李無雙，周燕，周璇

(1桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541001；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

銀杏葉提取物對(duì)慢性間歇性低氧大鼠胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響及機(jī)制探討

李無雙1，周燕2，周璇1

(1桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541001；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的 探討銀杏葉提取物(EGB)對(duì)慢性間歇性低氧(CIH)大鼠胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及其機(jī)制。方法 取10只SD大鼠置于低壓氧艙內(nèi)模擬間歇性低氧條件制備CIH模型，另取10只大鼠在常氧條件下飼養(yǎng)。于造模12周結(jié)束后，提取CIH模型大鼠及常氧飼養(yǎng)大鼠的原代胰島β細(xì)胞，將常氧飼養(yǎng)大鼠的原代胰島β細(xì)胞作為常氧對(duì)照組，將CIH模型大鼠的原代胰島β細(xì)胞分為CIH模型組、抗核因子2相關(guān)因子(Nrf2)抗體組、Nrf2激活劑組、EGB低劑量組、EGB中劑量組、EGB高劑量組。常氧對(duì)照組、CIH模型組用普通DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，抗Nrf2抗體組加入終濃度為20 μg/mL的Nrf2抗體，Nrf2激活劑組加入終濃度為20 μmol/L 的Nrf2激活劑萊菔硫烷，EGB低、中、高劑量組分別加入EGB 5、10、20 mg/mL。各組均干預(yù)24 h后，取各組細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中氧自由基(ROS)含量、細(xì)胞上清液中丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平。采用Western blotting法檢測(cè)Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路相關(guān)蛋白Nrf2及下游抗氧化酶靶蛋白血紅素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶(NQO1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表達(dá)。結(jié)果 與常氧對(duì)照組對(duì)比，CIH模型組MDA及ROS均升高，GSH-Px降低(P均<0.01)。與CIH模型組比較，抗Nrf2抗體組MDA及ROS均升高，GSH-Px降低(P<0.05或0.01)；Nrf2激活劑組、EGB中劑量組、EGB高劑量組MDA及ROS均降低，GSH-Px均升高(P<0.05或0.01)。EGB高劑量組MDA及ROS均低于EGB低劑量組，GSH-Px高于EGB低劑量組(P<0.01或0.05)。與常氧對(duì)照組對(duì)比，CIH模型組Nrf2升高，HO-1、NQO1、γ-GCS均降低(P均<0.01)。與CIH模型組比較，抗Nrf2抗體組HO-1、NQO1均降低(P均<0.01)；Nrf2激活劑組、EGB中劑量組、EGB高劑量組Nrf2、HO-1、NQO1、 γ-GCS均升高(P<0.05或P<0.01)。EGB高劑量組Nrf2、HO-1、NQO1、 γ-GCS均高于EGB中劑量組(P<0.05或0.01)。結(jié)論 EGB可減輕CIH導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)水平，其機(jī)制可能與激活Nrf2-ARE信號(hào)通路有關(guān)。

慢性間歇性低氧；胰島β細(xì)胞；銀杏葉提取物；氧化應(yīng)激；核因子2相關(guān)因子;阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征

慢性間歇性低氧(CIH)及由此導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)是阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)最主要的病理生理特征。研究發(fā)現(xiàn)，CIH所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)在機(jī)體損傷過程中起關(guān)鍵作用[1]。本課題組前期研究表明，OSAS可導(dǎo)致高胰島素血癥、胰島素抵抗和胰島功能受損，OSAS引起的氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致胰島細(xì)胞毒性作用的重要原因，加重胰島β細(xì)胞的損傷[2]。研究發(fā)現(xiàn)，CIH導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可以引起胰島β細(xì)胞功能降低，并與氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)[3]。對(duì)于OSAS的治療，抗氧化劑可以成為一個(gè)有效的輔助療法[4]。銀杏葉提取物(EGB)是從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)，主要成分為黃酮苷及銀杏內(nèi)酯，具有強(qiáng)抗氧化作用和清除自由基活性[5,6]。核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)信號(hào)通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，參與細(xì)胞氧化應(yīng)激等多種防御機(jī)制，在機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)早期起重要保護(hù)作用。研究[7]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗氧化劑可以延緩胰島β細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。2014年9月～ 2016年7月，我們通過建立CIH模型來模擬OSAS的病理過程[8]，探討EGB經(jīng)Nrf2信號(hào)通路對(duì)CIH大鼠模型胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用，為治療OSAS及其并發(fā)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料及儀器 健康8周齡雄性SD大鼠20只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(180±20)g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Nrf2、血紅素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶(NQO1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)單克隆抗體(美國Abcam公司)；大鼠β-actin(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物研究所有限公司)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；氧自由基(ROS)測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；EGB761(金納多，德國Schwabe制藥集團(tuán))。間歇性低氧動(dòng)物艙由南京新飛分析儀器有限公司提供(型號(hào)：JXOC-12型)；紫外分光光度計(jì)(UV-2401PC，日本島精公司)；MLDEL680酶標(biāo)儀(美國Bio-RAD公司)；EPS 301型SDS-PAGE電泳儀(Amersham Pharmacia Biotech公司)；JS-780全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(培清科技公司)。

1.2 CIH模型制備方法 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，取10只用于制備CIH模型。置于低壓氧艙內(nèi)模擬間歇性低氧，向艙內(nèi)循環(huán)通入氮?dú)夂脱鯕?，每一次循環(huán)時(shí)間120 s(即30 s充入氮?dú)猓３?0 s，隨之10 s充入氧氣，保持20 s);調(diào)節(jié)氣體流量，使每一循環(huán)艙內(nèi)最低氧濃度達(dá)4%～6%，然后逐漸恢復(fù)至21%左右，每天8 h；其余時(shí)間置飼養(yǎng)籠，在室溫、空氣條件下正常飲食，造模時(shí)間為12周。其余10只SD大鼠在常氧條件下飼養(yǎng)，每日同時(shí)置于相同規(guī)格的有機(jī)玻璃艙內(nèi)，輸入空氣，無缺氧。

1.3 大鼠原代胰島β細(xì)胞提取 于造模12周結(jié)束后，提取CIH模型大鼠及常氧飼養(yǎng)大鼠的原代胰島β細(xì)胞。在無菌操作下暴露大鼠胰膽管，于近肝門段和入十二指腸開口處結(jié)扎，將膠原酶Ⅴ經(jīng)膽管逆行向大鼠胰腺注入，取出膨大的胰腺;參考Lambert分離方法提取原代胰島β細(xì)胞，F(xiàn)icoll密度梯度離心法純化胰島β細(xì)胞，得到純度約為85%的胰島β細(xì)胞。顯微鏡下見胰島β細(xì)胞呈圓形或橢圓形，形態(tài)完整，有折光性，雙硫腙(DTZ)染色后胰島β細(xì)胞呈猩紅色，表明胰島β細(xì)胞提取成功。

1.4 細(xì)胞分組與干預(yù)處理 將提取成功的常氧飼養(yǎng)大鼠原代胰島β細(xì)胞作為常氧對(duì)照組，將CIH模型大鼠的原代胰島β細(xì)胞分為CIH模型組、抗Nrf2抗體組、Nrf2激活劑組、EGB低劑量組、EGB中劑量組、EGB高劑量組。常氧對(duì)照組用含15%胎牛血清的DMEM，CIH模型組使用普通培養(yǎng)基相同條件培養(yǎng)，抗Nrf2抗體組加入終濃度為20 μg/mL的Nrf2抗體，Nrf2激活劑組加入終濃度為20 μmol/L 的Nrf2激活劑萊菔硫烷(SFP)，EGB低、中、高劑量組分別加入EGB 5、10、20 mg/mL。于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，各組均干預(yù)24 h。

1.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 取各組細(xì)胞，采用Fenton反應(yīng)及Gress顯色法檢測(cè)細(xì)胞中的ROS，硫代巴比妥酸法測(cè)定細(xì)胞上清液中的MDA，比色法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的GSH-Px，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路蛋白及下游抗氧化酶靶蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)蛋白Nrf2及下游抗氧化酶靶蛋白HO-1、NQO1、 γ-GCS的表達(dá)。用PBS將貼壁細(xì)胞吹打下來，與收集到的細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，離心棄上清。冰上裂解細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP管，加1×Buffer煮8 min使蛋白變性。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)本蛋白濃度計(jì)算上樣量，使每孔蛋白上樣量一致；行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用5%的脫脂奶粉封閉后，分別加入抗Nrf2、HO-1、NQO1、 γ-GCS、β-actin抗體，過夜孵育；洗膜后加入二抗室溫孵育2 h；TBST充分洗滌后，定影、顯影，X線膠片曝光記錄影像；凝膠成像分析系統(tǒng)分析膠片。各目的蛋白表達(dá)水平用目的蛋白條帶光密度值與內(nèi)參β-actin 條帶光密度值之比表示。

2 結(jié)果

2.1 各組氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較 與常氧對(duì)照組對(duì)比，CIH模型組MDA及ROS均升高，GSH-Px降低(P均<0.01)。與CIH模型組比較，抗Nrf2抗體組MDA及ROS均升高，GSH-Px降低(P<0.05或P<0.01)；Nrf2激活劑組、EGB中劑量組、EGB高劑量組MDA及ROS均降低，GSH-Px升高(P<0.05或P<0.01)。EGB高劑量組MDA及ROS均低于EGB低劑量組，GSH-Px高于EGB低劑量組(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組ROS、MDA、GSH-Px水平比較

注：與常氧對(duì)照組比較，*P<0.01；與CIH模型組比較，﹟P<0.01，△P<0.05；與EGB低劑量組比較，▲P<0.01。

2.2 各組細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1、 γ-GCS蛋白表達(dá)比較 與常氧對(duì)照組對(duì)比，CIH模型組Nrf2升高，HO-1、NQO1、 γ-GCS均降低(P均<0.01)。與CIH模型組比較，抗Nrf2抗體組HO-1、NQO1均降低(P均<0.01)；Nrf2激活劑組、EGB中劑量組、EGB高劑量組Nrf2、HO-1、NQO1、 γ-GCS均升高(P<0.05或P<0.01)。EGB高劑量組Nrf2、HO-1、NQO1、 γ-GCS均高于EGB中劑量組(P<0.05或P<0.01)。見表2、圖1。

表2 各組細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1、 γ-GCS蛋白表達(dá)比較±s)

注：與常氧對(duì)照組比較，*P<0.01；與CIH模型組比較，﹟P<0.01，△P<0.05；與EGB低劑量組比較，▲P<0.01。

圖1 各組細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

3 討論

OSAS特征性的表現(xiàn)為睡眠狀態(tài)時(shí)反復(fù)出現(xiàn)的低氧血癥、高碳酸血癥及睡眠結(jié)構(gòu)紊亂，可引起組織器官缺血、缺氧，繼而導(dǎo)致多器官系統(tǒng)功能不全或障礙[9]。OSAS是一種氧化應(yīng)激性疾病，而氧化應(yīng)激的發(fā)生與CIH有著直接的關(guān)聯(lián)[10]。胰島組織中抗氧化酶含量在所有組織中是最低的，對(duì)氧化應(yīng)激也最為敏感；與機(jī)體其他細(xì)胞相比，胰島β細(xì)胞更易受到氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生凋亡。氧化應(yīng)激可使胰島β細(xì)胞對(duì)ROS反應(yīng)性增高，體內(nèi)產(chǎn)生的ROS進(jìn)一步增多。研究[11]發(fā)現(xiàn)，OSAS與2型糖尿病(T2DM)關(guān)系密切，OSAS與糖耐量、胰島素抵抗獨(dú)立相關(guān)，是糖尿病患者血糖紊亂的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；并且,OSAS患者中普遍存在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。而胰島素抵抗與胰島β細(xì)胞功能缺陷是T2DM發(fā)病機(jī)制的兩個(gè)要素，OSAS導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能受損的具體機(jī)制未見文獻(xiàn)報(bào)道。

氧化應(yīng)激可導(dǎo)致抗氧化類物質(zhì)增多，打破體內(nèi)氧化和抗氧化平衡，引起組織和細(xì)胞內(nèi)ROS增多，造成ROS在細(xì)胞內(nèi)的毒性作用，形成脂質(zhì)過氧化及DNA損害。MDA由體內(nèi)ROS氧化胞膜上不飽和脂肪酸而形成，可間接反映脂質(zhì)過氧化水平。GSH-Px是體內(nèi)廣泛存在的重要的過氧化物分解酶，可阻斷脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜免受過氧化損害，是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。ROS、MDA、GSH-Px可反映機(jī)體氧化應(yīng)激及抗氧化系統(tǒng)的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，與常氧對(duì)照組對(duì)比，CIH模型組MDA及ROS均升高，GSH-Px降低。提示CIH模型大鼠胰島β細(xì)胞中出現(xiàn)氧化活性物質(zhì)的堆積、脂質(zhì)過氧化及抗氧化系統(tǒng)水平減弱，出現(xiàn)氧化系統(tǒng)及抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。這表明CIH模型大鼠胰島β細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平升高，從而可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的氧化損傷。

Nrf2信號(hào)通路由轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、調(diào)控蛋白Keap1以及ARE組成。Nrf2是細(xì)胞氧化后應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，通過與ARE相互作用，調(diào)節(jié)下游靶基因及其產(chǎn)物，對(duì)于維持體內(nèi)抗氧化物及過氧化物的平衡有重要作用，是機(jī)體各類細(xì)胞參與抗氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與CIH模型組比較，抗Nrf2抗體組MDA及ROS均升高、GSH-Px降低，而Nrf2激活劑組MDA及ROS均降低、GSH-Px升高。這提示激活Nrf2信號(hào)通路能夠改善CIH模型大鼠胰島β細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，表明發(fā)生CIH時(shí)胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生與Nrf2信號(hào)通路有關(guān)。

Nrf2-ARE信號(hào)通路的主要抗氧化蛋白和酶類可分為HO-1、NQO1及γ-GCS。其中，HO-1參與氧化反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄表達(dá)后為重要的抗氧化細(xì)胞保護(hù)蛋白[13]；NQO1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)；γ-GCS可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，過量的ROS能激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，調(diào)控下游抗氧化酶的靶基因蛋白表達(dá)[14]，減少ROS的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與常氧對(duì)照組對(duì)比，CIH模型組Nrf2升高，HO-1、NQO1、γ-GCS均降低，這表明CIH導(dǎo)致的氧化應(yīng)激能激活抗氧化應(yīng)激因子Nrf2的表達(dá)，且氧化應(yīng)激消耗信號(hào)通路下游抗氧化蛋白HO-1、NQO1、γ-GCS。

EGB是從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)，具有顯著的抗氧化作用和清除自由基活性能力[5,6]。EGB可阻止脂質(zhì)過氧化，清除超氧陰離子及清除氧自由基，上調(diào)谷胱甘肽水平。EGB在胰島β細(xì)胞內(nèi)也表現(xiàn)出類似其他組織的抗氧化活性作用，具有改善胰島微環(huán)境、保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用，其機(jī)制與減少氧化應(yīng)激的來源有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與CIH模型組相比，EGB中劑量組、EGB高劑量組MDA及ROS均降低，GSH-Px升高，提示EGB可以增加抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有抗氧化作用；EGB高劑量組MDA及ROS均低于EGB低劑量組，GSH-Px高于EGB低劑量組，提示EGB改善CIH模型大鼠氧化應(yīng)激水平的作用與劑量有關(guān)，劑量較高時(shí)其改善作用更明顯；EGB中劑量組、EGB高劑量組Nrf2、HO-1、NQO1、 γ-GCS均升高，且EGB高劑量組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS均高于EGB中劑量組。這些均提示EGB降低CIH模型大鼠的氧化應(yīng)激水平的作用與激活Nrf2信號(hào)通路、調(diào)節(jié)通路下游抗氧化蛋白的水平有關(guān)，且劑量較高時(shí)作用更明顯，從而減輕胰島β細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，對(duì)胰島β細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，CIH時(shí)可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，而EGB可減輕氧化應(yīng)激水平，其機(jī)制可能與激活Nrf2-ARE信號(hào)通路有關(guān)，可作為治療OSAS及其并發(fā)癥的潛在靶點(diǎn)。

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Effects of ginkgo biloba extracts on oxidative stress of islet β-cells in chronic intermittent hypoxic rats

LIWushuang1,ZHOUYan,ZHOUXuan

( 1GuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China)

Objective To investigate the effects of ginkgo biloba extracts (EGB) on oxidative stress of islet β-cells in rats with chronic intermittent hypoxia (CIH) and its mechanism.Methods Ten SD rats were placed in hypoxia chamber to simulate intermittent hypoxia to prepare CIH models, and the other 10 rats were fed under normoxic conditions. At the end of 12 weeks, the primary islet β-cells from CIH model rats and normoxic rats were extracted. The primary islet cells of the normoxic rats were used as the normoxic control group; the primary islet cells of CIH model rats were divided into the CIH model group, anti-Nrf2 antibody group, Nrf2 activator group, low-dose EGB group, medium-dose EGB group, and high-dose EGB group. Rats in the oxygen control group and CIH model group were cultured in DMEM medium; Nrf2 antibody was added to the Nrf2 antibody group; Nrf2 activator sulforaphane with final concentration of 20 μg/mL was added to the Nrf2 activator group; 5, 10, and 20 mg/mL EGB were added to the low-dose EGB group, medium-dose EGB group, and high-dose EGB group, respectively. The cells were taken from rats in each group after 24-hour intervention. The content of reactive oxygen species (ROS), the content of malondialdehyde (MDA) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in the supernatant was measured. The expression levels of Nrf2-ARE signal pathway related protein Nrf2 and downstream antioxidant enzyme-target protein HO-1, NQO1 and γ-GCS were detected by Western blotting.Results Compared with the normoxic control group, MDA and ROS increased and GSH-Px decreased in the CIH model group (allP<0.01). Compared with the CIH model group, MDA and ROS increased and GSH-Px decreased in anti-Nrf2 antibody group (P<0.01 orP<0.05). In the Nrf2 activator group, medium-dose EGB group, and high-dose EGB group, MDA and ROS were reduced, and GSH-Px increased (P<0.01 orP<0.05). MDA and ROS were lower and GSH-Px was higher in the high-dose EGB group than in the low-dose EGB group (P<0.01 orP<0.05). Compared with the normoxic control group, the level of Nrf2 increased, and HO-1, NQO1 and γ-GCS decreased in the CIH model group (allP<0.01). Compared with the CIH model group, HO-1 and NQO1 decreased in the anti-Nrf2 antibody group (bothP<0.01). In the Nrf2 activator group, medium-dose EGB group, and high-dose EGB group, Nrf2, HO-1, NQO1, and γ-GCS increased (P<0.01 orP<0.05). The levels of Nrf2, HO-1, NQO1, and γ-GCS in the high-dose EGB group were higher than those of the medium-dose EGB group (P<0.01 orP<0.05).Conclusion EGB can reduce the level of oxidative stress in islet cells caused by CIH, and its mechanism may be related to the activation of Nrf2-ARE signaling pathway.

chronic intermittent hypoxia; islet β-cells; oxidative stress; ginkgo biloba extract; nuclear factor 2 related factor; obstructive sleep apnea syndrome

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460019)。

李無雙(1990-)，女，碩士研究生，住院醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樗吆粑膊?。E-mail: 1009964826@qq.com

周燕(1972-)，女，碩士研究生，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樗吆粑膊?。E-mail: 180876118@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.002

R852.11；R322.5

A

1002-266X(2017)30-0005-05

2017-02-12)