劉冬冬，張偉國(guó)，徐建中，田成福

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

研究報(bào)告

不同葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)對(duì)菌株葡萄糖代謝及產(chǎn)物合成的影響

劉冬冬，張偉國(guó)*，徐建中*，田成福

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

磷酸烯醇式丙酮酸-葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphoenolpyruvate-dependent glucose phosphotransferase system, PTSGlc)和不依賴于PTSGlc系統(tǒng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化過(guò)程中起重要作用。該文通過(guò)在葡萄糖代謝緩慢的L-賴氨酸產(chǎn)生菌Corynebacteriumglutamicum(C.glutamicum) ZL-8中過(guò)表達(dá)肌醇透性酶基因(iolT1)、葡萄糖激酶基因(ppgk)和EIIGlc基因(ptsG)，研究葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因?qū)ζ咸烟谴x速率、L-賴氨酸及副產(chǎn)物合成的影響。與出發(fā)菌株C.glutamicumZL-8相比，重組菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1(葡萄糖激酶酶活力提高了768%)和C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG(PTSGlc系統(tǒng)酶活力提高了62.7%)葡萄糖消耗速率分別提高了16.7%和27.3%，L-賴氨酸產(chǎn)量分別提高了24.7%和16.4%。此外，有機(jī)酸和氨基酸分析結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)不同葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑基因?qū)τ袡C(jī)酸(丙酮酸、乳酸和乙酸)和副產(chǎn)物氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸)具有不同的影響。

谷氨酸棒桿菌；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑；葡萄糖代謝速率；L-賴氨酸

L-賴氨酸是人體及動(dòng)物自身不能合成的必需氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、食品添加劑及醫(yī)藥中間體等方面[1]。自1960年經(jīng)紫外誘變選育了1株產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌缺陷型變異株，從此開(kāi)始了發(fā)酵法生產(chǎn)L-賴氨酸[2]。目前用于選育L-賴氨酸生產(chǎn)菌的出發(fā)菌株多為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)及其亞種，如黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentus)等，而發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸糖質(zhì)原料主要是葡萄糖。

在谷氨酸棒桿菌中，葡萄糖的吸收形式主要通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸-葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphoenolpyruvate-dependent glucose phosphotransferase system, PTSGlc)[3]以基團(tuán)轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行(圖1)。PTSGlc系統(tǒng)是葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化途徑，是由酶I (EI)、HPr和EIIGlc組成的磷酸傳遞鏈[4]。首先EI以PEP為磷酸供體自身發(fā)生磷酸化，EI將來(lái)自PEP的磷?；鶊F(tuán)依次傳遞給HPr、EIIGlc和葡萄糖，最后將葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸。其中，EIIGlc主要參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，是由2個(gè)親水性胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(IIA和IIB)和跨膜結(jié)構(gòu)域IIC(通常由約350個(gè)氨基酸殘基形成6或8個(gè)跨膜螺旋)組成單肽鏈蛋白[5]。

圖1 谷氨酸棒桿菌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑簡(jiǎn)圖[13]Fig.1 Glucose transport systems in C. glutamicum

隨著對(duì)糖代謝的研究深入，近年來(lái)有研究者發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌中存在著不依賴于PTSGlc系統(tǒng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。2011年IKEDA等[6]在谷氨酸棒桿菌中發(fā)現(xiàn)了不依賴PTSGlc系統(tǒng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，該途徑由肌醇透性酶IolT1/IolT2(由基因iolT1和iolT2編碼)和葡萄糖激酶(分別由ppgk和glk編碼的PpgK和GlK)組成。此外，2015年IKEDA等[7]又在C.glutamicumATCC 31833中發(fā)現(xiàn)了另一條由EIIbglF透性酶和葡萄糖激酶組成葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(圖1)。PTSGlc系統(tǒng)在參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化過(guò)程中，需要大量消耗L-賴氨酸前體物質(zhì)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，并產(chǎn)生乙酸、乳酸等抑制菌體生長(zhǎng)；而不依賴PTSGlc系統(tǒng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中，葡萄糖激酶是以ATP或多聚磷酸(polyphosphate, PolyP)為磷酸供體，不需要消耗PEP。另有研究表明，強(qiáng)化不依賴PTSGlc系統(tǒng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑利用葡萄糖，可有效減小葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率，使胞內(nèi)糖酵解和檸檬酸循環(huán)之間的碳流代謝處于較為平衡狀態(tài)，進(jìn)而減少乳酸和乙酸分泌[8-10]，使菌體生長(zhǎng)代謝較為平衡，積累更多的目的產(chǎn)物。張傳志[11]、蔡恒等[12]研究表明，通過(guò)過(guò)表達(dá)iolT1和ppgk基因，可以提高目的產(chǎn)物苯丙氨酸、丁二酸產(chǎn)量，而在一定程度上降低副產(chǎn)物乳酸和乙酸等的積累。

本研究通過(guò)在C.glutamicumZL-8中過(guò)量表達(dá)來(lái)源于C.glutamicumATCC 13032的ptsG、iolT1和ppgk基因，分析出發(fā)菌株C.glutamicumZL-8及重組菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1和C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG在搖瓶發(fā)酵時(shí)葡萄糖消耗速率和L-賴氨酸產(chǎn)量，同時(shí)分析了發(fā)酵液中副產(chǎn)物，如有機(jī)酸和其他氨基酸的產(chǎn)量變化。研究結(jié)果可為基于遺傳改造葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑選育高產(chǎn)L-賴氨酸等氨基酸生產(chǎn)菌株提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

C.glutamicumZL-8、E.coliJM109、E.coliBL21，穿梭表達(dá)質(zhì)粒pDXW-8、pECXK-99E均為本研究室保藏，重組質(zhì)粒pDXW-8-ptsG、pECXK-99E-ppgk-iolT1為本研究構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRI、XbaI、KpnI、pstI、sacI，T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、DNA Marker均購(gòu)于寶生物工程有限公司，PCR相關(guān)試劑、基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒和膜蛋白提取試劑盒均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaC1 10，pH 7.0。

LBG培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉5，NaC1 10，葡萄糖 5，pH 7.0。

Epo培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，甘氨酸 30，異煙肼 4，NaCl 10，Tween 80 1，用于制備C.glutamicum感受態(tài)細(xì)胞。

完全培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 5，蛋白胨 10，牛肉浸膏 10，NaCl 5，瓊脂 20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 25，玉米漿 30，甜菜糖蜜 8，(NH4)2SO42，KH2PO42，MgSO4·7H2O 0.8，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.025，MnSO40.025，硫胺素 0.001 1，生物素0.000 35，煙酰胺0.012 5，CaCO330。pH 7.0～7.2，0.1 MPa滅菌20 min。50 mL種子培養(yǎng)基裝于500 mL三角瓶中，接種搖瓶培養(yǎng)，30℃、100 r/min 培養(yǎng)20～24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 80，(NH4)2SO445，玉米漿 20，甜菜糖蜜12，K2HPO41，KH2PO41，MgSO4·7H2O 1.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO40.02，硫胺素0.000 45，生物素0.000 85，煙酰胺0.008，CaCO340。pH 7.0～7.2，90 kPa滅菌10 min，5 mL種子液轉(zhuǎn)接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL的搖瓶中，30 ℃、100 r/min發(fā)酵60 h。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因克隆及表達(dá)載體pDXW-8-ptsG、pECXK-99E-ppgk-iolT1的構(gòu)建

根據(jù)NCBIC.glutamicumATCC 13032的全基因組核酸序列中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因序列(NCBI Reference Sequence: NC_003450.3)設(shè)計(jì)ptsG(NCgl130)、ppgk(NCgl1835)、iolT1(NCgl0178)的引物，并分別在基因ptsG和ppgk上游引物中引入合成的SD序列。各基因引物見(jiàn)表1。

表1 本研究使用的引物

提取C.glutamicumATCC 13032基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段ptsG、iolT1、ppgk，各基因PCR擴(kuò)增相關(guān)信息見(jiàn)表2。所得各基因片段經(jīng)膠回收、酶切、與具有相同酶切末端的線性化質(zhì)粒22℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，經(jīng)過(guò)抗性平板篩選，挑取轉(zhuǎn)化子菌落PCR，選取較亮條帶對(duì)應(yīng)單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖2)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

表2 研究中PCR反應(yīng)相關(guān)信息

1.2.2 重組菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG和C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1的構(gòu)建

根據(jù)vander Rest等建立的方法[14]采用電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pDXW-8-ptsG和pECXK-99E-ppgk-iolT1電轉(zhuǎn)化至C.glutamicumZL-8中，在卡那霉素終質(zhì)量濃度為25 μg/mL的LBHIS固體平板上30 ℃培養(yǎng)36 h，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證(圖2)，驗(yàn)證正確后得到重組菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG和C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1。

1.2.3 酶蛋白在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)

谷氨酸棒桿菌粗酶液制備[15]：離心收集菌體，所得菌體用50 mmol/L冰冷的KH2PO4(pH 7.0)洗滌2次，然后菌懸液通過(guò)超聲破碎(100個(gè)循環(huán)，工作2 s，間歇3 s)，經(jīng)4 ℃、10 000 r/min離心30 min除去細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶液。所得上清液用于葡萄糖激酶酶活力的測(cè)定和SDS-PAGE分析；由于基因iolT1和ptsG編碼的蛋白IolT1和EIIGlc為膜蛋白，因此谷氨酸棒桿菌膜蛋白的提取是利用購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司的膜蛋白提取試劑盒，然后用于SDS-PAGE分析。其中，EIIGlc酶活通過(guò)測(cè)定PTSGlc系統(tǒng)酶活性間接反映。

1.2.4 葡萄糖激酶活性測(cè)定[16]

反應(yīng)體系體積為1 mL，反應(yīng)組成包括10 mmol /L葡萄糖、0.5 mmol/L NADP、4.5 mmol /L MgCl2、10 mmol/L PolyP20、5 mmol/L β-巰基乙醇及0.5 U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶。采用分光光度計(jì)法測(cè)定并繪制NADPH在340 nm的標(biāo)準(zhǔn)吸光曲線；然后取20 μL粗酶液催化反應(yīng)體系，分別測(cè)定反應(yīng)體系含10 mmol/L PolyP20和不含PolyP20時(shí)的吸光度D340 nm之差 (ΔD340 nm)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)吸光曲線計(jì)算NADPH生成量。1個(gè)酶活力(U)定義為:每分鐘催化生成1 μmol/L葡萄糖-6-磷酸所需的酶量。

1.2.5 PTSGlc系統(tǒng)酶活性測(cè)定

菌體預(yù)處理[17]：培養(yǎng)獲得的菌體用0.2% KCl洗滌2次，然后加入5 mL含10%聚乙二醇6 000、二硫蘇糖醇(30 mmol/L)和Tris-HCl(pH7.5,100 mmol/L)溶液重懸；向上述菌體中添加200 μL甲苯進(jìn)行滲透，隨后于室溫下劇烈攪拌1min；最后得到的菌體用Tris-HCl緩沖液(pH7.5,100 mmol/L)洗滌2次，并用1 mL相同緩沖液重懸，用于測(cè)定PTSGlc系統(tǒng)酶活性。

酶活性測(cè)定[18]：反應(yīng)組成包括Tris-HCl緩沖液(pH7.5,100 mmol/L)、PEP(10 mmol/L)、MgCl2(5 mmol/L)、二硫蘇糖醇(30 mmol/L)、葡萄糖(10 mmol /L)、20 μL菌體處理液，反應(yīng)體系總體積為0.5 mL(未添加葡萄糖時(shí)體積為0.45 mL)。反應(yīng)體系在30℃預(yù)培養(yǎng)10 min，添加0.05 mL葡萄糖(100 mmol/L)開(kāi)始反應(yīng)，反應(yīng)溫度30 ℃、反應(yīng)時(shí)間10 min，然后加入0.1 mL 30%偏磷酸終止反應(yīng)。經(jīng)過(guò)離心得到含有丙酮酸的上清液進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。偶聯(lián)反應(yīng)組成：TES-NaOH緩沖液(0.5 mol/L，pH7.5)、NADH(0.15 mmol /L)50 μg乳酸脫氫酶(LDH)和0.1 mL PTSGlc反應(yīng)上清液，反應(yīng)總體積2.1 mL。反應(yīng)添加LDH前后分別測(cè)定在340 nm處吸光度。采用分光光度計(jì)法測(cè)定并繪制NADH在340 nm的標(biāo)準(zhǔn)吸光曲線。1個(gè)酶活力(U)定義為:每分鐘催化生成1 μmol丙酮酸所需酶量。

1.2.6 分析方法

菌體濃度測(cè)定：將發(fā)酵液稀釋26倍，測(cè)定562 nm處的吸光值。

葡萄糖測(cè)定：將發(fā)酵液離心(9 000×g，2 min)除去CaCO3及菌體，然后稀釋100倍，經(jīng)生物傳感分析儀SBA-40C(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定。

有機(jī)酸含量測(cè)定：發(fā)酵液中有機(jī)酸含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[19]采用高效液相色譜法。

氨基酸含量測(cè)定：發(fā)酵液中氨基酸含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]采用氨基酸自動(dòng)分析儀。

葡萄糖吸收速率測(cè)定：在初始葡萄糖為80 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%，每2 h取樣測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖消耗速率。

2 結(jié)果與分析

2.1表達(dá)載體和重組菌株的構(gòu)建

以C.glutamicumATCC 13032基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得基因ptsG、iolT1和ppgk，先后經(jīng)過(guò)純化、酶切、與具有相同酶切末端表達(dá)載體酶連、轉(zhuǎn)化E.coliJM109、菌落PCR，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)液體培養(yǎng)提取質(zhì)粒，質(zhì)粒單雙酶切及PCR進(jìn)行驗(yàn)證(圖2A)，各基因片段大小正確(表2)，以構(gòu)建質(zhì)粒載體為模板擴(kuò)增各基因，測(cè)序比對(duì)正確，證明重組表達(dá)載體pECXK-99E-ppgk-iolT1、pDXW-8-ptsG構(gòu)建成功。

A：M-DL15000 Marker； 1-基因ptsG PCR產(chǎn)物；2-基因iolT1 PCR產(chǎn)物；3-pDXW-8-ptsG SacI+SacII雙酶切產(chǎn)物ptsG；4-pDXW-8-ptsG SacI 單酶切產(chǎn)物；5-pECXK-99E-ppgk-iolT1 KpnI+EcoRI雙酶切產(chǎn)物iolT1;6-pECXK-99E-ppgk-iolT1 KpnI+pstI雙酶切產(chǎn)物ppgk;7-pECXK-99E-ppgk-iolT1 EcoRI 單酶切產(chǎn)物 B-1 ZL-8/pDXW-8-ptsG SacI+ SacII雙酶切產(chǎn)物ptsG;2-pECXK-99E-ppgk-iolT1 KpnI+EcoRI雙酶切產(chǎn)物iolT1;3-pECXK-99E-ppgk-iolT1 KpnI+pstI雙酶切產(chǎn)物ppgk圖2 PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pDXW-8-ptsG、pECXK-99E-ppgk-iolT1單雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Enzyme digestion and PCR analysis of the recombinant plasmid pDXW-8-ptsG, pECXK-99E-ppgk-iolT1

將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pDXW-8-ptsG、pECXK-99E-ppgk-iolT1電轉(zhuǎn)化至C.glutamicumZL-8中，在卡那霉素終質(zhì)量濃度為25 μg/mL的LBHIS固體平板上30 ℃培養(yǎng)36 h，挑取陽(yáng)性克隆菌鏡檢，液體培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖2B)，由圖2B可知，重組菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG、C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1構(gòu)建成功。

2.2不同葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因在C.glutamicumZL-8中酶活性測(cè)定及SDS-PAGE分析

為了確定外源基因ppgk、iolT1和ptsG是否在ZL-8中正常表達(dá)，本文利用SDS-PAGE及酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(如圖3)，從3A中可以看出，在大小26.7 kDa有條帶明顯變粗且顏色加深，與基因ppgk編碼蛋白PpgK大小一致，酶活測(cè)定分析重組菌粗酶液酶活力為0.27 U/mL，較出發(fā)菌株提高了768%，說(shuō)明外源基因ppgk在C.glutamicumZL-8中成功表達(dá)；從圖3B中可以看出，在54 kDa及72.6 kDa各處有一條帶，且顏色稍深，分別與基因iolT1和ptsG編碼膜蛋白IolT1、EIIGlc大小一致，EIIGlc活性可通過(guò)PTSGlc系統(tǒng)酶活性間接反映，預(yù)處理菌株測(cè)定PTSGlc系統(tǒng)酶活力，重組菌PTSGlc系統(tǒng)酶活力為2.21 U/mL，較出發(fā)菌株提高了62.7%，由此說(shuō)明外源基因iolT1和ptsG在C.glutamicumZL-8中成功表達(dá)。

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker;A:1-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)膜蛋白;2-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)膜蛋白; 3-C. glutamicum ZL-8/pDXW-8-ptsG未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)膜蛋白;4-C. glutamicum ZL-8/pDXW-8-ptsG經(jīng)IPTG誘導(dǎo)膜蛋白；B:1-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)全細(xì)胞蛋白;2-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk經(jīng)IPTG誘導(dǎo)全細(xì)胞蛋白;3-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)全細(xì)胞蛋白;4-C. glutami-cum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)全細(xì)胞蛋白圖3 C. glutamicum ZL-8中外源基因ptsG、iolT1和ppgk 蛋白表達(dá)電泳驗(yàn)證圖Fig. 3 The electrophoresis of protein encoded by ptsG,olT1 and ppgk gene in C. glutamicum ZL-8

2.3不同葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因過(guò)表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

出發(fā)菌株C.glutamicumZL-8為葡萄糖代謝緩慢的L-賴氨酸產(chǎn)生菌，葡萄糖消耗速率緩慢。為了強(qiáng)化菌株的葡萄糖代謝能力，在出發(fā)菌株中過(guò)量表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因ptsG、iolT1和ppgk，研究不同葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。出發(fā)菌株和重組菌株搖瓶種子(圖4A)和發(fā)酵生長(zhǎng)曲線(圖4B)。

表3 重組谷氨酸棒桿菌中蛋白酶活性測(cè)定

注：“-”沒(méi)有檢測(cè)。

■-C. glutamicum ZL-8；▲-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1；▽-C. glutamicum ZL-8/pDXW-8-ptsG圖4 出發(fā)菌株和重組菌株菌體生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of the oringinal and recombinant strains

由圖4A可知，重組菌與出發(fā)菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，但生長(zhǎng)較為緩慢，并且最終菌體生物量也略低。由于搖瓶種子培養(yǎng)期間未添加誘導(dǎo)劑，重組菌中外源基因未表達(dá)及表達(dá)載體對(duì)菌體生長(zhǎng)具有一定的抑制作用[21]，致使重組菌生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。從圖4B可以看出，添加終濃度為1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)前(接種培養(yǎng)12 h時(shí)添加)，出發(fā)菌株生長(zhǎng)快于重組菌株；發(fā)酵16 h至發(fā)酵結(jié)束，由于添加了誘導(dǎo)劑，重組菌中外源基因過(guò)量表達(dá)，生長(zhǎng)速率加快、菌體生物量明顯高于出發(fā)菌株，強(qiáng)化了菌株葡萄糖代謝能力。與重組菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1相比，重組菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG生長(zhǎng)速率及最終菌體生物量稍高，但不明顯。有研究表明[22]，不依賴于PTSGlc系統(tǒng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖約占葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)總數(shù)的15%。因此僅從菌體生長(zhǎng)方面可知，過(guò)表達(dá)基因ptsG與同時(shí)過(guò)表達(dá)基因iolT1和ppgk并無(wú)明顯區(qū)別。

2.4不同葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因過(guò)表達(dá)對(duì)菌體葡萄糖消耗速率及L-賴氨酸合成的影響

搖瓶發(fā)酵出發(fā)菌株C.glutamicumZL-8及重組菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1、C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG，發(fā)酵期間定期取樣測(cè)定葡萄糖含量和L-賴氨酸產(chǎn)量并繪制發(fā)酵曲線(圖5)。

▲-C. glutamicum ZL-8；●-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1；□-C. glutamicum ZL-8/pDXW-8-ptsG圖5 出發(fā)菌株和重組菌株在搖瓶培養(yǎng)條件下葡萄糖消耗速率和L-賴氨酸產(chǎn)量Fig.5 The consumption rate and L-lysine yield of oringinal and recombinant strains in shake flask culture

由圖5可知，發(fā)酵結(jié)束后出發(fā)菌株C.glutamicumZL-8發(fā)酵液中L-賴氨酸為38.3 g/L，重組菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG、C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1L-賴氨酸產(chǎn)量分別為44.6、47.7 g/L，與C.glutamicumZL-8相比，L-賴氨酸產(chǎn)量分別提高了16.4%、24.7%，同時(shí)發(fā)酵周期也分別縮短了12、8 h，說(shuō)明重組菌葡萄糖代謝能力顯著增強(qiáng)。重組菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG和C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1產(chǎn)酸速率基本一致，耗糖速率稍快于后者，而糖酸轉(zhuǎn)化率稍低。由于PTSGlc系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖效率高于不依賴于PTSGlc系統(tǒng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，消耗了大量胞內(nèi)PEP，生成較多的丙酮酸及其衍生物質(zhì)如乳酸、丙氨酸、纈氨酸等，使糖酸轉(zhuǎn)化率降低。而不依賴于PTSGlc系統(tǒng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中葡萄糖激酶以ATP或PolyP為磷酸供體，從而積累較多的胞內(nèi)PEP，更多的直接經(jīng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化生成賴氨酸前體物質(zhì)草酰乙酸，避免生成大量丙酮酸而降低糖酸轉(zhuǎn)化率。

2.5不同菌株發(fā)酵液中副產(chǎn)物有機(jī)酸和氨基酸含量分析

LINDNER等[8]研究表明，過(guò)量表達(dá)基因iolT1和ppgk可降低副產(chǎn)物丙酮酸及其衍物質(zhì)如乳酸、丙氨酸和纈氨酸等的積累。為進(jìn)一步研究過(guò)量表達(dá)不同葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途經(jīng)相關(guān)基因?qū)-賴氨酸發(fā)酵副產(chǎn)物如有機(jī)酸和其他氨基酸的影響，發(fā)酵賴氨酸結(jié)束后測(cè)定有機(jī)酸和氨基酸濃度。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 C. glutamicum ZL-8與C. glutamicum ZL-8/pDXW-8-ptsG、C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1發(fā)酵液中氨基酸和有機(jī)酸含量比較

發(fā)酵液中氨基酸測(cè)定結(jié)果表明，重組菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1和C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG發(fā)酵液中L-賴氨酸含量分別為47.7、44.6 g/L，較出發(fā)菌株的38.3 g/L分別提高了24.7%、16.4%。其他氨基酸如丙氨酸、纈氨酸和天冬氨酸含量變化較為明顯(表4)，重組菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG發(fā)酵液中丙氨酸和纈氨酸較出發(fā)菌株C.glutamicumZL-8分別提高了19.6%、13.4%，天冬氨酸含量變化不明顯；而重組菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1發(fā)酵液中丙氨酸和纈氨酸含量分別降低了22.9%、36.1%，天冬氨酸含量升高了46.7%。由于過(guò)表達(dá)基因ptsG，提高了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率，同時(shí)也生成了較多的丙酮酸及其衍生物質(zhì)丙氨酸、纈氨酸等；而基因iolT1、ppgk的過(guò)量表達(dá)不以PEP為磷酸供體，降低了丙酮酸及其衍生物質(zhì)的生成，而天冬氨酸積累量的提高，是由于天冬氨酸至L-賴氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶(天冬氨酸激酶)活性較低。

發(fā)酵液中有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果表明，同時(shí)過(guò)量表達(dá)基因iolT1和ppgk降低了以PEP為磷酸供體葡萄糖的消耗，使更多的PEP直接經(jīng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化生成草酰乙酸，降低了副產(chǎn)物如丙酮酸、乳酸、乙酸等的生成，重組菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1發(fā)酵液中乳酸、乙酸、丙酮酸含量分別為2.35、2.12、1.64 g/L，比出發(fā)菌株的3.69、2.72、2.23 g/L分別降低了36.4%、22.1%、26.5%；而過(guò)表達(dá)基因ptsG消耗較多的PEP，因此產(chǎn)生了較多的丙酮酸及丙酮酸衍生物質(zhì)(有機(jī)酸)。重組菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG發(fā)酵液中的上述3種有機(jī)酸較出發(fā)菌株分別提高了30.6%、11.4%、42.1%。大量研究表明[8,11-12]強(qiáng)化不依賴于PTSGlc系統(tǒng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途，可使碳代謝更加平衡、副產(chǎn)物減少、主產(chǎn)物率提高等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

本研究對(duì)葡萄糖代謝緩慢的賴氨酸產(chǎn)生菌C.glutamicumZL-8進(jìn)行基因工程改造，克隆來(lái)源于C.glutamicumATCC 13032 EIIGlc基因(ptsG)、肌醇透性酶基因(iolT1)和葡萄糖激酶基因(ppgk)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pDXW-8-ptsG、pECXK-99E-ppgk-iolT1，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至C.glutamicumZL-8，構(gòu)建重組菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1、C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG，對(duì)重組菌株及出發(fā)菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，與C.glutamicumZL-8相比，重組菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1葡萄糖激酶酶活力提高了768%，而C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsGPTSGlc系統(tǒng)酶活力也提高了62.7%，兩重組菌菌體生物量明顯提高、發(fā)酵周期分別縮短了8、12 h，說(shuō)明重組菌葡萄糖代謝能力顯著增強(qiáng)，L-賴氨酸產(chǎn)量也分別提高了24.7%、16.4%；同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液副產(chǎn)物如有機(jī)酸和其他氨基酸，重組菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1發(fā)酵液中副產(chǎn)物如乳酸、乙酸和纈氨酸等均有不同程度的降低，而重組菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG發(fā)酵液中副產(chǎn)物均有一定程度升高。由于過(guò)量表達(dá)基因ptsG高效轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，一定程度上破壞碳代謝平衡，使得副產(chǎn)物增多、糖酸轉(zhuǎn)化率降低；而同時(shí)過(guò)量表達(dá)基因ppgk和iolT1，葡萄糖消耗速率稍低于過(guò)表達(dá)基因ptsG，同時(shí)降低了以PEP為磷酸供體磷酸化葡萄糖的消耗，使更多的PEP經(jīng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化生成草酰乙酸，避免生成大量丙酮酸造成碳代謝不平衡，也減少了不利于菌體生長(zhǎng)物質(zhì)如乙酸、乳酸等大量積累。

張傳志[11]為了減少質(zhì)粒使用，將整合基因ppgk-iolT1整合到基因組ptsI位點(diǎn)上；蔡恒等[12]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)因子IolR抑制葡萄糖激酶基因的表達(dá)，通過(guò)敲除基因iolR增強(qiáng)葡萄糖激酶基因的表達(dá)。為進(jìn)一步強(qiáng)化菌株葡萄糖代謝能力、提高糖酸轉(zhuǎn)化率、降低副產(chǎn)物，有必要缺陷PTSGlc系統(tǒng)、將ppgk和iolT1整合至基因組上，同時(shí)敲除抑制葡萄糖激酶表達(dá)基因iolR。

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OverexpressionofgenesrelatedtoglucosetransportsysteminCorynebacteriumglutamicumZL-8andtheireffectsonglucosemetabolismandL-lysinesynthesis

LIU Dong-dong, ZHANG Wei-guo*, XU Jian-zhong*, TIAN Cheng-fu

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Corynebacteriumglutamicum(C.glutamicum) ZL-8 is anL-lysine producing strain of mutation breeding with low rate of glucose uptake and phosphorylation. Phosphoenolpyruvate-dependent glucosephospho-transferase system (PTSGlc) and PTSGlc-independent play an important role in the process of glucose uptake and phosphorylation. In this paper, the roles of EIIGlc, IolT1, glucokinase in glucose metabolic rate,L-lysine yield and by-products accumulation were investigated by overexpressing EIIGlc(ptsG), IolT1 (iolT1), glucokinase (ppgk)coding genes inL-lysine producing strainCorynebacteriumglutamicumZL-8. Compared with the original strain, theL-lysine yield and glucose metabolic rate of the recombinant strainC.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG(increased by 27.3% and 16.4%, respectively) andC.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1(increased by 16.7% and 24.7%, respectively) were increased by overexpressing the genes in glucose transport system. In addition, the activity of PTSGlcsystem inC.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsGwas increased by 62.7%, whereas the activity of glucokinase inC.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1 was increased by 768%. Meanwhile, results indicated that the accumulation of organic acids (pyruvic acid, lactic acid and acetic acid) and amino acids (valine, alanine, aspartic acid) changed more obviously during overexpression of the different genes involved in glucose transport system.

Corynebacteriumglutamicum; glucose transport system;glucose metabolic rate;L-lysine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013796

碩士研究生(張偉國(guó)教授，徐建中講師為通訊作者，E-mail：zhangwg168@126.com；xujz126@126.com)。

江蘇省自然科學(xué)基金青年基金(BK20150149)

2017-01-10，改回日期：2017-03-28