金武 杜榮輝 曹探賾

初治肺結(jié)核患者維生素D與其受體基因多態(tài)性位點(diǎn)FokI的相關(guān)性分析

金武 杜榮輝 曹探賾

目的 分析初治肺結(jié)核患者血清維生素D(VD)與維生素D受體(VDR)基因多態(tài)性位點(diǎn)FokI的相關(guān)性。方法 對(duì)我院隨機(jī)選取的180位初治肺結(jié)核患者和100位正常對(duì)照的血清VD水平，VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)FokI基因型進(jìn)行檢測(cè)，比較和分析2組血清VD水平與VDR基因FokI多態(tài)性差異以及相關(guān)性。結(jié)果 初治肺結(jié)核患者血清VD水平明顯低于正常對(duì)照組(P<0.0001)；初治肺結(jié)核組VD營養(yǎng)缺乏率(70.5%)明顯高于正常對(duì)照組(47.0%)，VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)FokI的三種基因型(純合子FF，純合子ff和雜合子Ff)在兩組內(nèi)的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)，初治肺結(jié)核組純合子ff及等位基因f比率明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；初治肺結(jié)核患者基因型ff組VD水平明顯低于基因型FF組和基因型Ff組(P<0.05)。結(jié)論 初治肺結(jié)核患者血清VD水平明顯下降，VDR 基因多態(tài)性位點(diǎn)FokI基因型ff為肺結(jié)核易感基因。

初治肺結(jié)核；維生素D；維生素D 受體；FokI；基因多態(tài)性

肺結(jié)核是目前全世界重要的公共衛(wèi)生問題。越來越多研究顯示維生素D(VD)在肺結(jié)核防治方面有一定作用。研究表明，VD 的活化代謝產(chǎn)物1,25-二羥維生素D3 (1,25-(OH)2-D3)可誘導(dǎo)并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺菌功能。VD的缺乏與結(jié)核易感性存在相關(guān)性[1]。維生素D受體(VDR)是由染色體12q上的VDR基因編碼，該基因具有多種單核苷酸多態(tài)性，且VDR基因多態(tài)性也與活動(dòng)性肺結(jié)核易感性有關(guān)[2]。但是VD與VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)的關(guān)系還不明確。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)初治肺結(jié)核患者血清VD水平和VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)FokI的檢測(cè)，擬明確初治肺結(jié)核患者血清VD水平與VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)FokI的相關(guān)性。

資料與方法

一、研究對(duì)象

隨機(jī)選取2015年4月至2016年10月期間在我院就診的初治肺結(jié)核患者(180例)，以及同一時(shí)期在我院體檢的正常對(duì)照(100例)作為研究對(duì)象。依據(jù)肺結(jié)核診斷和治療指南[3]診斷初治肺結(jié)核。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并患有人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、肝臟疾病、腎功能衰竭、腎結(jié)石、惡性腫瘤、糖尿病、懷孕、甲狀旁腺功能亢進(jìn)；服用任何糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、噻嗪類利尿劑、鈣補(bǔ)充劑、VD等。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，所有實(shí)驗(yàn)均符合本院倫理委員會(huì)規(guī)定。

二、研究方法

1 血清VD的檢測(cè)：兩組均于清晨空腹留取外周靜脈血5mL，其中3mL用于制備血清，-70℃冰箱凍存?zhèn)錂z。另外2mL提取全基因組DNA，-20℃冰箱凍存?zhèn)錂z。VD采用放射免疫法(radiate immuno assay, RIA)檢測(cè)，使用25-(OH)D3放射免疫試劑盒(DiaSorin, USA)對(duì)血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。所有的檢測(cè)步驟均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

2 VDR 基因FokI多態(tài)性檢測(cè)：采用苯酚/氯仿提取法提取全血基因組DNA。根據(jù) Genebank 中 VDR 基因的序列，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成含F(xiàn)okI多態(tài)位點(diǎn)的引物[4]，即正義鏈5’-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3’，反義鏈5’- ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3’。采用PCR試劑盒(Beyotime, China)擴(kuò)增VDR基因目的片段，然后用限制性內(nèi)切酶FokI(New England Biolabs)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在37℃下酶切反應(yīng)4小時(shí)。限制性酶切片段在2.5% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。根據(jù)酶切模式，基因型分為：純合子FF，產(chǎn)物大小為265bp；純合子ff，產(chǎn)物大小為169bp和96bp；雜合子Ff，產(chǎn)物大小分別為265bp，169bp和96bp。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清VD的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)初治肺結(jié)核(PTB)和正常對(duì)照組(Con.)的基本特征及血清25-(OH)D3的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，初治肺結(jié)核患者的平均體質(zhì)量指數(shù) (body mass index，BMI)，25-(OH)D3水平明顯低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。兩組在年齡和性別的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。(見表1)。

表1 研究對(duì)象的基本特征±s)

二、VD營養(yǎng)水平差異

為更清楚地觀察VD營養(yǎng)水平在初治肺結(jié)核和正常對(duì)照組中的分布特征，我們按VD缺乏(<20 ng/mL)、不足(20-30 ng/mL)、充足(>30 ng/mL)進(jìn)行分層比較[5]。PTB組VD營養(yǎng)缺乏率達(dá)70.5%，高于正常對(duì)照組的47.0%。PTB組VD水平充足的比例僅12.8%，低于正常對(duì)照組的22.0%。2組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.202,P=0.0005)。(見表2)。

表2 初治肺結(jié)核患者血清VD營養(yǎng)水平差異(n%)

三、VDR基因FokI多態(tài)性變化

根據(jù)FokI 多態(tài)性位點(diǎn)的差異，VDR的基因型分為：純合子FF，酶切產(chǎn)物大小為265bp；純合子ff，酶切產(chǎn)物大小為169bp和96bp；雜合子Ff，酶切產(chǎn)物大小分別為265bp，169bp和96bp，(見圖1)。在肺結(jié)核組和正常對(duì)照組內(nèi)均檢測(cè)到這三種基因型。其中，PTB患者VDR基因FF基因型比率(28.3%)低于正常對(duì)照組(42.0%)，ff基因型比率(13.9%)高于正常對(duì)照組(7.0%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=6.818,P=0.033)。PTB患者VDR基因等位基因F比率(57.2%)低于正常對(duì)照組(67.5%)，等位基因f比率(42.8%)高于正常對(duì)照組(32.5%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=5.703,P=0.017)。(見表3)。

圖1 限制性內(nèi)切酶檢測(cè)VDR基因FokI 多態(tài)性位點(diǎn)。純合子FF 無 FokI酶切位點(diǎn)，酶切電泳后只有一個(gè)條帶(265bp，Line2，6和7)；純合子ff含有FokI酶切位點(diǎn)，酶切電泳后有兩個(gè)條帶(169bp和96bp，Line4，8和9)；雜合子Ff含有FokI酶切位點(diǎn)，酶切電泳后有3個(gè)條帶(265bp，169bp和96bp，Line3，5和10)。M=Marker，Line1為非酶切PCR產(chǎn)物(265bp)。

表3 初治肺結(jié)核患者與正常對(duì)照組VDR基因FokI多態(tài)性比較(例%)

四、VDR基因FokI多態(tài)性與VD的關(guān)系

通過分析初治肺結(jié)核患者VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)FokI三種基因型與VD的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，純合子ff組25-(OH)D3水平明顯低于純合子FF組和雜合子Ff組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。純合子FF組和雜合子Ff組25-(OH)D3水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見表4)。

表4 初治肺結(jié)核患者及正常對(duì)照組FokI多態(tài)性與VD的關(guān)系

討 論

維生素D調(diào)整人體鈣磷代謝平衡的作用已得到廣泛認(rèn)同。隨著對(duì) VD 的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，它還有免疫調(diào)節(jié)功能，減少呼吸消化系統(tǒng)的感染性疾病發(fā)病率[6]。VD 的免疫調(diào)節(jié)作用是多方面的[7]，一方面，VD可促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染人體后，巨噬細(xì)胞分泌大量多種細(xì)胞因子，進(jìn)而刺激 T 淋巴細(xì)胞活化，分泌包括 IFN-γ在內(nèi)的很多細(xì)胞因子，以盡快啟動(dòng)抗結(jié)核免疫反應(yīng)；另一方面，VD 可通過抑制抗原呈遞細(xì)胞的成熟，防止抗原呈遞細(xì)胞過度刺激 T 淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié) T 淋巴細(xì)胞的適度反應(yīng)，抑制 TNF-α過量產(chǎn)生的免疫病理損傷。

維生素D有3種代謝產(chǎn)物：1, 25-(OH)2-D3，1,24,25-(OH)3-D3，25-(OH)D3。其中以25-(OH)D3在血液中濃度最高，最穩(wěn)定，且半衰期最長，又是合成1, 25-(OH)2-D3的前體。因此，它是反映體內(nèi)維生素D的最佳指標(biāo)[5,8]。VDR是維生素D生物活性形式1, 25-(OH)2-D3發(fā)生作用的主要受體。VDR基因于1988年被克隆出來，其位于人12號(hào)染色體長臂上，包括9個(gè)編碼的外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，共編碼427個(gè)氨基酸，5’端非編碼區(qū)包括1A、1B、1C外顯子，2-9號(hào)外顯子編碼基因的蛋白產(chǎn)物。VDR基因具有高度多態(tài)性，目前報(bào)道有22個(gè)點(diǎn)突變均可導(dǎo)致基因功能缺失，已經(jīng)證實(shí)基因多態(tài)性與多種疾病相關(guān)，如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、乳腺癌、糖尿病、惡性黑色素瘤、銀屑病、骨質(zhì)疏松等[9]。VDR基因有4個(gè)常見的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，分別是FokI、BsmI、ApaI和TaqI。多態(tài)性位點(diǎn)FokI位于VDR基因第2外顯子的起始密碼子上，是唯一能影響編碼氨基酸的多態(tài)位點(diǎn)，目前很多實(shí)驗(yàn)證明該位點(diǎn)是由于427ATG→ACG突變導(dǎo)致，其多態(tài)性的存在使VDR基因第2外顯子上有兩個(gè)潛在的起始轉(zhuǎn)錄點(diǎn)，即使VDR翻譯從第2個(gè)密碼子開始，從而導(dǎo)致翻譯出的蛋白質(zhì)比正常VDR基因編碼少了3個(gè)氨基酸(aa)，為424個(gè)aa，但424aa的轉(zhuǎn)錄活性大大增強(qiáng)[10-11]

本實(shí)驗(yàn)在初治肺結(jié)核組和正常對(duì)照組內(nèi)均檢測(cè)到VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)FokI三種基因型FF，F(xiàn)f，ff。在VDR 基因多態(tài)性中，F(xiàn)F 型(42.0%)及 Ff 型(51.0%)在普通人群中所占的比例較高，而 ff基因型(7.0%)所占人群比例偏低，但相比較初治肺結(jié)核的患病人群中，攜帶ff 基因型(13.9%)的患者遠(yuǎn)高于普通人群攜帶ff基因的比例，因此很多科研人員認(rèn)為ff型基因?yàn)榻Y(jié)核易感基因。通過分子生物學(xué)方面的研究還發(fā)現(xiàn)，VDR 基因 FokI 位點(diǎn)中ff基因型影響 VDR 活性，致使 VDR 與 VD 形成復(fù)合體發(fā)揮抗結(jié)核的功能受到了不利影響[12-13]。

VD 在人體內(nèi)發(fā)揮作用是通過保持其適宜范圍的濃度，保證 VDR 有足夠的啟動(dòng)因子來實(shí)現(xiàn)的。而 VDR 在細(xì)胞核上的表達(dá)數(shù)量、構(gòu)象結(jié)構(gòu)、與 VD 的結(jié)合能力、形成復(fù)合物后啟動(dòng)下一步反應(yīng)的能力也最終決定了其發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)作用的能力[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)okI三種基因型在 VD 濃度方面表現(xiàn)出FF組和Ff組明顯高于ff組，F(xiàn)F組和Ff組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此可見，VDR 基因FokI多態(tài)性與 VD 濃度以及結(jié)核的易感性有關(guān)，ff基因型患者VD合成不足，且更易患肺結(jié)核。

總之，初治肺結(jié)核組患者血清維生素D水平明顯下降，且VDR基因FokI多態(tài)性發(fā)生變化。VDR 基因多態(tài)性與血清VD水平和肺結(jié)核易感性有相關(guān)性，ff基因型人群可能需要預(yù)防低VD血癥及肺結(jié)核可能。

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Association of vitamin D with its receptor genetic polymorphism site FokI in newly diagnosed pulmonary tuberculosis

JINWu,DURong-hui,CAOTan-zhen

theThirdWardsofInternalMedicine,WuhanPulmonaryHospital,Wuhan,Hubei430030,China

Objective To analyze the correlation between vitamin D (VD) and vitamin D receptor (VDR) genetic polymorphism site FokI in newly diagnosed pulmonary tuberculosis patients. Methods 180 newly diagnosed pulmonary tuberculosis patients (PTB) and 100 healthy control were randomly selected. Their serum VD levels and VDR genetic polymorphism site FokI were detected and compared. Results Serum VD level was significantly lower in the PTB group than in the control group (P<0.0001). The deficiency of VD was significantly higher in the PTB group (70.5%) than in the control group (47.0%). The difference of the three genotypes (homozygous FF, homozygous ff and heterozygous Ff) of VDR polymorphism site FokI in the two groups was statistically significant (P=0.033). The rate of homozygous ff and allele f in the PTB group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). The level of VD in the ff group was significantly lower than in the FF group and the Ff group in PTB (P<0.05). Conclusion The level of serum VD decreases significantly in newly diagnosed PTB. VDR genetic polymorphism site FokI genotype ff is the susceptibility gene of PTB.

newly diagnosed pulmonary tuberculosis; vitamin D; vitamin D receptor; FokI; genetic polymorphism

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.09.031

430030 湖北 武漢，武漢市肺科醫(yī)院內(nèi)三病區(qū)

2017-01-14]