陳果，陳勛基，李建平，郝曉燕，常曉春，足木熱木，鄭軍，黃全生

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

玉米ZmCIPK23基因Mutator插入突變體的鑒定

陳果1，陳勛基1，李建平1，郝曉燕1，常曉春1，足木熱木1，鄭軍2，黃全生1

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

【目的】玉米ZmCIPK23基因的候選突變體連續(xù)與玉米自交系B73回交并自交，最終得到以B73為背景的純合突變體，為研究該基因的功能奠定材料基礎(chǔ)?！痉椒ā繌挠衩譓utator(Mu)突變體庫中定向篩選到玉米ZmCIPK23基因的候選突變體。在田間種植候選突變體，利用巢式PCR對這些后代植株進行鑒定，選擇陽性植株與B73雜交。通過連續(xù)的回交及自交，最終獲得該基因的純合突變體?！窘Y(jié)果】通過PCR鑒定，獲得了以B73為背景的ZmCIPK23基因純合的突變體zmcipk23。【結(jié)論】獲得了玉米ZmCIPK23基因的Mu插入的純合突變體zmcipk23，為研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

玉米；Mutator轉(zhuǎn)座子；ZmCIPK23；突變體

0 引 言

【研究意義】類鈣調(diào)磷酸酶B互作蛋白激酶(CIPK)是植物所特有的一類蛋白激酶，在植物逆境如干旱﹑高鹽應(yīng)答等非生物脅迫反應(yīng)中起著重要的作用，而在重要農(nóng)作物玉米中CIPK基因的功能研究還非常少。研究從反向遺傳學(xué)角度出發(fā)，利用玉米Mutator轉(zhuǎn)座子，定向篩選ZmCIPK23基因Mu插入的突變體。通過PCR等鑒定方法，最終獲得玉米ZmCIPK23基因的純合突變體，為研究該基因在逆境脅迫下的功能奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】Mutator轉(zhuǎn)座子在玉米功能基因組學(xué)及突變體庫構(gòu)建中起著非常重要的作用，利用該轉(zhuǎn)座子構(gòu)建了許多玉米突變體庫[1]。隨著Mutator突變體庫的建立，許多方法如熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)、酶切-連接-擴增(DLA)等先后用于檢測Mu轉(zhuǎn)座子插入位點[2, 3]。 已有研究報道，利用Mutator轉(zhuǎn)座子，鑒定了5個對干旱脅迫響應(yīng)的玉米蛋白磷酸酶基因[4]。類鈣調(diào)磷酸酶B互作蛋白激酶(CIPK)是植物所特有的一類蛋白激酶，該基因家族在植物非生物逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用。在擬南芥中，CIPK23能夠磷酸化K+轉(zhuǎn)運蛋白AKT1，從而在低鉀脅迫下，植株能夠正常生長發(fā)育[5](Xu, 2006 #2440;Ragel, 2015 #2439)。在玉米中，對CIPK基因的功能報道有限。ZmCIPK16受ABA、干旱、NaCl等誘導(dǎo)表達；ZmCIPK16過表達后能部分消除擬南芥sos2突變體對鹽敏感的表型[6]。過表達的玉米ZmCIPK21能降低轉(zhuǎn)基因擬南芥中Na+的含量，增強轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性；并且該基因過表達后，能夠互補擬南芥突變體cipk1-2[7]。在玉米基因組中，分布著至少43個CIPK基因[8]， 然而其參與的調(diào)控通路，尤其在非生物脅迫逆境中的調(diào)控途徑卻知之甚少，并且在玉米功能基因組學(xué)研究中，利用Mutator轉(zhuǎn)座子研究CIPK基因的功能還未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】玉米基因組中至少有43個CIPK基因，然而迄今為止，只有極少數(shù)的基因有功能研究報道，并且還是借助模式植物擬南芥，通過異源表達的方式進行的。而直接在玉米基因組中研究其功能還未見報道。研究利用玉米Mutator轉(zhuǎn)座子以及PCR鑒定的方法，在玉米中鑒定并得到ZmCIPK23基因的純合突變體，期望為該基因的功能研究奠定基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】獲得可穩(wěn)定遺傳并純合的ZmCIPK23基因突變體，為研究該基因在逆境脅迫下的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

玉米ZmCIPK23基因Mu插入的候選突變體材料，回交受體材料為自交系B73。

1.2 方 法

1.2.1 玉米ZmCIPK23基因候選突變體材料的種植及回交

將ZmCIPK23基因候選突變體材料和自交系B73分別種植于安寧渠試驗場，每個材料種植3行，每行定苗15株。行長3 m，行距60 cm，株距20 cm。待玉米長至5～6葉，單株提取玉米葉片基因組DNA，用于PCR鑒定。鑒定完成后，保留含有Mu因子的玉米植株，并與B73回交。以此方法類推，直到與B73回交5代后，并自交2代，得到BC5F2代候選突變體材料。此時對候選突變體進行基因型鑒定，保留陽性植株，自交授粉得到BC5F3代材料，用于基因型鑒定，確定所得到BC5F3代材料為ZmCIPK23基因純合突變體材料。

1.2.2 玉米葉片基因組DNA提取

玉米葉片DNA提取采用CTAB法。2%CTAB提取液的配制：4 g CTAB、16.4 g NaCl、8 mL 0.5 M EDTA(pH=8.0)、20 mLTris.HCL(pH=8.0)溶于150 mL蒸餾水中，定容至200 mL。所提取的DNA稀釋至大約50 μg/uL，用于PCR鑒定。

1.2.3 引物設(shè)計

Mu-TIR引物根據(jù)Mutator末端反向重復(fù)序列設(shè)計Mu-TIR-AGA GAA GCC AAC GCC A(AT)C GCC TC(CT) ATT TCG TC[3]。ZmCIPK23基因的特異引物采用primer3.0在線軟件設(shè)計(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。在ZmCIPK23基因5’端設(shè)計引物ZmCIPK23-GS5’-ACCCTGCGACAAGAAGAGGT，在ZmCIPK23基因3’端設(shè)計特異引物ZmCIPK23-GS3’-GACGAGCTCCATGACGATGTA和巢式引物ZmCIPK23-GS3N-GGTCGAGATCTCTCGCTTGAT。圖1

1.2.4ZmCIPK23基因候選突變體材料的PCR鑒定及Mu插入位點的確定

以ZmCIPK23基因候選突變體材料的基因組DNA為模板，用Mu-TIR作為上游引物，基因特異性引物ZmCIPK23-GS3’和巢式引物ZmCIPK23-GS3N分別作為下游引物，PCR擴增含有Mu序列的目的基因片段。PCR反應(yīng)程序為94℃ 3 min；94℃ 30 S，58℃ 30 S，72℃ 45 S，循環(huán)35次；72℃延伸7 min。電泳檢測PCR產(chǎn)物，若能擴增出預(yù)期大小的目的條帶，且巢式PCR的條帶差異也為預(yù)期值，可判斷為Mu插入的陽性植株。

用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)回收ZmCIPK23基因片段，將回收片段連接到pGWC-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。選取陽性單克隆菌落送北京華大基因公司測序，測序結(jié)果用DNAMAN軟件分析，與該基因的基因組序列比對，確定Mu插入到該基因的具體位置?；蚱蔚幕厥諈⒄栈厥赵噭┖姓f明進行。

1.2.5 Mu轉(zhuǎn)座子插入ZmCIPK23基因純合突變體的鑒定

種植BC5F2代植株，每一份BC5F2材料種植15株，PCR鑒定每株Mu插入位點的基因型。以每一單株DNA為模板，用引物組合Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3'，Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3N分別擴增含有Mu序列的ZmCIPK23基因；引物組合ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3'，ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3N 分別擴增不含有Mu序列的ZmCIPK23基因。根據(jù)PCR擴增結(jié)果，鑒定每一株Mu插入位點的基因型。如果Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3'，Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3N擴增出含有Mu序列的ZmCIPK23基因，而ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3'，ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3N不能擴增出不含有Mu序列的ZmCIPK23基因，則該單株為Mu插入的純合體。對鑒定為純合體的植株自交，得到BC5F3代種子。進一步，對BC5F3代的同一插入株系，隨機選取10粒種子種于溫室內(nèi)，單株提取DNA，采用以上引物組合進行PCR鑒定，若PCR鑒定其全部為Mu插入純合體，則可以確定已獲得可遺傳的純合Mu插入純合突變體。PCR反應(yīng)程序為94℃ 3 min；94℃ 30 S，58℃ 30 S，72℃ 45 S，循環(huán)35次；72℃延伸7 min。以自交系B73基因組DNA為模板作為正對照，H2O為模板作為負對照。

2 結(jié)果與分析

2.1ZmCIPK23基因可遺傳的Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體的鑒定

研究選取玉米類鈣調(diào)磷酸酶B互作蛋白激酶23即ZmCIPK23基因(Zm00001d018799)的Mu插入候選突變體BC3F1代材料。為了進一步驗證并得到可遺傳的突變體，首先利用巢式PCR，對候選突變體的子代進行檢測。

由于Mu轉(zhuǎn)座子具有約220 bp的末端反向重復(fù)序列(TIR)，所以在TIR區(qū)設(shè)計簡并引物Mu-TIR。在ZmCIPK23基因5’端設(shè)計引物ZmCIPK23-GS5’，在ZmCIPK23基因3’端設(shè)計特異引物ZmCIPK23-GS3’和巢式引物ZmCIPK23-GS3N(材料與方法)。通過引物組合Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3'，Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3N檢測該基因內(nèi)Mu轉(zhuǎn)座子的插入(圖1，圖2)，并且這兩對引物均能擴增出目標條帶的植株，才判定為陽性突變體。利用該方法，檢測了候選突變體。根據(jù)PCR檢測結(jié)果，鑒定為陽性突變體的植株，如圖所示的(3)，(4)，(5)，(7)，(8)，(9)，(12)，用自交系B73回交得到BC4F1。種植BC4F1代植株，對其PCR檢測，仍然能夠檢測到Mu轉(zhuǎn)座子的插入。同樣的方法，對BC5F1代植株，仍能夠檢測到Mu轉(zhuǎn)座子的插入，說明該突變體為可遺傳的Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體。對鑒定為陽性的BC5F1植株自交授粉，獲得BC5F2代種子。圖2

2.2ZmCIPK23基因Mu轉(zhuǎn)座子插入位點的確定

對以上含有Mu插入的候選突變體，將其引物組合ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3'擴增的PCR產(chǎn)物連接到PGWC-T載體上并測序。測序結(jié)果用DNAMAN軟件分析，發(fā)現(xiàn)擴增片段的5’端含有Mu轉(zhuǎn)座子末端反向重復(fù)序列。擴增的序列再與ZmCIPK23的基因組序列比對，確定出其中該基因的序列部分，進而擴增序列中Mu轉(zhuǎn)座子序列與該基因序列結(jié)合的位點，即為Mu轉(zhuǎn)座子插入ZmCIPK23基因的具體序列位點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mu轉(zhuǎn)座子插入到ZmCIPK23基因的位點位于第1個內(nèi)含子區(qū)。

注：Mu-TIR：Mutator 轉(zhuǎn)座子末端反向重復(fù)序列

Note: Mu-TIR: Mutator Transposon Terminal Inverted Repeat

圖1 引物設(shè)計

Fig.1 The primer designed

注：用引物組合Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3'，Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3N鑒定Mu轉(zhuǎn)座子的插入；M：D2000 plus DNA Maker；(1)～(12)：待鑒定候選突變體；3:引物對Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3'的擴增產(chǎn)物；3N：引物對Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3N的擴增產(chǎn)物

Note: The primers Mu-TIR and ZmCIPK23-GS3', Mu-TIR and ZmCIPK23-GS3N were used to identify the Mu insertion plant of ZmCIPK23; M: D2000 plus DNA Maker; (1)-(12): Candidate mutants to be identified; 3: The PCR products of the primers Mu-TIR and ZmCIPK23-GS3'; 3N: The PCR products of the primers Mu-TIR and ZmCIPK23-GS3N

圖2 Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體的鑒定

Fig.2 Identification of the Mu insertion plant ofZmCIPK23

2.3ZmCIPK23基因Mu轉(zhuǎn)座子插入純合突變體的鑒定

為了鑒定突變體在非生物逆境脅迫下的表型，通常需要得到純合突變體；根據(jù)孟德爾遺傳定律，一般在F2代就能分離出純合的突變體。因此，研究在獲得了候選突變體BC5F2代種子的基礎(chǔ)上，對BC5F2代的每個單株進行了基因型的檢測。檢測方法為通過引物組合Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3'，Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3N和引物組合ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3'，ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3N 分別擴增每一個單株材料。如果引物Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3'，Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3N擴增出含有Mu序列的ZmCIPK23基因，而引物ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3'，ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3N不能擴增出不含有Mu序列的ZmCIPK23基因，則該單株為所需要的Mu插入純合體(圖3)。對鑒定為純合體的植株自交授粉，獲得BC5F3代種子。為了確認得到的純合突變體，對獲得的BC5F3代純合突變體種子，隨機選取了10粒種子，種在培養(yǎng)室，提取DNA，用上述方法，鑒定其基因型。這10粒種子全部為純合的基因型。由此可以證明上述方法的準確性以及獲得了ZmCIPK23基因Mu插入的純合突變體。圖3

注：M：D2000 DNA maker；(1)～(10)：BC5F3代10個不同的單株；(11)：自交系B73為模板，正對照；(12)：水為模板，負對照；A：3：引物對Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3'的擴增產(chǎn)物；3N：引物對Mu-TIR與ZmCIPK23-GS3N的擴增產(chǎn)物；B：3：引物對ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3'的擴增產(chǎn)物；3N：引物對ZmCIPK23-GS5’與ZmCIPK23-GS3N的擴增產(chǎn)物

Note: M: D2000 DNA maker; (1)-(10): Individual BC5F3generation plants; (11): Inbred line B73, positive control; (12): Water, negative control; A:3:The PCR products of the primers Mu-TIR and ZmCIPK23-GS3';3N: The PCR products of the primers Mu-TIR and ZmCIPK23-GS3N; B:3: The PCR products of the primers ZmCIPK23-GS5' and ZmCIPK23-GS3'; 3N: The PCR products of the primers ZmCIPK23-GS5' and ZmCIPK23-GS3N

圖3 BC5F3代Mu轉(zhuǎn)座子插入純合突變體的鑒定

Fig.3 Identification of the BC5F3homozygous mutant of the Mu insertion

3 討 論

類鈣調(diào)磷酸酶B互作蛋白激酶(CIPK)是植物所特有的一類蛋白激酶，在諸如鹽，低鉀，ABA，干旱，低溫等脅迫下發(fā)揮功能[9](Zhu, 2002 #13;Liu, 2000 #2436)。在玉米中，至少有43個CIPK基因，然而對其功能的研究報道卻很少。已有研究發(fā)現(xiàn)，ZmCIPK16過表達后能部分消除擬南芥sos2突變體對鹽敏感的表型；而過表達的玉米ZmCIPK21能降低增強轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性[6]。玉米中存在大量的CIPK基因，而對其參與的調(diào)控路徑，行使的功能卻知之甚少，尤其在非生物逆境脅迫響應(yīng)中的作用研究的就更少了。在擬南芥中，與玉米ZmCIPK23同源的基因CIPK23響應(yīng)低鉀脅迫，使植物能夠吸收更多的K+，從而使得植物能夠正常發(fā)育[10]。研究鑒定了玉米ZmCIPK23基因的Mutator插入純合突變體，期望能為分析該基因在非生物逆境脅迫下，尤其在玉米響應(yīng)低鉀脅迫信號途徑中的作用奠定基礎(chǔ)。

Mu轉(zhuǎn)座子它能夠插入到基因的任何區(qū)域，包括啟動子、內(nèi)含子、外顯子等區(qū)域[11]，引起基因的表達、蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終影響其功能。研究通過測序發(fā)現(xiàn)，Mu轉(zhuǎn)座子插入到ZmCIPK23基因的第1個內(nèi)含子區(qū)。Mu轉(zhuǎn)座子插入到內(nèi)含子，可能使得該基因的剪切發(fā)生改變，進而改變ZmCIPK23蛋白的正常生理生化結(jié)構(gòu)，最終使得該基因不能正常行使功能。

Mu轉(zhuǎn)座子作為一種標簽，在其兩端含有保守的末端反向重復(fù)序列(TIRs)，因此可以設(shè)計引物Mu-TIR，與引物ZmCIPK23-GS5’、ZmCIPK23-GS3'、ZmCIPK23-GS3N組合，可以通過簡單易行的PCR方法鑒定候選突變體是否含有Mu因子以及是否純合。通過鑒定，陽性植株與B73回交，連續(xù)回交至5代。并且在BC3F1，BC4F1，BC5F1代植株中鑒定到候選材料均含有Mu因子，證實所得到的材料為可遺傳的突變體。根據(jù)孟德爾遺傳定律，在BC5F2代植株中，鑒定了突變體的基因型，篩選出純合的突變體。對于純合的突變體，自交得到BC5F3。為了確保所得到的材料為純合突變體，再一次對自交得到的BC5F3代突變體材料進行基因型鑒定。隨機挑選了其中一個穗子的10粒種子進行了基因型鑒定。結(jié)果顯示其全部為純合突變體，所得到的材料為純合的候選突變體，同時也說明了這種PCR鑒定基因型的方法準確。因此，研究獲得了ZmCIPK23基因Mu插入的純合突變體，為研究該基因在玉米非生物逆境脅迫響應(yīng)中的功能奠定了材料基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

研究通過PCR鑒定，獲得了玉米ZmCIPK23基因Mu插入的純合候選突變體。通過測序發(fā)現(xiàn)，Mu轉(zhuǎn)座子插入到ZmCIPK23基因的位點位于第1個內(nèi)含子區(qū)，可能引物該基因的剪切發(fā)生改變，從而導(dǎo)致ZmCIPK23蛋白的正常生理生化結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。研究獲得了ZmCIPK23基因Mu插入的純合突變體，為深入研究該基因在玉米逆境脅迫響應(yīng)中的功能奠定了基礎(chǔ)。

致 謝

感謝美國愛荷華州立大學(xué)(Iowa State University)Patrick Schnable教授為本研究提供候選突變體材料。

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Identification of the Mutator Insertional Mutants inZmCIPK23

CHEN Guo1, CHEN Xun-ji1, LI Jian-ping1, HAO Xiao-yan1, CHANG Xiao-chun1, Zumuremu1, ZHENG Jun2, HUANG Quan-sheng1

(1.Research Institute of Nuclear & Biotechnology, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091, China; 2.Institute of Crop Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081, China)

【Objective】 The candidate mutants of maizeZmCIPK23 gene were continuously backcrossed and self-pollinated with B73 in fields, and finally homozygous mutants with B73 background were obtained, which laid the material foundation for studying the function of this gene.【Method】The candidate mutants ofZmCIPK23 were screened from a maize Mutant library. They were planted and analyzed by nested PCR. The positive plants with Mu-insertion in theZmCIPK23 gene were self-pollinated and backcrossed with B73 in the field. Thus the homozygous mutants were obtained.【Result】The homozygous mutant ofZmCIPK23 gene was obtained by PCR.【Conclusion】The homozygous mutant (zmcipk23) of Mu insertion ofZmCIPK23 gene was obtained. This study has provided a foundation for the functional analysis of theZmCIPK23 gene.

maize (ZeaMaysL.); mutator transposon;ZmCIPK23; mutant

HUANG Quan-sheng(1964-)，male, native place: Urumqi, Xinjiang. Professor, Doctor, research field: Plant molecular biology. (E-mail)hquansheng@126.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.07.002

2017-02-22

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金“玉米干旱脅迫相關(guān)基因Mu插入突變體的鑒定及抗旱性”(2013211B22)

陳果(1984-)，男，四川南充人，助理研究員，研究方向為玉米分子生物學(xué)，(E-mail)252931257@qq.com

黃全生(1964-)，男，新疆烏魯木齊人，研究員，博士，研究方向為植物分子生物學(xué)，(E-mail)hquansheng@126.com

S513

A

1001-4330(2017)07-1185-06

Supported by: Xinjiang Natural Science Foundation " Identification and Drought Resistance Appraise of Mutants of Drought Stress-Related Genes in Maize" (2013211B22)