顏艷英，王襲，范學(xué)輝，張清安

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

超聲處理對黑米酒中有機(jī)酸的影響

顏艷英，王襲，范學(xué)輝，張清安*

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

加速黑米酒的陳化是企業(yè)所面臨的主要問題，已有研究表明超聲可以加速酒類陳化，但關(guān)于超聲對黑米酒中有機(jī)酸的影響未見報(bào)道。該研究通過利用高效液相色譜法檢測在不同超聲參數(shù)(功率、頻率及時(shí)間)下黑米酒中5種有機(jī)酸的含量，并分析其變化規(guī)律。結(jié)果表明：超聲波促使黑米酒中酒石酸、檸檬酸的含量減少；而草酸、乳酸、乙酸的含量增加。這些研究結(jié)果將為超聲處理黑米酒的進(jìn)一步優(yōu)化提供依據(jù)，也為超聲波早日應(yīng)用在黑米酒陳化工藝中提供借鑒和理論依據(jù)。

超聲波；黑米酒；有機(jī)酸；超聲功率；超聲頻率；超聲時(shí)間

使黑米酒具有酸性特征的有機(jī)酸類是黑米酒的主要組成成分。而有機(jī)酸主要是通過其種類、濃度及構(gòu)成影響著酒樣的酸性，進(jìn)而影響黑米酒的風(fēng)味。此外，有機(jī)酸對黑米酒的色、香、味也有著重要的影響[1-3]。酒類中有機(jī)酸大部分是來源于發(fā)酵過程中的生理生化反應(yīng)，如乙醇發(fā)酵，乙醇的氧化反應(yīng)，蘋果酸乳酸發(fā)酵等。其中酒中的醋酸有刺激嗅覺神經(jīng)，增加食欲，增強(qiáng)體魄的功效[1]；而乳酸、檸檬酸、酒石酸等能給酒類帶來良好的風(fēng)味，增加酒的醇厚感[2]。舒杰[3]利用超聲破碎儀處理黃酒模型體系(主要以乙醇、主要揮發(fā)物質(zhì)和有機(jī)酸建立的模型酒)，發(fā)現(xiàn)超聲加速了模型酒中乳酸和乙醇的酯化反應(yīng)，從而增加了黃酒的香氣。申遠(yuǎn)[4]在不同超聲參數(shù)(超聲功率、頻率、溫度及時(shí)間)下處理紅葡萄酒時(shí)發(fā)現(xiàn)乙酸、檸檬酸、琥珀酸、乙二酸、乳酸的含量都發(fā)生不同程度的改變，且變化基本符合紅酒自然陳化過程中有機(jī)酸的變化趨勢。因此，了解超聲處理過程中黑米酒中有機(jī)酸的種類及含量的變化，對判定超聲前后黑米酒的風(fēng)味變化具有一定的實(shí)際意義。但在此之前，需要對超聲波的實(shí)際功率進(jìn)行深入的了解。

超聲波作為一種新技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛，如超聲提取、乳化、干燥、過濾、分離等[5-7]。但是在應(yīng)用過程中經(jīng)常被研究者忽略的問題是：將超聲池清洗儀上標(biāo)識的電功率誤認(rèn)為是超聲池的實(shí)際功率進(jìn)行討論分析，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果、數(shù)據(jù)很難重復(fù)，且不同研究之間的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)很難相互比較[8-11]。因此，在討論超聲波對黑米酒中有機(jī)酸的影響之前，需要對超聲清洗池的實(shí)際功率進(jìn)行測量，篩選出超聲效果較好的超聲參數(shù)。超聲波的實(shí)際功率表達(dá)形式有多種，通常探頭式的超聲波利用聲能(W/cm2)表示，而超聲波清洗儀通常使用聲功率密度(W/L)來表示[12]。

本文通過量熱法計(jì)算超聲清洗儀在不同功率頻率下的實(shí)際聲功率密度[12-15]，篩選出聲功率密度變化明顯的超聲參數(shù)；并采用反向高效液相色譜法，測定超聲處理后黑米酒中草酸、乳酸、乙酸、酒石酸及檸檬酸的含量，進(jìn)而利用聲功率密度來代替電功率分析超聲對黑米酒中有機(jī)酸的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與設(shè)備

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑

陶瓷壇貯存3年的黑米酒樣品：陜西省朱鹮黑米酒有限責(zé)任公司提供。

磷酸：分析純，天津市廣成化學(xué)試劑公司；磷酸二氫鉀：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；草酸(99.8%)、酒石酸(99.5%)、乳酸(90%)、乙酸(99.8%)、檸檬酸(99.8%)：優(yōu)級純，中國食品藥品檢定研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗機(jī)(KQ-300VDE)，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；溫度采集器(M5000-AS32)，北京安伏電子技術(shù)有限公司；溫度在線監(jiān)測系統(tǒng)(Anyview6)，北京安伏電子技術(shù)有限公司；低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB-5Z20)，上海翔雅儀器設(shè)備有限公司；電子分析天平(BS200S-WEI)，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；精密酸度計(jì)(PHS-3C)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-III)，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；紫外-可見檢測器(UV230II)，大連伊利特分析儀器有限公司；色譜柱溫箱(ZW230II)，大連伊利特分析儀器有限公司；高壓恒流泵(P230II)，大連伊利特分析儀器有限公司；反相液相色譜柱(TC-C18)，安捷倫科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1超聲波清洗儀的實(shí)際聲功率密度的計(jì)算

超聲波清洗池周圍用泡沫板包裹，減少熱量散失，超聲池內(nèi)水位固定為100 mm，將溫度探頭固定至超聲池中間位置不變，并且使探頭距離超聲波換能器的高度為該條件下的半波長[9, 16]。利用低溫冷卻循環(huán)泵將超聲池內(nèi)水的初溫控制在(20 ℃±1) ℃，隨后在不同超聲條件下超聲20 min，計(jì)算溫度變化量，并根據(jù)熱量法公式稍加修改計(jì)算聲功率密度[11, 17]。

(1)

式中：dT/dt，溫度變化量；Cp，溶劑的比熱容，J/(kg·K)；ρ，所用溶劑的密度，kg/L。

2.2黑米酒樣品的超聲處理過程

取適量的黑米酒于具塞試管中，固定在水位為100 mm的超聲波清洗池中，每次固定的位置和高度(距離換能器的高度為超聲波的半波長)不變。研究黑米酒在不同超聲功率(120、180、240及300 W)、超聲頻率(45、80及100 kHz)和超聲時(shí)間(20、40、60、80及100 min)下有機(jī)酸的變化。

2.3黑米酒中有機(jī)酸的測定

2.3.1 流動(dòng)相的制備

精確稱取23.12 g KH2PO4加入純凈水，定容于2 L容量瓶中(濃度為0.085 mol/L)，用磷酸調(diào)節(jié)酸度至pH值至2.90。流動(dòng)相需經(jīng)過0.45 μm無機(jī)纖維樹脂濾膜過濾，并超聲波脫氣20 min后方可使用。

2.3.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制

準(zhǔn)確稱取(量取)5種有機(jī)酸，使用2.3.1中配置好的流動(dòng)相溶解，然后定容至100 mL，有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制好后置于4 ℃冰箱中，待用。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度見表1，由于乳酸和乙酸為液體試劑，此處用稱量法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液可能會(huì)產(chǎn)生比較大的誤差，故使用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液進(jìn)行標(biāo)定。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.3.3 高效液相色譜儀運(yùn)行條件

色譜柱：反向液相色譜柱(安捷倫TC - C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：2.3.1配制好的流動(dòng)相；流速：0.60 mL /min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測器波長：210 nm；柱溫：30 ℃。

2.4數(shù)據(jù)處理

以上測定均需重復(fù)進(jìn)行3次，使用Microsoft Office Excel、DPS和主成分分析軟件進(jìn)行相關(guān)圖表的繪制和數(shù)據(jù)處理。

3 結(jié)果與分析

3.1實(shí)際聲功率密度

不同功率、頻率下的實(shí)際聲功率密度如表2。

表2 KQ-300VDE超聲波清洗機(jī)的實(shí)際聲功率密度 單位：W/L

注：同一行數(shù)據(jù)后大寫字母表示在P<0.05 水平上的顯著性差異，小寫字母表示在P<0.05垂直上的顯著差異。

超聲頻率是指每秒鐘波反復(fù)變化的次數(shù)，而功率是指這種振蕩所具有的能量。當(dāng)功率不變頻率不同時(shí)，所產(chǎn)生的的空化效應(yīng)的強(qiáng)度也會(huì)不同(頻率越高，周期就會(huì)越短，為空泡生長、爆破等空化過程提供的時(shí)間就不足，從而空化效應(yīng)變?nèi)?，從而實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不一樣；當(dāng)然，頻率相同功率不同，由于所提供的能量不同，結(jié)果也是有區(qū)別的。

由表2可知，當(dāng)超聲頻率不變的情況下，超聲功率對聲功率密度的影響并不顯著，即該超聲儀在改變超聲功率時(shí)，其實(shí)際的超聲作用并沒有明顯改變，這也可以解釋為什么有的文章中提到的超聲功率對反應(yīng)的影響較微弱[18]。但也不能否認(rèn)在45 kHz和100 kHz時(shí)聲功率密度隨超聲功率的影響雖不顯著卻有上升的趨勢。相對于功率，頻率對聲功率密度的影響十分顯著，不同功率下聲功率密度均在45 kHz時(shí)達(dá)到最大，其中，45 kHz，300 W時(shí)聲功率密度達(dá)到最大，超聲效果明顯。但考慮到不同功率之間的顯著性差異，當(dāng)頻率為100 kHz時(shí)P<0.05，因此，當(dāng)探討超聲功率對有機(jī)酸的影響時(shí)，固定頻率為100 kHz；300 W時(shí)超聲波清洗儀的聲功率密度相對較大，超聲效果較為明顯，因此，當(dāng)分析超聲頻率對有機(jī)酸的影響時(shí)，固定功率為300 W。

3.2超聲功率對黑米酒中有機(jī)酸的影響

草酸、乳酸、乙酸、酒石酸及檸檬酸的標(biāo)準(zhǔn)HPLC色譜圖如圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限如表3。

1-草酸；2-酒石酸；3-乙酸；4-乳酸；5-檸檬酸圖1 5種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)HPLC色譜圖Fig. 1 Standard HPLC chromatogram of five organic acids

表3 5種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)

當(dāng)超聲頻率為100 kHz，超聲時(shí)間為20 min時(shí)，不同超聲功率對黑米酒中五種有機(jī)酸的影響如圖2。由圖2可知超聲后草酸、乳酸的含量變化并不十分顯著(P>0.05)，但都略有增加，而乙酸發(fā)生了顯著性增加(P<0.05)，3種酸在300 W(23.00 W/L)時(shí)含量均達(dá)到最大，分別為0.40、9.43及14.53 g/L。結(jié)合表2的聲功率密度對其進(jìn)行主成分分析(PCA)如圖3，可知草酸、乳酸和乙酸同聲功率密度呈正相關(guān)。而酒石酸和檸檬酸的含量隨著聲功率密度的增加呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，當(dāng)聲功率密度達(dá)到23.00 W/L時(shí)，雖有所降低，但與未處理的含量無顯著差異，酒石酸在20.67 W/L時(shí)含量最低為0.43 g/L，降低了29.5%。檸檬酸在超聲后含量顯著下降，當(dāng)聲功率密度為16.36 W/L時(shí)，檸檬酸含量減少量最多為0.99 g/L，降低了36.17%，檸檬酸的含量雖然隨著聲功率密度的增加也在不斷的回升，但仍沒有超過未超聲的含量。通過主成分(PCA)分析可知，酒石酸、檸檬酸與聲功率密度呈負(fù)相關(guān)，即超聲后酒石酸和檸檬酸的含量都有不同程度的下降。

柱圖從左至右依次為：草酸、乳酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸圖2 超聲功率對黑米酒中有機(jī)酸含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on organic acids of black rice wine

圖3 不同功率超聲波處理后樣品差異的主成分(PCA)分析圖Fig.3 PCA scores and loadings for PC1 and PC2 of ultrasonic power on physicochemical properties of black rice wine

3.3超聲頻率對黑米酒中有機(jī)酸的影響

如圖4所示，超聲功率(300 W)和超聲時(shí)間(20 min)不變，不同超聲頻率處理后黑米酒中除了草酸無顯著性變化外，乳酸、酒石酸、乙酸及檸檬酸含量均發(fā)生顯著變化。其中，乳酸和乙酸含量顯著增加，比較不同超聲頻率處理后酒樣，發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲頻率為45 kHz、聲功率密度為52.27 W/L時(shí)，酒樣中的乳酸和乙酸含量達(dá)到最大，分別為10.94 g/L、17.11 g/L；在80 kHz (24.08 W/L)和100 kHz (23.00 W/L)時(shí)乳酸與乙酸的含量均下降，但80 kHz時(shí)乳酸和乙酸含量的變化與100 kHz時(shí)的變化無顯著性差異，聯(lián)系聲功率密度可知，24.08 W/L與23.00 W/L之間差異性很小，從而導(dǎo)致乳酸和乙酸的含量在80 kHz及100 kHz時(shí)無顯著性差異。與乳酸和乙酸不同，酒石酸和檸檬酸在超聲后含量均顯著性下降，在45 kHz(52.27 W/L)時(shí)達(dá)到最低分別為0.48 g/L、1.39 g/L。從超聲波的空化效應(yīng)及機(jī)械剪切兩方面進(jìn)行探討。一方面，當(dāng)超聲達(dá)到一定能量時(shí)，液體中的微小泡核被激活，表現(xiàn)為振蕩和生長，但只有當(dāng)超聲頻率與空化氣泡的自然共振頻率相等時(shí)，才能達(dá)到最有效的能量耦合，從而使得空化氣泡崩潰，產(chǎn)生的瞬時(shí)的高溫、高壓，作用于溶液中的分子，使其裂解[19]；另一方面，超聲處理使液體分子攜帶高能運(yùn)動(dòng)，且具有較高的能量，液體介質(zhì)對物質(zhì)的剪切力就會(huì)增大[20]。另外，超聲波頻率越低，其剪切作用越強(qiáng)；頻率越高，其聲化學(xué)效應(yīng)越強(qiáng)，產(chǎn)生的自由基越多[21]。因此，超聲波處理可能將有機(jī)酸分子從酯類化合物中釋放出來，同時(shí)由于超聲處理，分子運(yùn)動(dòng)加快，也會(huì)使揮發(fā)性有機(jī)酸揮發(fā)。

柱圖從左至右依次為：草酸、乳酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸圖4 超聲頻率對黑米酒中有機(jī)酸含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on organic acids of black rice wine

3.4超聲時(shí)間對黑米酒中有機(jī)酸的影響

圖5顯示，在不同超聲時(shí)間(固定超聲功率、頻率分別為300 W、100 kHz，聲功率密度為23.00 W/L)處理后，整體上草酸和乳酸無顯著變化；檸檬酸含量顯著降低；乙酸含量先增加后下降；而酒石酸呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢。酒樣在超聲處理100 min后，檸檬酸含量降到最小，降低了12.9%；而乙酸在超聲20 min時(shí)達(dá)到最大為14.53 g/L；酒石酸含量在超聲60 min時(shí)含量最低，下降約36.0%。5種酸的含量在80 min和100 min處理后無明顯差異，與未處理酒樣相較，乳酸、草酸及乙酸無明顯差異，酒石酸和檸檬酸顯著降低，而在超聲20 min時(shí)五種酸均呈現(xiàn)顯著性變化，草酸、乳酸及乙酸顯著增加，而酒石酸、檸檬酸顯著下降。結(jié)合自然陳釀及超聲波處理黃酒中有機(jī)酸含量變化的相關(guān)研究，黃酒在儲存過程中，大量的醇類、醛類發(fā)生了氧化反應(yīng)，因此酒中有機(jī)酸含量增加，但隨著時(shí)間的延長，酒中酸類物質(zhì)與醇類結(jié)合生成酯類導(dǎo)致酸類下降，同時(shí)，檸檬酸-乳酸發(fā)酵過程中檸檬酸經(jīng)脫羧作用轉(zhuǎn)化為乳酸和二氧化碳，檸檬酸含量下降，乳酸含量增加，而超聲過程中有機(jī)酸的變化也都符合陳化規(guī)律[3, 22-23]。

柱圖從左至右依次為：草酸、乳酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸圖5 不同時(shí)間下超聲波處理黑米酒中有機(jī)酸含量變化Fig.5 The influence of ultrasonic time on organic acids of black rice wine

4 結(jié)論

綜合上述的討論與分析，超聲處理對黑米酒中5種有機(jī)酸含量的影響比較明顯，從有機(jī)酸含量的變化趨勢看：超聲誘導(dǎo)黑米酒中酒石酸、檸檬酸含量減少，草酸、乳酸、乙酸含量增加；而不同超聲處理?xiàng)l件(功率、頻率、時(shí)間)對黑米酒中5種有機(jī)酸的影響不盡相同，其中超聲頻率對黑米酒中乳酸、乙酸的影響最大(45 kHz下乳酸、乙酸含量達(dá)到最大值)；而當(dāng)超聲功率為120 W時(shí)，檸檬酸含量最低；超聲時(shí)間對酒石酸的影響最大，在超聲至60 min時(shí)酒石酸含量達(dá)到最低值。同時(shí)，文中通過測量計(jì)算超聲清洗儀的聲功率密度，篩選出超聲效果明顯的超聲參數(shù)(100 kHz，300 W)，繼而通過聲功率密度分析超聲促使有機(jī)酸變化的原因。當(dāng)然，在實(shí)際聲功率密度下我們只探討了超聲對酸類物質(zhì)的影響，其他物質(zhì)比如酚類、電導(dǎo)率、pH值等，還需要我們做進(jìn)一步的研究探討。

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Effectofultrasoundirradiationonorganicacidsinblackricewine

YAN Yan-ying,WANG Xi,FAN Xue-hui,ZHANG Qing-an*

(School of Food Engineering and Nutrition Sciences, Xi’an 710119, China)

Studies have shown that ultrasound can induce accelerated aging of wine, which is the most important problem for the black rice wine enterprise, but the effect of ultrasound on organic acids of black rice wine has not been reported. In this paper, the contents of 5 kinds of organic acids in black rice wine were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) under different ultrasonic parameters (power, frequency and time). The results showed that the content of tartaric acid and citric acid decreased, and the content of oxalic acid, lactic acid and acetic acid increased under ultrasound irradiation. These results will provide a useful reference and theoretical basis for the further optimization of ultrasonic parameters in black rice wine, and for the early application of ultrasound in the process of black rice wine aging.

ultrasound; black rice wine; organic acid; ultrasonic power; ultrasonic frequency; ultrasonic time

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013929

碩士研究生(張清安副教授為通訊作者,E-mail:qinganzhang@snnu.edu.cn)。

陜西師范大學(xué)2015年研究生培養(yǎng)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(2015CXS027)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31101324)；陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JM3097)；西安市科技局技術(shù)轉(zhuǎn)移促進(jìn)工程項(xiàng)目(CXY1434(5))；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(GK201602005)

2017-01-23 改回日期：2017-03-23