg·L-1的稀土Y3+能促進(jìn)缺氮脅迫下銅綠微囊藻的增殖生長，延長細(xì)胞生長的對數(shù)期，增強(qiáng)藻的抗逆性。當(dāng)Y3+濃度超過0.10 mg·L-1時，Y3+對缺氮脅迫下的銅綠微囊藻促進(jìn)不明顯。在第4 d達(dá)到最大生物量后迅速進(jìn)入衰減期。隨著Y3+濃度增大，稀土Y3+的抑制作用逐漸增強(qiáng)，生物量銳減，生長速率放緩。當(dāng)稀土Y3+濃度達(dá)到2.00 mg·L-1時，銅綠微囊藻的生長完全被抑制（P＜0.05），在第3 d只能觀察到死亡藻細(xì)胞的碎片。因此，在后面生長及生理特性的分析中不考慮此濃度。

在缺磷脅迫下，不加稀土Y3+的對照組可以保持10 d的指數(shù)生長期，細(xì)胞密度最大為6.19×106cells· mL-1，銅綠微囊藻在缺氮培養(yǎng)基中細(xì)胞的生物量明顯低于缺磷培養(yǎng)基中的生長，細(xì)胞密度最大達(dá)到3.10× 106cells·mL-1，說明銅綠微囊藻對磷缺乏的耐受能力高于對氮缺乏的耐受能力（P＜0.05）。可能是由于銅綠微囊藻生長對磷的需求多取決于胞內(nèi)磷[16]。0.10、0.20 mg·L-1的Y3+溶液對缺磷脅迫下的銅綠微囊藻的增殖生長有極顯著的促進(jìn)作用（P＜0.01），最大生物量分別提高了35.3%、18.6%。相反，高濃度Y3+（0.50～2.00 mg·L-1）能強(qiáng)烈抑制銅綠微囊藻的生長，且抑制作用隨著Y3+濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)Y3+濃度提高到2.00 mg·L-1時，藻細(xì)胞完全不增長，在此后的生理指標(biāo)分析中不再考慮這一濃度。

圖1 Y3+對缺氮、缺磷脅迫下的銅綠微囊藻生長曲線的影響Figure 1 The effect of Y3+on the growth of M.aeruginosa in nitrogen and phosphorus deficiency

2.2 稀土Y3+對氮、磷缺乏狀態(tài)下銅綠微囊藻葉綠素a與可溶糖含量的影響

2.2.1 對葉綠素a含量的影響

圖2 Y3+對缺氮、缺磷脅迫下的銅綠微囊藻葉綠素a（a）與可溶性糖（b）含量的影響Figire 2 The effect of Y3+on the Chl-a（a）and soluble sugar（b）content of M.aeruginosa in nitrogen and phosphorus deficiency

根據(jù)實驗結(jié)果，選擇第12 d的數(shù)據(jù)為代表作分析討論。藻體中葉綠素a含量可作為評估植物或藻類生長狀況的重要指標(biāo)之一。由圖2（a）可知，在培養(yǎng)第12 d時，CK對照組葉綠素a含量為2.74 μg·（108cells）-1，顯著高于任意DN、DP實驗組。缺磷脅迫下，在Y3+濃度為0.00～1.00 mg·L-1范圍內(nèi)，銅綠微囊藻葉綠素a含量隨Y3+濃度先增后減，Y3+濃度為0.10、0.20 mg·L-1時比單一缺磷脅迫培養(yǎng)下的銅綠微囊藻葉綠素a含量分別提高了20.9%、15.1%。葉綠素含量最高時為2.41 μg·（108cells）-1。表明低濃度的Y3+溶液能夠刺激光合色素合成，增強(qiáng)光合效率。當(dāng)Y3+濃度達(dá)到0.50 mg·L-1時，葉綠素含量急劇下降，顯著低于單一缺磷脅迫培養(yǎng)下的銅綠微囊藻。表明在此濃度以及更高Y3+濃度作用下，葉綠素a的生理功能喪失，藻類大量死亡。在缺氮的培養(yǎng)條件下，銅綠微囊藻葉綠素a含量變化趨勢與缺磷條件下相似，其在Y3+濃度為0.10 mg·L-1時達(dá)到最大，為2.03 μg·（108cells）-1，當(dāng)Y3+濃度大于0.10 mg·L-1時，銅綠微囊藻葉綠素a含量隨Y3+濃度的增大呈線性減少（R2=0.964）。當(dāng)稀土Y3+濃度相同時，缺磷脅迫下銅綠微囊藻的葉綠素含量均顯著大于缺氮脅迫（P＜0.05），說明在不利條件下葉綠素a的合成對氮的需求比磷更急迫。

有研究表明，稀土元素可以作為中間物質(zhì)通過與K+、Na+、Ca2+、吲哚乙酸等相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞對營養(yǎng)元素的吸收，促進(jìn)葉綠素合成[17]。當(dāng)營養(yǎng)源缺乏時，低濃度稀土Y3+可能通過協(xié)調(diào)與其他物質(zhì)的相互作用維持葉綠體的基本結(jié)構(gòu)與功能，并誘導(dǎo)葉綠素前體物質(zhì)的生成。隨著培養(yǎng)基中Y3+濃度升高，Y3+反而會造成藻細(xì)胞類囊體結(jié)構(gòu)損傷，光合作用受到抑制。

2.2.2 對可溶性糖的影響

如圖2（b）所示，DN、DP實驗組所有Y3+濃度下銅綠微囊藻可溶性糖含量均低于不缺氮磷的CK對照組。缺磷脅迫下，Y3+濃度在0～0.20 mg·L-1區(qū)間內(nèi)，可溶性糖含量呈線性減少（R2=0.986 8）。當(dāng)Y3+濃度大于0.20 mg·L-1時，可溶性糖含量有所升高，可能是高濃度Y3+脅迫下，藻細(xì)胞破裂，可溶性糖流出，造成培養(yǎng)基可溶性糖濃度升高。缺氮脅迫下，可溶性糖含量變化趨勢與缺磷脅迫大致相同。在Y3+濃度為0.10 mg· L-1時，可溶性糖含量最低為0.11 μg·（108cells）-1，相比缺磷脅迫降低了72.8%。當(dāng)Y3+濃度達(dá)到0.20 mg·L-1及以上時，可溶性糖含量維持在較低水平，其大小無顯著變化（P＞0.05）。

2.3 稀土Y3+對氮、磷缺乏狀態(tài)下銅綠微囊藻抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

2.3.1 對抗氧化酶活性的影響

活性氧ROS是自然生理過程產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物，氧化植物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[18-19]。SOD、POD和CAT是抗氧化酶防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶，維持胞內(nèi)ROS產(chǎn)生與消除平衡[18]。嚴(yán)重脅迫下，細(xì)胞產(chǎn)生的ROS不能被抗氧化系統(tǒng)及時消除而大量累積，從而抑制抗氧化酶活性[20-21]。

缺氮、磷脅迫下，SOD、POD和CAT活性隨稀土Y3+濃度變化的趨勢大致相同，即低濃度的Y3+能促進(jìn)抗氧化酶活性的增強(qiáng)，高濃度則抑制酶活性。由圖3（a）至圖3（c）可知，單一缺磷或缺氮脅迫下銅綠微囊藻抗氧化酶活性相比CK對照組顯著降低。以SOD為例，在缺磷脅迫下，銅綠微囊藻SOD活性隨Y3+濃度先升后降。SOD活性在0.10 mg·L-1的Y3+濃度時達(dá)到最大為19.66 U·（108cells）-1，此后SOD活性呈線性降低（R2=0.904 6），且缺氮脅迫下銅綠微囊藻SOD活性與缺磷培養(yǎng)的差距隨著Y3+濃度的增大而顯著減小。在缺氮脅迫下，SOD活性變化趨勢與缺磷培養(yǎng)大致相同。SOD活性的峰值16.29 U·（108cells）-1出現(xiàn)在Y3+濃度為0.10 mg·L-1時。這一結(jié)果表明Y3+對缺磷或缺氮脅迫下銅綠微囊藻抗氧化酶活性的影響有濃度限制，超過限制反而會加重對藻細(xì)胞的迫害。

2.3.2 對丙二醛含量的影響

圖3 Y3+對缺氮、缺磷脅迫下的銅綠微囊藻抗氧化酶活性與丙二醛含量的影響Figure 3 The effect of Y3+on M.aeruginosa in nitrogen and phosphorus deficiency

MDA是植物細(xì)胞衰老以及逆境脅迫下發(fā)生膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量可指示細(xì)胞膜脂過氧化水平，作為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷、藻體受脅迫程度的標(biāo)志[22-23]。由圖3（d）可知，CK組MDA含量在培養(yǎng)中始終小于脅迫組。在缺氮或缺磷脅迫下MDA含量的最小值出現(xiàn)在Y3+濃度為0.10 mg·L-1時。此后，Y3+濃度升高，實驗組MDA含量顯著增大，此時藻密度也呈下降趨勢。說明稀土Y3+在濃度大于0.20 mg·L-1時，對銅綠微囊藻產(chǎn)生脅迫作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，從而引起藻細(xì)胞大量死亡，隨著Y3+濃度的升高，脅迫程度加重。在整個實驗周期內(nèi)，缺氮條件下培養(yǎng)的銅綠微囊藻MDA總含量高于缺磷條件，且Y3+濃度越高，顯著性越強(qiáng)。說明銅綠微囊藻對缺氮脅迫比缺磷脅迫耐受性弱，Y3+濃度的增大強(qiáng)化了營養(yǎng)鹽缺乏造成的抑制效果。

2.4 稀土Y3+對氮、磷缺乏狀態(tài)下銅綠微囊藻藻毒素含量的影響

由圖4可知，缺氮、缺磷脅迫下的銅綠微囊藻在0.20～1.00 mg·L-1的Y3+作用下，MC-LR含量顯著大于單一脅迫對照組（P＜0.05）。當(dāng)Y3+濃度為0.10 mg·L-1時，缺氮、缺磷脅迫下MC-LR含量都降到最小值，分別為0.21、0.23 μg·L-1，比對照組顯著降低18.4%、10.4%。在此濃度下Y3+能增強(qiáng)抗氧化酶活性，及時清除細(xì)胞內(nèi)過量ROS，維持細(xì)胞的生理功能，MC-LR含量低。而高濃度Y3+引起藻體活性氧生成與清除失衡、細(xì)胞質(zhì)膜過氧化損傷破裂，內(nèi)容藻毒素流出。

圖4 Y3+對缺氮、缺磷脅迫下的銅綠微囊藻藻毒素含量的影響Figure 4 The effect of Y3+on the MC-LR content of M.aeruginosa in nitrogen and phosphorus deficiency

3 討論

在氮、磷元素供給不足的缺素脅迫下，銅綠微囊藻的生長與生理特性受到嚴(yán)重影響。低濃度的稀土能與銅綠微囊藻細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白或磷脂結(jié)合形成復(fù)合體，提高蛋白活性或改變轉(zhuǎn)運通道尺寸，影響細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡與生理活動，提高膜通道的運輸能力，促進(jìn)藻細(xì)胞吸收營養(yǎng)元素與增殖生長[24-25]。高濃度的稀土元素易于表現(xiàn)重金屬的特性，堆積在細(xì)胞膜表面，占據(jù)轉(zhuǎn)運通道位點，抑制營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的排出，加重細(xì)胞的膜質(zhì)過氧化程度[26]。本實驗中，缺氮、缺磷脅迫下低濃度的Y3+能改善細(xì)胞的生長代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外營養(yǎng)元素的進(jìn)出平衡，緩解藻細(xì)胞對氮磷源的需求。高濃度的Y3+則對細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，使藻細(xì)胞對營養(yǎng)元素吸收能力減弱，加速藻細(xì)胞衰亡。

從本實驗結(jié)果可以看出，在缺氮、缺磷脅迫下，低濃度的稀土Y3+對光合效率提高與葉綠素a積累有明顯的促進(jìn)作用。施加高濃度的稀土Y3+則顯著抑制藻體光合色素的合成，可能是由于高濃度Y3+脅迫造成類囊體結(jié)構(gòu)損傷、葉綠素a總量減少、光合水平降低[7]。這一結(jié)果同胡勤海等[27]的小球藻的栽培試驗結(jié)果類似，多種低濃度的稀土元素均能促進(jìn)藻細(xì)胞葉綠素a含量升高，高濃度則會導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯，趨于死亡。可溶性糖及可溶性蛋白是藻類生長必需的營養(yǎng)成分，有研究表明，低濃度的稀土溶液處理能顯著提高銀杏葉片蛋白質(zhì)、可溶性糖以及總黃酮的含量，反之則起抑制作用[28]。本實驗中，在低濃度Y3+的作用下銅綠微囊藻可溶性糖含量隨Y3+濃度升高呈降低趨勢。推測可能是由于Y3+能促進(jìn)藻類葉綠素合成，增強(qiáng)細(xì)胞的光合作用，加快可溶糖的轉(zhuǎn)化和消耗，且由于缺素脅迫，細(xì)胞內(nèi)可溶性糖與蛋白無法得到及時補(bǔ)充，因此呈線性降低趨勢。當(dāng)Y3+濃度大于0.10 mg·L-1時，營養(yǎng)元素的缺乏可能使得藻體葉綠素合成受阻，光合效率降低。藻細(xì)胞體內(nèi)糖代謝阻塞，從而使得可溶性糖含量基本維持在較低水平。

植物在遭受環(huán)境脅迫時會表現(xiàn)出“低劑量刺激，高劑量抑制”的現(xiàn)象，即“低促高抑”的“Hormesis”效應(yīng)[29]。本研究中，當(dāng)?shù)蜐舛鹊腨3+（0.10 mg·L-1）處理時，銅綠微囊藻的生長量、葉綠素a以及SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性相比對照組具有明顯的促進(jìn)升高現(xiàn)象，而高濃度（2.00 mg·L-1）時則被抑制，呈現(xiàn)出了“Hormesis”效應(yīng)。低濃度的稀土Y3+能增強(qiáng)原有抗氧化酶的酶活性，抵消缺乏營養(yǎng)鹽而產(chǎn)生的ROS，減輕缺氮條件對酶活性的影響，促進(jìn)細(xì)胞增殖生長。而高濃度的稀土Y3+則會破壞抗氧化酶防御系統(tǒng)，包括可能通過抑制蛋白質(zhì)的合成，從而使抗氧化酶的合成受到顯著影響，過量的ROS由于無法被及時清除，誘導(dǎo)細(xì)胞膜發(fā)生膜質(zhì)過氧化作用，破壞和干擾細(xì)胞膜正常的功能，導(dǎo)致MDA大量積累，嚴(yán)重干擾并妨礙胞內(nèi)正常的生理代謝水平，最終對藻細(xì)胞造成大量的氧化損傷。本研究中由于缺乏合成蛋白質(zhì)的主要元素，抗氧化酶的合成受到顯著影響。

銅綠微囊藻釋放藻毒素可能是對逆境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[30]。本實驗中，在缺氮、缺磷脅迫下，抗氧化酶活性受到抑制，ROS產(chǎn)生消除失衡，MDA含量升高。施加低濃度的Y3+能增強(qiáng)藻類對缺素脅迫的抗逆性，維持細(xì)胞正常生理功能，保持MC-LR的產(chǎn)出在合理水平上。當(dāng)Y3+濃度過高時，藻體抗氧化防御系統(tǒng)遭到破壞，應(yīng)激產(chǎn)生過量MC-LR，細(xì)胞質(zhì)膜破裂，藻細(xì)胞趨于死亡。

4 結(jié)論

（1）在缺氮、缺磷脅迫下，低濃度Y3+（0.10～0.20 mg·L-1）能促進(jìn)銅綠微囊藻的生長，這種促進(jìn)作用與Y3+濃度呈一定相關(guān)性。此時藻細(xì)胞葉綠素a、可溶性糖與可溶性蛋白含量增加，光合效率增強(qiáng)；MDA與MC-LR含量較低，藻類生長狀態(tài)良好，Y3+對抗氧化酶防御系統(tǒng)表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用。

（2）在缺氮、缺磷脅迫下，高濃度Y3+（0.20～2.00 mg·L-1）對藻的生長有顯著的抑制作用，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)光合色素含量低，可溶性糖與可溶性蛋白遭到破壞，對必需元素的吸收能力減弱。藻體活性氧生成與清除失衡，抗氧化酶活性受到抑制，細(xì)胞膜質(zhì)過氧化損傷破裂，內(nèi)容藻毒素流出。

（3）在貧營養(yǎng)水體中，Y3+對銅綠微囊藻的生態(tài)學(xué)效應(yīng)在細(xì)胞層次上表現(xiàn)出的“Hormesis”現(xiàn)象為合理預(yù)測稀土引發(fā)的生態(tài)事故提供參考依據(jù)，同時據(jù)此可推測稀土元素可能是促進(jìn)貧營養(yǎng)水體發(fā)生富營養(yǎng)化現(xiàn)象的原因之一，但更深層次的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

[1]孔繁翔,高光.大型淺水富營養(yǎng)化湖泊中藍(lán)藻水華形成機(jī)理的思考[J].生態(tài)學(xué)報,2005,25（3）：589-595.

KONG Fan-xiang,GAO Guang.Hypothesis on cyanobacteria bloomforming mechanism in large shallow eutrophic lakes[J].Acta Ecologica Sinica,2005,25（3）：589-595.

[2]程麗巍,許海,陳銘達(dá),等.水體富營養(yǎng)化成因及其防治措施研究進(jìn)展[J].環(huán)境保護(hù)科學(xué),2007,33（1）：18-21.

CHENG Li-wei,XU Hai,CHEN Ming-da,et al.Review on causes of eutrophication of water body and its control measure[J].Environmental Protection Science,2007,33（1）：18-21.

[3]秦伯強(qiáng).湖泊生態(tài)恢復(fù)的基本原理與實現(xiàn)[J].生態(tài)學(xué)報,2007,27 （11）：4848-4858.

QIN Bo-qiang.Principles and approach for lake ecological restoration [J].ActaEcologicaSinica,2007,27（11）：4848-4858.

[4]金月梅.氮磷限制對8株微藻葉綠素?zé)晒馓匦约吧L的影響[D].青島：中國海洋大學(xué),2008.

JIN Yue-mei.Effects of nutrient and phosphorus limitation on the chlorophyll fluorescence and growth of 8 microalgal strains[D].Qingdao：Ocean University of China,2008.

[5]金相燦.中國湖泊環(huán)境[M].青島：海洋出版社,1995.

JINXiang-can.Chinalakeenvironment[M].Qingdao：China OceanPress, 1995.

[6]周云龍,于明.水華的發(fā)生、危害和防治[J].生物學(xué)通報,2004,39 （6）：11-14.

ZHOU Yun-long,YU Ming.The occurrence,damage and prevention of bloom[J].Bulletin of Biology,2004,39（6）：11-14.

[7]王應(yīng)軍,陳燕,金航標(biāo),等.稀土（Y3+）對銅綠微囊藻生長和生理特性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39（4）：2248-2251.

WANG Ying-jun,CHEN Yan,JIN Hang-biao,et al.Effects of yttrium （Y3+）on physiological and biochemical characteristics of Microcystis aeruginosa[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2011,39（4）：2248-2251.

[8]張杰,黃永杰,劉雪云.鑭對鎘脅迫下水稻幼苗生長及生理特性的影響[J].生態(tài)環(huán)境,2007,16（3）：835-841.

ZHANG Jie,HUANG Yong-jie,LIU Xue-yun.Effects of La on growth and some physiological characteristics of rice seedlings under Cd stress [J].Ecology and Environment,2007,16（3）：835-841.

[9]趙朝宇,劉慧,王亞喆,等.稀土元素鈰對黃豆幼苗鉛脅迫的緩解效應(yīng)[J].天津師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）,2015,35（4）：67-70. ZHAO Chao-yu,LIU Hui,WANG Ya-zhe,et al.Alleviation effect of cerium on Pb stress in soybean seedlings[J].Journal of Tianjin Normal University（Natural Science Edition）,2015,35（4）：67-70.

[10]Wu Y,Wang Y J,Du J G,et al.Effects of yttrium under lead stress on growth and physiological characteristics of Microcystis aeruginosa[J]. Journal of Rare Earths,2016,34（7）：747-756.

[11]陳建勛,王曉峰.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].廣州：華南理工大學(xué)出版社,2008.

CHEN Jian-xun,WANG Xiao-feng.Plant physiology experiment guidance[M].Guangzhou：South China University of Technology Press, 2008.

[12]Yemm E W,Willis A J.The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone[J].Biochemical Journal,1954,57（3）：508-514.

[13]Hammerschmidt R,Nuckles E M,Kuc′J.Association of enhanced peroxidase activity with induced systemic resistance of cucumber to Colletotrichum lagenarium[J].Physiological Plant Pathology,1982,20 （1）：73-76.

[14]郝再彬.植物生理實驗技術(shù)[M].哈爾濱：哈爾濱出版社,2002.

HAO Zai-bin.Plant physiological experiment technology[M].Harbin：Harbin Press,2002.

[15]岳冬梅,李潔,肖琳.營養(yǎng)鹽恢復(fù)對氮磷饑餓銅綠微囊藻生長的影響[J].環(huán)境科學(xué),2016,37（11）：1-13.

YUE Dong-mei,LI Jie,XIAO Lin.Nutrients recovery on the growth of nitrogen and phosphorus starved Microcystis aeruginosa[J].Environmental Science,2016,37（11）：1-13.

[16]許海,吳雅麗,楊桂軍,等.銅綠微囊藻、斜生柵藻對氮磷饑餓的耐受能力研究[J].生態(tài)科學(xué),2014,33（5）：879-884.

XU Hai,WU Ya-li,YANG Gui-jun,et al.Tolerance of Microcystis aeruginosa and Scendesmus obliquus to nitrogen and phosphorus deficiency[J].Ecological Science,2014,33（5）：879-884.

[17]Chen W J,Gu Y H,Zhao G W,et al.Effects of rare earth ions on activity of RuBPcase in tobacco[J].Plant Science,2000,152（2）：145-151.

[18]李合生.現(xiàn)代植物生理學(xué)[M].二版.北京：高等教育出版社,2012.

LI He-sheng.Modern plant physiology[M].2th Edition.Beijing：Higher Education Press,2012

[19]Pinto E,Sigaud Kutner T C S,Leit?o M A S,et al.Heavy metal-induced oxidative stress in algae[J].Journal of Phycology,2003,39（39）：1008-1018.

[20]Oncel I,Yurdakulol E Y,Kurt Y,et al.Role of antioxidant defense system and biochemical adaptation on stress tolerance of high mountain and steppe plants[J].ActaOecologica,2004,26（3）：211-218.

[21]Hejl A M,Koster K L.Juglone disrupts root plasma membrane H+-ATPase activity and impairs water uptake,root respiration,and growth in soybean（Glycine max）and corn（Zeamays）[J].Journal of Chemical E-cology,2004,30（2）：453.

[22]唐萍,吳國榮,陸長梅,等.鳳眼蓮根系分泌物對柵藻結(jié)構(gòu)及代謝的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2000,20（3）：355-359.

TANG Ping,WU Guo-rong,LU Chang-mei,et al.Effects of the excretion from root system of Eichhornia crassipes on the cell structure and metabolism of Scenedesmus arcuatus[J].ActaScientiae Circumstantiae, 2000,20（3）：355-359.

[23]陳少裕.膜脂過氧化對植物細(xì)胞的傷害[J].植物生理學(xué)通訊,1991 （2）：84-90.

CHEN Shao-yu.Injury of membrane lipid peroxidation to plant cell[J]. Plant Physiology Communications,1991（2）：84-90.

[24]張民,史小麗,蔣麗娟,等.兩種外源性磷及振蕩對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）生長的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2002, 8（5）：507-510.

ZHANG Min,SHI Xiao-li,JIANG Li-juan,et al.Effects of two exogenous phosphorous and shake on the growth of Microcystis aeruginosa[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology,2002,8（5）：507-510.

[25]Petersheim M,Halladay H N,Blodnieks J.Tb3+and Ca2+binding to phosphatidylcholine：A study comparing data from optical,NMR,and infrared spectroscopies[J].Biophysical Journal,1989,56（3）：551-557.

[26]聶毓秀,陳玉蘭,王曉輝,等.鑭、釤、銪及鐿化合物對體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞的作用[J].中國稀土學(xué)報,1989,7（4）：58-64.

NIE Yu-xiu,CHEN Yu-lan,WANG Xiao-hui,et al.Effect of compounds of La,Sm,Eu,and Yb on HeLa cell culture[J].Journal of the Chinese Society of Rare Earths,1989,7（4）：58-64.

[27]胡勤海,管麗莉,葉兆杰.稀土元素對小球藻生長的影響[J].環(huán)境科學(xué),1996,17（2）：37-38.

HU Qin-hai,GUAN Li-li,YE Zhao-jie.Effects of rare earth elements on Chlorella ellipsoidea[J].Environmental Science,1996,17（2）：37-38.

[28]謝寅峰,李群,沈惠娟,等.稀土對銀杏苗木葉內(nèi)含物及其產(chǎn)量的效應(yīng)[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2000,24（6）：71-74.

XIE Yin-feng,LI Qun,SHEN Hui-juan,et al.Effects of rare earth elements on some leaf inclusion and leaf yield in seedlings of Ginkgo biloba[J].Journal of NanjingForestry University,2000,24（6）：71-74.

[29]郭蘭萍,張小波,楊光,等.Hormesis及其在藥用植物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志,2011,36（5）：525-529.

GUO Lan-ping,ZHANG Xiao-bo,YANG Guang,et al.Hormesis and its application in medicinal plant growing[J].China Journal of Chinese MateriaMedica,2011,36（5）：525-529.

[30]張瑋,林一群,郭定芳,等.不同氮、磷濃度對銅綠微囊藻生長、光合及產(chǎn)毒的影響[J].水生生物學(xué)報,2006,30（3）：318-322.

ZHANG Wei,LIN Yi-qun,GUO Ding-fang,et al.Concentrations on growth,photosynthesis and microcystin production of Microcystis aeruginosa[J].ActaHydrobiologicaSinica,2006,30（3）：318-322.

Effects of yttrium on growth and physiological characteristics and microcystin release of Microcystis aeruginosa under nitrogen and phosphorus deficiency

DU Jin-ge,WANG Ying-jun*,WU Yang,CHENG Jing-xing
（College of Environment,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China）

Yttrium is a rare earth heavy metal element which has been gradually considered as an important metal pollutant because of its serious adverse effects on aquatic ecosystems.Under the condition of nitrogen and phosphorus deficiency,the growth and metabolism of algae are slow.In order to explore the effects of Y3+on growth and physiological characteristics and microcystin release of Microcystis aeruginosa under nitrogen and phosphorus deficiency,we measured the growth curves of Microcystis aeruginosa and the contents of chlorophyll a, soluble sugar,soluble protein,microcystin-LR;the activity of antioxidant enzymes[superoxide dismutase（SOD）,catalase（CAT）,peroxidase（POD）,and malondialdehyde（MDA）].The results showed that the growth of Microcystis aeruginosa exhibited the hormesis phenomenon as a result of Y3+.Low concentrations of Y3+（0.10～0.20 mg·L-1）could effectively improve the growth of Microcystis aeruginosa and enhance the activity of antioxidant enzymes under the condition of nitrogen and phosphorus deficiency,reducing the damage caused by the lack of nutrients.High concentrations of Y3+（0.50～2.00 mg·L-1）exacerbated the damage caused by the nutrient deficiency.Photosynthetic pigments,soluble sugar,and soluble protein content decreased gradually,and the degree of membrane lipid peroxidation and the content of microcystin-LR showed apparent upward trends with the increase of Y3+concentration.

yttrium;rare earth elements;Microcystis aeruginosa;microcystin-LR;physiological characteristics

X171.5

A

1672-2043（2017）08-1500-08

10.11654/jaes.2017-0495

2017-04-05

杜金戈（1995—），女，山西呂梁人，本科生，研究方向為環(huán)境生態(tài)工程。E-mail：dujingesx@126.com

*通信作者：王應(yīng)軍E-mail：wwyyjj1972@163.com

杜金戈，王應(yīng)軍，武陽，等.釔（Y3+）對缺氮、缺磷脅迫下銅綠微囊藻生長和生理特性及藻毒素釋放的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2017,36（8）：1500-1507.

DU Jin-ge,WANG Ying-jun,WU Yang,et al.Effects of yttrium on growth and physiological characteristics and microcystin release of Microcystis aeruginosa under nitrogen and phosphorus deficiency[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（8）：1500-1507.