陳少陽++++++岳宏林++++++劉旭

[摘要] 目的 探討紫鉚因（BTN）誘導人肺腺癌A549細胞凋亡的作用及信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）在該過程發(fā)揮的作用。 方法 常規(guī)培養(yǎng)A549細胞，給予0、25、50 μmol/L的BTN處理24 h，BTN 0 μmol/L為對照組，檢測各組細胞活力、凋亡、遷移、ROS含量及Caspase-3活性，STAT3通路（p-STAT3、STAT3）和凋亡相關蛋白（Bcl-2、Bax）含量變化。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）5 mmol/L特異性抑制活性氧（ROS）生成后，BTN（0、50 μmol/L）處理細胞24 h，重復上述檢測。建立裸鼠皮下腫瘤模型，腹腔注射BTN（2、4 mg/kg），對照組注射等體積PBS，明確BTN抗肺腺癌的作用。 結(jié)果 與對照組相比，BTN（25、50 μmol/L）有效抑制A549細胞活力和遷移（P < 0.05），促進凋亡（P < 0.05），顯著增加ROS含量及Caspase-3活性（P < 0.05）。Western blot結(jié)果顯示，相比對照組，BTN處理抑制p-STAT3和Bcl-2表達（P < 0.05），上調(diào)凋亡蛋白Bax表達（P < 0.05）。相比BTN組，應用NAC后則抑制BTN促ROS生成（P < 0.05），同時拮抗了BTN抑制STAT3磷酸化和促凋亡作用（P < 0.05）。在體研究發(fā)現(xiàn)，相比對照組，BTN處理劑量依賴地抑制腫瘤生長，抑制STAT3磷酸化（P < 0.05）。結(jié)論 BTN可有效抑制肺腺癌A549細胞活力、促進細胞凋亡，此作用可能與促ROS生成進而抑制STAT3磷酸化有關。

[關鍵詞] 紫鉚因；肺腺癌；信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3；活性氧；凋亡

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（c）-0029-05

[Abstract] Objective To investigate the pro-apoptotic effect of Butein （BTN） in lung adenocarcinoma A549 cells and the role of STAT3 signaling in this process. Methods A549 cells were cultured and treated with different concentrations of BTN （0， 25， 50 μmol/L） for 24 h. BTN 0 μmol/L was taken as the control group. The survival rate， apoptotic rate， cell migration， ROS generation， Caspase-3 activity were respectively detected after treatment. Western blot was used to detect expression of p-STAT3， STAT3， Bcl-2 and Bax. NAC 5 mmol/L was used to block the generation of ROS， then BTN treatment （0， 50 μmol/L） was implemented for further detection as mentioned. Besides， in vivo studies were also used to verify whether abdominal injection with BTN （2， 4 mg/kg） exerted anticancer activity， while the control group was injected with PBS. Results Compared with the control group， BTN （25， 50 μmol/L） treatment resulted in reduction of cell viability and migration （P < 0.05）， promotion of cell apoptosis （P < 0.05）， up-regulation of ROS and Caspase-3 levels （P < 0.05）. BTN treatment resulted in a significant down-regulation of p-STAT3 and Bcl-2， and up-regulation of Bax （P < 0.05）. Moreover， inhibition of ROS by NAC antagonized the anti-STAT3 phosphorylated and pro-apoptotic role of BTN on A549 cells （P < 0.05）. In vivo studies showed that compared the control group， tumor volume and p-STAT3 expression in nude mice were significantly reduced after BTN treatment （P < 0.05）. Conclusion BTN treatment effectively inhibits cell viability and promotes apoptosis in A549 cells， which may be related to the up-regulation of ROS level thus inhibiting STAT3 phosphorylation.

[Key words] Butein； Lung adenocarcinoma； STAT3； ROS； Apoptosis

紫鉚因（Butein，BTN）大量存在于漆樹等植物中[1]，具有顯著的抗腫瘤作用[1-5]。信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）在多種腫瘤中呈現(xiàn)持續(xù)的激活（磷酸化）狀態(tài)[6-7]，上調(diào)活性氧（ROS）含量則抑制STAT3激活進而促進腫瘤細胞凋亡[2，8-9]。關于BTN在肺腺癌中的作用尚未明確，本研究通過BTN作用于肺腺癌A549細胞系，觀察細胞活力、凋亡率、遷移能力及STAT3通路的變化，結(jié)合裸鼠種植瘤模型研究STAT3通路在BTN誘導A549細胞凋亡過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料

A549細胞系購自中科院上海細胞研究所。紫鉚因，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC），二甲基亞砜（DMSO），噻唑藍（MTT），2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA），DAPI購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Bcl-2，Bax和β-actin抗體購自美國Abcam公司；STAT3，p-STAT3（Tyr705）購自美國CST公司；二抗購自北京中杉金橋生物技術公司；TUNEL檢測試劑盒購自德國Roche公司；ROS檢測試劑盒及Caspase-GloR3/7定量試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 BTN及NAC母液配制

BTN先以DMSO溶解為100 mmol/L母液，濾菌后4℃保存?zhèn)溆谩AC以去離子水稀釋為500 mmol/L母液，分裝濾菌后-20℃保存?zhèn)溆谩TN濃度和處理時間參考其他腫瘤中BTN相關研究及前期預實驗結(jié)果，BTN 50 μmol/L處理24 h對A549細胞具有顯著的殺傷作用[4]。

1.3 細胞培養(yǎng)

A549細胞用含10%胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2濕化孵箱中。細胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)實驗需要把細胞接種于不同的培養(yǎng)板中。細胞學實驗為兩部分，用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基將BTN和NAC稀釋到目的濃度后，第一部分分組為對照組（0.1% DMSO）及25、50 μmol/L BTN分別處理的實驗組；第二部分分組為對照組（0.1% DMSO），NAC 5 mmol/L，BTN 50 μmol/L以及NAC 5 mmol/L+BTN 50 μmol/L共處理的實驗組，無血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后分別進行下述實驗檢測。

1.4 MTT法檢測細胞活力

每孔7×103個細胞接種于96孔板，設6個復孔，經(jīng)處理后洗滌3次。加入MTT試劑，37℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO原液，振蕩使結(jié)晶完全溶解，酶標儀測定吸光度值（490 nm）。細胞活力=各實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡率

制作細胞爬片，于4℃用4%的多聚甲醛固定10 min。PBS洗滌3次，0.1%的Triton X-100打孔10 min，PBS洗滌1次。嚴格按照TUNEL法試劑盒的說明進行操作。在共聚焦顯微鏡下觀察，其中凋亡細胞TUNEL染色后為綠色熒光，細胞核DAPI染色后為藍色熒光，隨意選取10個視野計數(shù)，計算凋亡率=視野內(nèi)凋亡細胞數(shù)/視野內(nèi)總細胞數(shù)×100%。

1.6 劃痕實驗

細胞接種到6孔板，貼壁后在板底部劃三條橫線，用200 μL槍頭在每孔中劃一條縱線，PBS洗后于培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后測量劃痕寬度。

1.7 Caspase-3活性測定

以每孔4×106個細胞接種于6孔板，細胞處理結(jié)束后，收集并裂解提取細胞蛋白。之后每孔加入100 μL Caspase-GloR3/7工作液，室溫下避光孵育1 h，酶標儀檢測熒光強度（波長405 nm）。Caspase-3活性=各實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.8 ROS含量測定

根據(jù)實驗分組處理后將細胞消化并懸浮于稀釋的DCFH-DA中，CO2培養(yǎng)箱孵育細胞2 h，用酶標儀檢測其熒光強度（激發(fā)光波長設為485 nm，發(fā)射光波長設為530 nm）。ROS含量=各實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.9 裸鼠皮下腫瘤接種及測量

裸鼠購自斯萊克景達實驗動物有限公司（動物質(zhì)量合格證號No.43004700032628）。將裸鼠按體重編號，按隨機區(qū)組法分為對照組、2 mg/kg BTN組、4 mg/kg BTN組，每組6只。取對數(shù)期A549細胞，裸鼠肩部皮下注射接種9×106個細胞。接種后飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。每天分別給予腹腔注射PBS、2 mg/kg BTN、4 mg/kg BTN處理，每隔3天測量裸鼠體重和腫瘤體積。第28天處死小鼠并取皮下腫瘤，通過Western blot檢測瘤體p-STAT3水平。

1.10 Western blot檢測

細胞或瘤體勻漿在裂解緩沖液中裂解，以12 000 r/min離心15 min。收集上清液，蛋白定量，高溫變性后，蛋白行SDS-聚丙烯凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜。洗膜后二抗孵育2 h，洗滌3次，電化學發(fā)光試劑顯影，并用軟件分析蛋白的相對表達量（Bio-Rad，West Berkeley，California，USA）。結(jié)果以各組目的條帶灰度值與內(nèi)參作比后，再以對照組為100%進行標準化。

1.11 統(tǒng)計學方法

以SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞活性檢測結(jié)果

不同濃度BTN處理A549細胞24 h后，可見BTN使細胞變圓、收縮甚至脫落。相對于對照組，不同濃度BTN處理后細胞活力分別下降到（72.4±5.6）%、（54.2±7.1）%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 細胞凋亡率檢測結(jié)果

與對照組相比，不同濃度BTN（24 h）可以有效誘導細胞凋亡[對照組：（2.1±2.44）%，BTN 25 μmol/L：（25.4±6.10）%，BTN 50 μmol/L：（50.3±6.40）%]，且呈濃度依賴性（P < 0.05）。見圖2。

2.3 細胞遷移能力的影響

梯度濃度處理A549細胞24 h，細胞間距分別擴大到對照組的（1.46±0.13）、（1.85±0.23）倍，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖3。

2.4 ROS含量及Caspase-3活性測定結(jié)果

與對照組相比，不同濃度BTN可以使A549細胞ROS含量增加[（185.6±21.8）%、（289.2±26.5）%]，Caspase-3活性升高[（194.3±24.1）%、（295.6±25.1）%]，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖4。

2.5 Western blot檢測結(jié)果

不同濃度BTN處理A549細胞24 h后，Western blot檢測STAT3和凋亡相關蛋白表達的變化結(jié)果顯示，與對照組比較，BTN處理組細胞Bax表達上升，p-STAT3和Bcl-2的表達下降，且BTN濃度越高變化越明顯（P < 0.05）；但STAT3表達無明顯改變（P > 0.05）。見圖5。

2.6 應用NAC抑制A549細胞ROS生成后各項檢測結(jié)果

2.6.1 細胞活力及ROS含量測定結(jié)果 不同組（對照組、NAC 5 mmol/L、BTN 50 μmol/L、NAC 5 mmol/L+BTN 50 μmol/L）處理A549細胞24 h后，與對照組相比，NAC 5 mmol/L組處理對ROS含量和細胞活力無影響（P > 0.05）；與BTN 50 μmol/L組相比，BTN 50 μmol/L+NAC 5 mmol/L組ROS含量顯著降低，細胞活力顯著提高（P < 0.05）。表明NAC有效抑制ROS生成后，BTN抑制細胞活力的能力顯著降低。見圖6。

2.6.2 Western blot檢測結(jié)果 與對照組相比，NAC 5 mmol/L組p-STAT3表達明顯減少（P < 0.05），STAT3、Bax和Bcl-2表達無明顯變化（P > 0.05）。與BTN 50 μmol/L組相比，BTN 50 μmol/L+NAC 5 mmol/L組Bax表達明顯減少，p-STAT3、Bcl-2表達顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），而STAT3表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。表明抑制ROS生成能夠拮抗BTN抑制STAT3磷酸化和促凋亡作用。見圖7。

2.7 腹腔注射BTN對裸鼠在體腫瘤及Western blot檢測瘤體p-STAT3含量影響

同批次裸鼠肩部皮下注射對數(shù)期A549細胞9×106個/只，待瘤體體積達到100 mm3時開始每日腹腔注射PBS、2 mg/kg BTN、4 mg/kg BTN，每3天測量記錄體重和腫瘤體積，發(fā)現(xiàn)BTN處理對裸鼠體重無影響（P > 0.05），但劑量依賴地抑制腫瘤生長（P < 0.05），28 d時，三組腫瘤體積分別為（861±63）、（495±53）、（362±49）mm3，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖8。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，BTN處理組瘤體p-STAT3表達明顯下調(diào)，呈濃度依賴性（P < 0.05），但對STAT3表達無明顯變化（P > 0.05）。見圖9。

3 討論

肺腺癌的治療手段主要是手術和放化療，但是其遠期效果并不理想[10-14]，探索新型抗腫瘤藥物如紫鉚因等成為臨床和基礎研究熱點[15]。BTN有顯著抗腫瘤作用[1-5]，其機制與抑制腫瘤細胞周期、促進凋亡、抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、誘導氧化應激反應等有關[1，3-5，16]。本研究證實BTN具有顯著的抗肺癌作用，有效抑制A549細胞的活力和遷移能力，促進細胞凋亡，提高Caspase-3活性和ROS含量，并提示BTN誘導的A549細胞凋亡與激活氧化應激損傷有關。

STAT3在多腫瘤中呈現(xiàn)持續(xù)的激活（磷酸化）狀態(tài)[6-7]，STAT3持續(xù)激活可導致細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，并且與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移關系密切[17-20]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，BTN作用于A549細胞可顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)p-STAT3和Bcl-2的表達。上述結(jié)果說明BTN可抑制STAT3激活發(fā)揮抗肺腺癌作用，此結(jié)果同樣在A549細胞裸鼠種植瘤模型中的到驗證。

過往研究表明，上調(diào)ROS含量抑制STAT3激活進而促進腫瘤細胞凋亡[2，8-9，17]。本項研究應用NAC抑制A549細胞ROS生成后，可顯著拮抗BTN抑制A549細胞STAT3磷酸化和促凋亡作用。本研究首次證實BTN抑制A549細胞STAT3激活與上調(diào)ROS生成有關，進一步拓展了BTN作為新型抗肺癌天然藥物的作用機制。然而，BTN上調(diào)ROS含量后如何抑制STAT3磷酸化的具體作用機制尚未完全明確，以及BTN是否有潛在的毒副作用仍需深入研究。

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