沈靜雪，張亞杰，蔡鳳，范德美，劉矩榮，田堅

(1沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院，沈陽110024；2中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院)

二甲雙胍對2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠肝臟功能及炎癥反應的影響

沈靜雪1，張亞杰2，蔡鳳1，范德美1，劉矩榮1，田堅1

(1沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院，沈陽110024；2中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院)

目的 探討二甲雙胍對2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝功能及炎癥反應的影響。方法 取40只大鼠，隨機分為A組(T2DM+NAFLD+二甲雙胍組)、B組(T2DM+NAFLD組)、C組(T2DM組)、D組(空白對照組)各10只。A、B組均予以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周制備NAFLD模型，C組予以基礎飼料喂養(yǎng)4周，D組僅以基礎飼料喂養(yǎng)8周。A、B、C組一次性腹腔注射STZ制備T2DM模型。造模4周后，A組予二甲雙胍150 mg/(kg·d)灌胃4周，B、C、D組均予以等量生理鹽水灌胃4周。各組干預結束后，麻醉大鼠，腹主動脈穿刺取血，檢測血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、肝功能(ALT、AST、GGT)及血清TNF-α、IL-6水平。取肝臟組織，計算肝指數(shù)。采用HE染色法觀察肝臟組織病理學變化。采用免疫組化法及Western blotting法檢測肝臟組織TNF-α、IL-6蛋白表達。結果 ①B、C組TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均高于D組，HDL-C低于D組(P均<0.05或0.01)。A組TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均低于B組，HDL-C高于B組(P均<0.05或0.01)。②B、C組血清TNF-α、IL-6均高于D組，A組血清TNF-α、IL-6水平均低于B組(P均<0.05或0.01)。③B、C組肝指數(shù)均高于D組，A組肝指數(shù)低于B組(P均<0.01)。④D組肝組織結構完整，肝小葉結構正常。B、C組肝臟組織呈脂肪樣變，部分可見小葉內(nèi)炎性細胞浸潤。A組肝臟脂肪變性程度及炎性細胞浸潤較B組明顯減輕。⑤B、C組肝臟組織中TNF-α、IL-6蛋白表達均高于D組(P均<0.01)，A組肝臟組織中TNF-α、IL-6蛋白表達均低于B組(P均<0.05)。結論 二甲雙胍可明顯改善T2DM合并NAFLD大鼠的肝臟功能，抑制NAFLD的發(fā)生發(fā)展；其機制可能為通過降低炎性因子的表達、改善慢性炎癥狀態(tài)，從而發(fā)揮肝臟保護作用。

2型糖尿??；二甲雙胍；非酒精性脂肪肝；炎癥反應；肝臟功能;腫瘤壞死因子α；白細胞介素6

隨著生活方式的改變與健康意識的滯后，2型糖尿病(T2DM)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)等慢性病已成為全球最常見的疾病。目前，中國人群中單獨患有T2DM或NAFLD的患病率為10%以上，而二者共同存在的患病率則為42.6%[1]，提示二者之間存在密切的關系。隨著對T2DM、NAFLD發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)炎癥反應在二者共同機制中起著重要的作用。二甲雙胍是治療T2DM的一線用藥，通過降低肝糖原的異生、抑制肝糖原的輸出，增加骨骼、肌肉等外周組織對葡萄糖的攝取及利用，發(fā)揮降糖作用。此外，它還參與脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)脂肪激素及炎性因子在肝臟中的表達。2016年1～10月，我們觀察了二甲雙胍對合并NAFLD的T2DM大鼠肝功能、炎癥反應的影響，探討二甲雙胍對T2DM合并NAFLD的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 SPF級雄性大鼠40只，5～6周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自中國醫(yī)科大學動物實驗中心。鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)。二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司)。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、采用ELISA試劑盒測定(北京中杉金橋有限公司)。

1.2 動物分組與模型制備 40只SPF級雄性大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為A組(T2DM+NAFLD+二甲雙胍組)、B組(T2DM+NAFLD組)、C組(T2DM組)、D組(空白對照組)，每組10只。A、B組均予以高糖高脂飼料(10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1%膽酸鹽、66.5%基礎飼料)喂養(yǎng)4周，制備NAFLD模型。C組予以基礎飼料喂養(yǎng)4周。A、B、C組均禁食水12～16 h，一次性腹腔注射0.5%STZ 30 mg/kg制備T2DM模型，1周后尾靜脈取血，以血糖≥16.7 mmol/L且穩(wěn)定2周為T2DM造模成功。D組僅以基礎飼料喂養(yǎng)8周。

1.3 干預方法 A組于NAFLD+T2DM造模4周后，予以二甲雙胍150 mg/(kg·d)溶于生理鹽水灌胃4周。B組于NAFLD+T2DM造模4周后、C組于T2DM造模4周后、D組于基礎飼料喂養(yǎng)8周后，均予以等量生理鹽水灌胃4周。

1.4 血脂、肝功能指標及血清TNF-α、IL-6檢測 各組干預結束后，禁食8 h，以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射法麻醉大鼠，腹主動脈穿刺取血3 mL，檢測血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、肝功能(ALT、AST、GGT)及血清TNF-α、IL-6水平。

1.5 肝指數(shù)測算 取材前測量大鼠體質(zhì)量，取血后取出肝臟組織，稱重后用4%多聚甲醛或液氮固定。肝指數(shù)=濕肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.6 肝臟組織病理學觀察 將肝臟固定后制備石蠟切片，采用HE染色法觀察肝臟組織病理學變化。

1.7 肝臟組織TNF-α、IL-6蛋白表達檢測 采用免疫組化法及Western blotting法。①免疫組化法：肝組織石蠟切片，按試劑盒說明書染色。②Western blotting法：取肝組織約50 mg置于EP管內(nèi)，加入500 μL的RIPA裂解液(其中含1%體積的PMSF)，勻漿機勻漿，離心后提取蛋白。BCA法蛋白濃度，上樣量約60 μg。配制8%的聚丙酰胺凝膠，煮樣后電泳、轉膜、封閉(5%脫脂奶粉)；分別加入一抗TNF-α、IL-6于4 ℃過夜，洗膜1 h加入二抗，室溫孵育2 h后電化學發(fā)光。應用Quantity One軟件計算灰度值，以目的蛋白與GAPDH灰度比值表示目的蛋白表達量。

2 結果

2.1 各組血脂、肝功能指標比較 B、C組TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均高于D組，HDL-C低于D組(P<0.05或0.01)。A組TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均低于B組，HDL-C高于B組(P均<0.05或0.01)。B組TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均高于C組，HDL-C低于C組(P均<0.05或0.01)。見表1。

表1 各組血脂、肝功能指標比較

注：與D組比較，*P<0.01，﹟P<0.01；與B組比較，△P<0.01；與C組比較，▲P<0.01。

2.2 各組血清TNF-α、IL-6水平比較 B、C組血清TNF-α、IL-6均高于D組，A組血清TNF-α、IL-6水平均低于B組，B組血清TNF-α、IL-6水平均高于C組(P均<0.05或0.01)。見表2。

2.3 各組肝指數(shù)比較 A、B、C、D組肝指數(shù)分別為3.90%±0.35%、7.13%±0.47%、8.66%±0.72%、2.39%±0.41%，B、C組肝指數(shù)均高于D組，A組肝指數(shù)低于B組(P均<0.01)。

表2 各組血清TNF-α、IL-6水平比較

注：與D組比較，*P<0.05，﹟P<0.01；與B組比較，△P<0.01；與C組比較，▲P<0.01。

2.4 各組肝臟組織病理學變化 D組肝組織結構完整，肝小葉結構正常，肝細胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，細胞呈多邊形。B、C組肝細胞體積不同程度增大，脂肪變以大泡性為主，細胞核被擠向一邊，部分可見小葉內(nèi)炎性細胞浸潤。A組肝臟脂肪變性程度及炎性細胞浸潤較B組明顯減輕。

2.5 各組肝臟組織TNF-α、IL-6蛋白表達比較 ①免疫組化染色：D組大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-6幾乎無表達；A、B、C組大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-6均呈陽性表達，主要定位于細胞質(zhì)中，顏色呈棕黃色。B組肝臟組織中TNF-α、IL-6表達均較A、C組顏色較深，且陽性細胞數(shù)量較多。②Western blotting結果：B、C組肝臟組織中TNF-α、IL-6蛋白表達均高于D組(P均<0.01)，A組肝臟組織中TNF-α、IL-6蛋白表達均低于B組(P均<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組肝臟組織TNF-α、IL-6蛋白表達比較

注：與D組比較，*P<0.01；與B組比較，△P<0.01。

注：1為B組；2為A組；3為C組；4為D組。

圖1 各組肝臟組織TNF-α、IL-6蛋白表達情況(Western blotting法)

3 討論

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者常伴發(fā)NAFLD，50%～70%的T2DM患者伴有NAFLD， NAFLD人群是T2DM的高風險人群，40%～50%的NAFLD患者伴有不同程度的糖耐量異常，NAFLD患者6年內(nèi)約20%可發(fā)展為糖尿病，提示二者之間有著密切的聯(lián)系[2,3]。研究[4,5]發(fā)現(xiàn)，NAFLD可增加T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生風險。在NAFLD患者中，由于胰島素抵抗，TG在肝臟的積聚可導致胰島素抑制肝糖輸出的作用減弱，進一步產(chǎn)生高胰島素血癥和血糖升高，導致糖尿病的發(fā)生。此外，合并NAFLD的T2DM患者在心腦血管疾病、周圍血管疾病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變的患病率均較無NAFLD的T2DM患者升高；同樣地，T2DM也是NAFLD發(fā)生的獨立危險因素，并且能增加NAFLD 患者死亡的風險[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，B、C組TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均高于D組，HDL-C低于D組，B、C組肝指數(shù)均高于D組，B、C組肝臟組織呈脂肪樣變，提示T2DM、NAFLD均可使肝組織出現(xiàn)肝臟組織病變，可導致肝臟功能受損；B組上述指標的嚴重程度重于C組，提示當T2DM合并NAFLD時，有更嚴重的糖脂代謝紊亂、肝功能受損、肝臟脂肪變，存在著更顯著的肝臟病變。

目前認為，炎癥反應是T2DM與NAFLD共同的發(fā)病機制，從而導致臨床上兩種疾病相互依存。因此，針對慢性炎癥反應進行研究，對于探討T2DM與NAFLD的發(fā)病機制具有重要意義。在T2DM和NAFLD的易感人群中，隨著營養(yǎng)過剩、體力活動減少等環(huán)境因素的作用，先天性免疫系統(tǒng)被激活，巨噬細胞、脂肪細胞等細胞分泌多種炎癥因子，如TNF-α、IL-6等。這些炎癥因子通過直接或間接影響胰島素信號傳導通路，從而引起胰島素抵抗。研究發(fā)現(xiàn), 炎癥介導胰島素抵抗的細胞內(nèi)信號傳導通路主要包括NF-κB、NF-κB抑制蛋白、IKK途徑(IKK/NF-κB通路)、C-氨基末端激酶(JNK)通路、細胞因子信號轉導抑制物(SOCS)通路、蛋白激酶C(PKC)信號通路等，均可通過多種途徑刺激多種炎癥因子如TNF-α、IL-6等的表達而導致胰島素抵抗[7～10]。胰島素抵抗貫穿于T2DM病程的始終，可減弱胰島素對脂代謝的調(diào)節(jié)，促使脂肪沉積于肝臟。作為機體發(fā)生慢性炎癥的早期炎癥標志物，TNF-α、IL-6可通過以下作用促進T2DM患者的NAFLD：①通過脂解作用，使游離脂肪酸水平升高；②改變脂因子的生成，使致炎因子增多，而抗炎因子生成減少；③影響胰島素信號傳導系統(tǒng)，促使胰島素抵抗形成；④造成線粒體功能障礙，誘發(fā)氧化應激[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與D組比較，B組、C組的血清TNF-α、IL-6水平明顯增高，肝臟組織TNF-α、IL-6蛋白表達均明顯增高，提示T2DM合并NAFLD時存在著慢性炎癥反應，與文獻報道一致[7,10]。

二甲雙胍作為傳統(tǒng)的胰島素增敏劑，在臨床上廣泛應用。它能促進胰島素與受體的結合，并通過降低肝糖原的異生、抑制肝糖原的輸出，增加骨骼、肌肉等外周組織對葡萄糖的攝取及利用，發(fā)揮降糖作用。此外，它還參與脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)脂肪激素及炎性因子在肝臟中的表達。近年研究表明，二甲雙胍具有顯著的降低血脂、肝臟脂肪及改善肝功能的效果[13]。應用二甲雙胍治療NAFLD的臨床報道也顯示，患者口服該藥物后AST、ALT下降[14]。近年研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有抗炎作用，其機制可能與下列作用有關[15～17]：①抑制炎癥因子的形成：降低血漿纖溶酶原激活物抑制物-1、CRP的水平，減少氧化應激，改善內(nèi)皮功能，從而延緩動脈粥樣硬化的進程。②激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途徑：AMPK的激活可通過抑制NF-κβ的抑制蛋白激酶(IKKα和IKKβ)的活性及抑制Iκβα的磷酸化降解作用，減輕脂多糖誘導的NF-κβ活性,抑制轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β、IL-6、誘導型一氧化碳合酶(iNOS)、IL-8、IL-12、粒巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的核轉位而發(fā)揮抗炎作用。③改善胰島素抵抗：胰島素抵抗參與了糖尿病的慢性炎癥過程，二甲雙胍除通過降低體質(zhì)量間接改善胰島素抵抗外，本身有直接的胰島素增敏作用。④抗氧化作用：氧化應激可使單核細胞產(chǎn)生的活性氧簇(ROS)增多，促進NF-κβ活性增強。本研究發(fā)現(xiàn)，A組肝指數(shù)低于B組，肝臟脂肪變性程度和炎性細胞浸潤較B組明顯減輕，血清及肝臟組織中TNF-α、IL-6蛋白表達均低于B組，提示A組的糖脂代謝、血清TNF-α、IL-6水平及肝臟組織TNF-α、IL-6蛋白表達均顯著改善。這表明二甲雙胍可能通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-6，改善高糖高脂大鼠的脂代謝，從而減輕肝臟脂質(zhì)的浸潤，改善肝臟的脂肪變性及病理損傷。

總之，二甲雙胍可明顯改善T2DM合并NAFLD大鼠的肝臟功能，抑制NAFLD的發(fā)生發(fā)展，其機制可能為通過降低炎性因子的表達、改善慢性炎癥狀態(tài)。這表明二甲雙胍除具有降糖作用外，還具有減輕肝臟的脂質(zhì)沉積、降低炎癥反應的作用，具有一定的肝臟保護作用。

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遼寧省沈陽市科技計劃項目(F14-158-9-29)。

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2017-01-11)