蔣 瑞，劉必林，2，3，4，張 健，2，3，4，陳新軍，2，3，4，倪震宇，林靜遠

·綜述·

甲殼類年齡鑒定方法研究進展

蔣 瑞1，劉必林1，2，3，4，張 健1，2，3，4，陳新軍1，2，3，4，倪震宇1，林靜遠1

（1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.國家遠洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點實驗室，上海 201306；4.遠洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306）

甲殼類特有的蛻殼現(xiàn)象，使其能夠記錄年齡信息的外骨骼周期性消失，因此甲殼類的年齡鑒定一直未得到較好的解決。年齡鑒定是評估甲殼類漁業(yè)資源的基礎(chǔ)，鑒定甲殼類年齡的方法主要有飼養(yǎng)法、標記重捕法、體長頻度法、脂褐素分析法、放射性同位素分析法和硬組織生長紋分析法。飼養(yǎng)法、標記重捕法和放射性同位素分析法較準確，然而由飼養(yǎng)法得到的數(shù)據(jù)不適用于實際野生環(huán)境，放射性同位素分析法花費較高，因此，這兩種方法都存在較大的局限性。應(yīng)用最廣泛的標記重捕法和體長頻度法也存在不足之處。相對于體長頻度鑒齡技術(shù)而言，脂褐素分析法優(yōu)勢明顯，但是對勞動強度和技術(shù)要求高。硬組織生長紋分析法是最近幾年出現(xiàn)的鑒齡技術(shù)，也存在人為主觀性較強等不足。本文對甲殼類年齡鑒定的方法進行了總結(jié)回顧，將不同鑒定方法進行比較，分析優(yōu)缺點，以期為開展甲殼類資源評估與管理提供基礎(chǔ)。

甲殼類；年齡與生長；年齡鑒定方法

甲殼類動物種類多、數(shù)量大，是漁業(yè)資源的重要組成部分［1］，廣泛分布于世界各大洋和南、北極等海域。年齡是研究水生動物生活史的必要組成部分［2］，也是漁業(yè)種群動態(tài)模型及漁業(yè)資源評估中非常重要的參數(shù)之一。大多數(shù)水生動物能夠通過計數(shù)硬組織中的生長紋來鑒定年齡，例如魚類耳石［3－5］、鰭條［6－8］和脊椎骨［9－10］，頭足類耳石［11－12］、角質(zhì)顎［13－14］和內(nèi)殼［15－16］等。然而，甲殼類動物是脫殼式生長，每次脫殼時原先的硬殼被新殼替代，使其鈣化結(jié)構(gòu)周期性消失。因此，甲殼類的年齡鑒定一直未得到較好的解決［17］，直到2012年KILADA等［18］首次發(fā)現(xiàn)甲殼類動物體內(nèi)存在能夠用來鑒定年齡的硬組織。本文歸納了現(xiàn)有甲殼類年齡鑒定的方法，并且對各方法進行了比較，以期為開展甲殼類年齡與生長的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)法

實驗室飼養(yǎng)法是甲殼類年齡鑒定最精確可靠的方法。WICKINS等［19］采用此方法對甲殼類的年齡進行了研究，并將結(jié)果記錄于書中。LUKHAUP等［20］和NEW等［21］也運用此方法分別對養(yǎng)殖的克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）和淡水蝦類的年齡進行了鑒定（表1）。

1.2 標記重捕法

標記重捕法是甲殼類另一個直接有效的鑒齡方法，作為研究動物生活史（如棲息地、死亡率、生長率、年齡等）和評價漁業(yè)資源并對其進行管理的重要工作內(nèi)容，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用在漁業(yè)資源研究中。采用標記重捕法，可以通過對標記生物個體或種群放流和重捕的時間、空間來分析和推測該生物移動的方向、速度、路線以及范圍，并可以依據(jù)標記生物體長、重量和年齡的變化推測其在放流場所的生長率，進而為評估漁業(yè)資源現(xiàn)狀提供資料和依據(jù)。為了確保標記的保留時間，標記通常被放置在甲殼類甲殼之下。常用的標記有被動整合雷達標記（passive integraded transpoder，PIT）、微編碼線標記（code wire tag，CWT）、可視植入字母數(shù)字標記和可視植入彈性體等。

可視植入字母數(shù)字標記和可視植入彈性體要求從外部可以直接讀取信息，所以通常需要放置在透明的甲殼類甲殼之下。然而，當(dāng)甲殼類的外殼鈣化加厚之后，可讀性通常會變差［22］，所以，相比之下，CWT和PIT更適合于標記重捕法的甲殼類年齡鑒定中。

WEINGARTNER［23］于1981年第一次將標記重捕法運用于克氏原螯蝦的年齡鑒定中，隨后BUBB等［24］、GHERARDI等［25］、HURYN等［26］在研究克氏原螯蝦時同樣用了該方法。眾多實驗中表明，標記重捕法同樣適用于利莫斯螯蝦（Orconectes limosus）［27］、挪威海螯蝦（Nephrops norvegicus）［28］、紅斑青蟹（Callinectes sapidus）［22］、蜘蛛蟹類（Majidae）［29］、歐洲鰲龍蝦（Homarus gammarus）［30－31］、遠海梭子蟹（Portunus pelagicus）［32］、白圓鉗螯蝦（Austropotamobius pallipes）［33］、眼斑龍蝦（Panulirus argus）［34］、巴爾曼螯蝦（Ibacus peronii）［35］和紅色原螯蝦（Procambarus erythrops）［36］。

1.3 體長頻度法

體長頻度法是早期學(xué)者鑒定甲殼類年齡的最常采用方法［37－41］。對于那些不能通過硬組織生長紋鑒定年齡的水生生物，該方法是另外一個最佳選擇［42－43］。體長頻度法首先將體長數(shù)據(jù)分成不同的體長組，然后用Von Bertalanffy生長方程或其他模型將其轉(zhuǎn)換成年齡組［43］。ANDRADE等［44］已經(jīng)開發(fā)了一些軟件包（ELEPHANT、MULTIFAN），用于從長度頻率數(shù)據(jù)估算生長參數(shù)和年齡組成。

早前，MALIK等［45］于1995使用體長頻度法對伊拉克巴士拉河流中伊拉克薄板蟹（Elamenopsis kempi）的種群動力學(xué)進行研究，隨后，RELINI等［37］發(fā)現(xiàn)成年雌性觸須蝦（Aristeus antennatus）的年齡能達到17歲。1999年，OH等［38］同樣使用體長頻度法研究褐蝦（Crangon crangon）的種群動力，SHEEHY等［46］認為在鑒定歐洲鰲龍蝦壽命和生長時使用體長頻度法是一種新的趨勢。體長頻度法在研究加萊螯蝦（Aegla jarai）［47］、小長臂蝦（Palaemonetes pugio）［40］、突尼斯境內(nèi)的淡水蝦類［41］和土耳其螯蝦（Astacus leptodactylus）［39］時都取得了較好的結(jié)果。

1.4 脂褐素分析法

脂褐素是細胞內(nèi)與衰老相關(guān)的色素顆粒，最初由HANNOVER［48］于1842年發(fā)現(xiàn)并報道，如今已被認為是細胞中最明顯的年齡標記［49］?，F(xiàn)在已有的研究證明，部分甲殼類生物其脂褐素濃度會隨著年齡的增長而增加（表1），如日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）［50］、南極背褐蝦（Notocrangon antarcticus）［51］、淡水螯蝦（Pacifastacus leniusculus）［52］、歐洲鰲龍蝦［46］、紅斑青蟹［53］、眼斑龍蝦［54］。在無法建立形態(tài)特征與年齡之間的關(guān)系時，脂褐素分析法可以作為許多無脊椎動物鑒齡研究中的年齡生長標記［51，54－57］。相對于體長或體重法鑒齡技術(shù)而言，該方法優(yōu)勢明顯［52，58］。

1.5 放射性同位素分析法

放射性同位素分析法適用于確定甲殼類外殼年齡，進而反映自上一次蛻殼后經(jīng)過的時間。在蛻殼后，同位素228Ra進入外殼，經(jīng)過一定的時間衰變成為228Th。每個元素的半衰期是已知的，因此可以通過這兩種元素的比率來確定所經(jīng)歷的時間［59－60］。

1.6 硬組織生長紋分析法

硬組織生長紋分析法是近幾年興起、用于甲殼類鑒定年齡的新方法，之前最常用于魚類（鱗片［61－62］、鰭條［6－8］、脊椎骨［9－10］和耳石［3－5］）和頭足類（角質(zhì)顎［13－14］、內(nèi)殼［15－16］和耳石［11－12］）。2012年，KILADA等［18］首次對美國螯龍蝦（Homarus americanus），雪蟹（Chionoecetes opilio），粗糙硬褐蝦（Sclerocrangon boreas）和北極蝦（Pandalus borealis）眼柄或胃磨中的生長紋進行研究，研究首先將眼柄或胃磨制成切片，然后在顯微鏡計數(shù)生長紋的數(shù)目，并與實際年齡做比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生長紋個數(shù)與樣品實際壽命基本相符，因此該方法為甲殼類提供了一種直接準確的年齡鑒定方法。隨后，2015年KILADA等［63］使用胃磨對智利的蹲龍蝦（Pleuroncodesmonodon）、東方黃扁蝦（Cervimunida johni）和里德異腕蝦（Heterocarpus reedi）三種重要商業(yè)價值的甲殼類進行鑒齡。目前，我們在此基礎(chǔ)上對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）和中國明對蝦（Penaeus orientalis）眼柄的生長紋進行了觀察與分析（圖1）。從圖1中，可以清楚地看到眼柄中的生長紋。

2 年齡鑒定方法的比較分析

與野外環(huán)境不同，實驗室飼養(yǎng)法只是在適宜物種生存的環(huán)境中得到數(shù)據(jù)，因此，飼養(yǎng)法得到的數(shù)據(jù)只能用于水產(chǎn)養(yǎng)殖或者構(gòu)建實驗室模型中，不能用于野生環(huán)境中生存生長物種的年齡鑒定。相比于飼養(yǎng)法，標記重捕法將樣品標記后放流，更貼合實際情況，但是該方法實驗周期長，耗費的時間、精力和金錢較多，且對于定期蛻殼的甲殼類物種來說，標記容易破損、丟失，且個體重捕率低。所以，飼養(yǎng)法和標記重捕法雖然得到的結(jié)果比較直接，但在甲殼類鑒齡中不常用。

體長頻度法是甲殼類年齡鑒定中最常見的方法，其數(shù)據(jù)收集起來較簡單迅速。然而，當(dāng)研究的物種年齡越大時，體長頻度法得到的結(jié)果偏差越大，年齡逐漸增大，體長增長率變小，年齡大的、生長緩慢的樣品可能會與年齡小的、生長迅速的樣品分為一組，導(dǎo)致最后得到的結(jié)果不準確。因此，體長頻度法不適宜于壽命長的甲殼類［46，64］。此外，基于長度-頻度模型要求附加的數(shù)據(jù)或假設(shè)的輸入，因此，可能會出現(xiàn)不同的輸出結(jié)果［64］。體長頻度法依賴于確定樣本的體長模態(tài)，理想情況下，模態(tài)可以清楚地予以定義，體長頻度分布也呈正態(tài)分布，分析相對簡單直接。然而，實際情況并非如此，體長分布數(shù)據(jù)的解釋通常易受人為錯誤干擾［64］。

圖1 （a）三疣梭子蟹眼柄中的生長紋；（b）中華絨螯蟹眼柄中的生長紋；（c）中國明對蝦眼柄中的生長紋Fig.1 The grow th bands of eyestalk of（a）Portunus trituberculatus，（b）Eriocheir sinensis and（c）Penaeus orientalis

表1 甲殼類年齡鑒定方法Tab.1 M ethods for the crustaceans age identification

脂褐素分析法不易受到人為因素的影響，但是脂褐素每年的平均累積速率不同，這取決于該物種的代謝速率。例如，紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）、淡水螯蝦、歐洲鰲龍蝦和南極背褐蝦的每年的脂褐素含量百分比分別為2.0%、0.20%、0.07%和0.02%［51，65］。脂褐素含量是物種生理年齡的標記而不是實際年齡的標記，這需要利用已知年齡的樣品對物種和環(huán)境進行校準［54，58］。脂褐素分析法的缺點是對勞動強度和技術(shù)要求高，在應(yīng)用于野生種群之前需要構(gòu)建物種特異性數(shù)據(jù)庫。脂褐素鑒齡研究因量化和校準技術(shù)存在的困難和不確定性而發(fā)展緩慢［18］。因此，這種方法不適合在漁業(yè)管理中使用。

放射性同位素分析法得到的結(jié)果也比較準確，由于元素的半衰期一般較長，所以該方法一般適用于壽命較長的物種，花費較高，測量元素半衰期時要求特殊的實驗設(shè)備。所以，該方法在甲殼類年齡鑒定的中的應(yīng)用相對較少。

硬組織生長紋分析法利用甲殼類眼柄或胃磨等硬組織在生長過程中產(chǎn)生的生長紋來鑒定年齡，利用生長紋鑒定甲殼類年齡是最為精確的方法，硬組織也易于提取。硬組織生長紋分析法對于甲殼類鑒齡研究來說，為直接鑒定甲殼類年齡提供了一個新方法，應(yīng)用前景廣泛。

3 分析與展望

到目前為止還沒有確定哪一種方法是最有效的獨立鑒定甲殼類年齡的方法，對于不同種類的甲殼類或者同一種類的不同年齡階段，最佳鑒齡方法也可能不一致，要對比多種鑒齡方法予以確定。對同一種甲殼類進行年齡鑒定的時候，可以采取多種年齡鑒定方法相結(jié)合，相互交叉比較，既可以比較得出此類甲殼類各年齡最適合的年齡鑒定方法，也能相互驗證不同方法，進而比較得出各年齡段最適宜的年齡鑒定方法，最終精確鑒定出年齡。

在實際的生產(chǎn)實踐中，飼養(yǎng)法得到的數(shù)據(jù)適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖或者構(gòu)建實驗室模型中，標記重捕法適合對洄游區(qū)域小的甲殼類鑒齡，體長頻度法在分析生長迅速的甲殼類時比較理想，在有校準技術(shù)保證的前提下比較適合使用脂褐素分析法對甲殼類進行鑒齡，對壽命長的甲殼類鑒齡時，放射性同位素分析法比較適宜。

硬組織生長紋分析法通過直接讀取甲殼類硬組織中的生長紋數(shù)目來鑒定其年齡，該方法的出現(xiàn)很好地解決了缺乏直接有效甲殼類鑒齡方法的問題，進而為甲殼類漁業(yè)資源評估與管理提供理論基礎(chǔ)。在今后對甲殼類年齡生長的研究中，硬組織生長紋分析法的精確性和廣泛的應(yīng)用前景使該方法成為主流的甲殼類鑒齡方法。應(yīng)當(dāng)注意的是，在使用時需要改進以下幾點：（1）選取合適的實驗材料（眼柄或者胃磨）、正確的截面，以及掌握熟練的切面研磨技術(shù)；（2）多次多人對生長紋進行讀取，各研究者之間加強相互交流；（3）利用微結(jié)構(gòu)對年齡進行進一步研究；（4）使用其他方法進行交叉驗證；（5）建立以甲殼類年齡與生長為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)庫，包括甲長、甲寬、體重的范圍、性別和性腺等級的數(shù)據(jù)參考標準，利用數(shù)據(jù)庫為甲殼類年齡鑒定提供參考。硬組織生長紋分析法雖然是最近幾年才出現(xiàn)的新方法，但相比其他方法來說相對精確，如果能夠避免該方法的缺點，該方法的發(fā)展?jié)摿Ρ容^大，能更好地對甲殼類年齡生長進行研究。

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Advance on methods for the age identification of crustaceans

JIANG Rui1，LIU Bi-lin1，2，3，4，ZHANG Jian1，2，3，4，CHEN Xin-jun1，2，3，4，NIZhen-Yu1，LIN Jing-yuan1
（1.College of Marine Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China；2.National Distant-water Fisheries Engineering Research Center，ShanghaiOcean University，Shanghai 201306，China；3.The Key Laboratory of Sustainable Exploitation of Oceanic Fisheries Resources，Ministry of Education，ShanghaiOcean University，Shanghai 201306，China；4.Collaborative Innovation Center for Distant-water Fisheries，Shanghai 201306）

Crustaceans are widely distributed in the oceans worldwide including the polar region.Their high species diversity and large quantity make them become an important part of fishery resources.Age is the essential part of the aquatic animal life history study，as well as one of themost important parameters in the fish population dynamicsmodels and fishery resources evaluation.Mostaquatic animals’age can be identified by counting the growth bands in the hard tissue.However，crustaceans grow up through molt，leading to the original shells replaced by the new ones，which causes the periodic record of their calcified structures disappearing.Therefore，the age identification of crustaceans has never been perfectly accomplished.Main existingmethods for the crustaceans’age identification are rearing in captivity，tagging and recapture，sizefrequency analysis，lipofuscin-based ageing，radioisotope analysis and calcified structures analysis.Rearing in captivity is the most accurate and reliable method for the crustaceans’age identification.Tagging and recapturemethod ismore directand effective.Size-frequency analysismethod ismost commonly used by early scholars.In thismethod，crustaceans’body length data are firstly classified into different body length groups，and then converted into age groups by Von Bertalanffy growth equation or other equation models.For the relationship between the morphological characteristics of crustaceans and their ages can not be established，lipofuscin-based ageingmethod is applied for the age identification ofmany invertebrates.Lipofuscin is related with cells aging，which is one of themost obvious age tags in cells.Radiometric ageingmethod is applicable to determine the crustaceans’shell age and the results are also comparatively accurate.This method is generally used for long-lived species based on the long elementhalf-life，but the elementhalf-lifemeasuremeat requires special equipment so the cost for thismethod is very high.So it is less used.Calcified structures analysis is a kind ofmethod to count the growth bands that generate in the crustaceans’eye stalk or gastric when they grow.Calcified structures analysis is themost accuratemethod，and the needed hard tissue is easy to extract.The calcified structure analysis method provides a new way for the direct age identification of crustaceans，and its application prospect is extensive.Rearing in captivity method，tagging and recapture method and radiometric ageing method all are comparatively accurate.However，the data obtained from the rearing in captivity method is not applicable in the natural environment，and the radiometric ageingmethod is very expensive.So both methods have limitations in practice.The tagging and recapture method and sizefrequency analysis method which are most widely used also have their disadvantages.Compared to sizefrequency analysismethod，lipofuscin-based ageing method has obvious advantages，but the labor intensity and technical requirements are high.Calcified structures analysismethod is the age identification technology that has appeared in recent years，and the age is identified by directly counting the number of growth bands in crustaceans’hard tissue.Thismethod is a good solution to the lack of direct and effective crustaceans’age identification，and provides the theoretical basis for the assessment and management of crustacean fishery resources，but there are also some disadvantages like strong man-made subjectivity.In this paper，themethods of crustaceans’age identification are reviewed and summarized，the differentmethods are compared and analyzed to get the advantages and disadvantages，so as to provide the basis for the assessment and management of crustacean fishery resources.

crustaceans；age and growth；age determination methods

S 931

A

1004－2490（2017）04－0471－10

2016－12－21

國家自然科學(xué)基金（NFSC41306127，NSFC41276156）；上海市自然科學(xué)基金（13ZR1419700）；教育部博士點基金（20133104120001）

蔣 瑞（1994－），女，碩士研究生，主要從事漁業(yè)資源學(xué)研究。

劉必林，副教授。E-mail：bl-liu＠shou.edu.cn