席歐彥，邱玲玲，馬曉玲，秦瑞坪，趙婷，李江偉

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程省部共建重點實驗室，烏魯木齊 830046)

采用CDR3親和力轉(zhuǎn)移方法快速獲得抗FSHR抗體

席歐彥，邱玲玲，馬曉玲，秦瑞坪，趙婷，李江偉

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程省部共建重點實驗室，烏魯木齊 830046)

【目的】評價駱駝來源的納米抗體cAbBCII10作為非抗體親和力轉(zhuǎn)移骨架的潛能，采用親和力轉(zhuǎn)移的方法，將FSHR結(jié)合肽段移植到cAbBCII10的抗原結(jié)合區(qū)以快速獲得抗FSHR抗體?！痉椒ā繉SHR結(jié)合肽FSH33-53編碼序列，分別移植入納米抗體cAbBCII10的CDR1和CDR3區(qū)域中，命名為VHH-hFSH1 和VHH-hFSH3。采用DNA合成方法獲得VHH-hFSH1，VHH-hFSH3和cAbBCII10的DNA編碼序列，把這些DNA序列克隆到pET22b載體上，將其轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)過誘導(dǎo)和表達(dá)再用Ni離子親和純化獲得純的單域抗體。采取ELISA方法鑒定純化的cAbBCII10，VHH-hFSH1、VHH-hFSH3與FSHR的結(jié)合能力及特異性?！窘Y(jié)果】通過框架移植獲得的VHH-hFSH1 ，VHH-hFSH3和cAbBCII10蛋白均在細(xì)菌胞間質(zhì)可溶性表達(dá)。將FSHR結(jié)合肽FSH33-53移植到cAbBCII10的CDR3獲得的VHH-hFSH3具有特異結(jié)合FSHR活性?！窘Y(jié)論】cAbBCII10可以作為移植的框架，F(xiàn)SH和FSHR結(jié)合肽段移植到cAbBCII10的CDR1和CDR3區(qū)可以獲得親和性較高的抗FSHR抗體。

親和力轉(zhuǎn)移；FSHR；FSH33-53；cAbBCII10；納米抗體

0 引 言

【研究意義】卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)是一種跨膜糖蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族中糖蛋白亞家族成員。近期發(fā)現(xiàn)FSHR普遍表達(dá)于各種進(jìn)程的腫瘤新生血管內(nèi)皮的細(xì)胞表面。表明了FSHR是一種合適的腫瘤標(biāo)志物和抗體作用的良好靶點?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)外制備抗FSHR抗體都是多克隆抗體或是來自小鼠雜交瘤細(xì)胞的單克隆抗體，這些抗體能夠在細(xì)胞和組織中特異性識別FSHR蛋白[1-2]。但因為全分子抗體分子量過大，不利于在體內(nèi)的快速清除和對腫瘤組織的有效穿透。因此，無論是針對FSHR的診斷還是靶向治療，都需要得到更合適的抗體，或者能夠?qū)ΜF(xiàn)有抗體分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以提高敏感性得到良好的體內(nèi)代謝[3]。最早，有研究者在駱駝(Camelidae)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)除了常規(guī)抗體之外，還存在著一種自身缺失輕鏈和CH1區(qū)的重鏈抗體(heavy chain antibody，HCAb)，其可變區(qū)仍具備很好的抗原識別和結(jié)合作用[4]，重鏈抗體的可變區(qū)(variable domains of the HCAb，VHH)也被稱為納米抗體，具備分子小，生產(chǎn)成本較低，水溶能力強(qiáng)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好以及優(yōu)先識別受體和配體結(jié)合部位的特點[5-6]，使得該抗體能夠作為一種小型化的基因工程抗體而且在最初實驗研究階段和制備藥物等領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛能?！颈狙芯壳腥朦c】由于駱駝納米抗體分子小、結(jié)構(gòu)簡單，只具有3個抗原結(jié)合區(qū)的特性，使得在設(shè)計抗體模擬物和小分子抗體方面成為了理想的結(jié)構(gòu)框架。對VHH抗體的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性進(jìn)行的深入研究中還發(fā)現(xiàn)VHH的抗原結(jié)合環(huán)(loop)并不符合人和小鼠VH中的典型抗體結(jié)構(gòu)[7]。然后對VHH與其抗原結(jié)合復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)分析顯示，VHH抗體與抗原的結(jié)合大部分由CDR3環(huán)介導(dǎo)[8]。與哺乳動物VH的結(jié)構(gòu)顯著不同，但依舊保持了完全的抗原結(jié)合活性。此外，VHH結(jié)構(gòu)域的CDR3環(huán)相比于小鼠和人VH中的CDR3更長，其相對于增加了VH的抗原結(jié)合表面，并部分補(bǔ)償了輕鏈的缺乏。另外框架區(qū)尤其是FR2在抗體的穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用。結(jié)合這些研究結(jié)論，Saerens 等[9]分析了大量VHH抗體的框架區(qū)，發(fā)現(xiàn)結(jié)合β內(nèi)酰胺酶具有完整框架區(qū)可以接受駱駝VHH抗體亞家族II中的大部分抗體的三個CDR的移植，具有CDR 通用移植骨架的潛能，cAbBCII10也是迄今為止分離的最穩(wěn)定的VHH結(jié)構(gòu)域之一，其框架已經(jīng)用于許多框架移植和人源化研究[10-14]。其他研究者采用該抗體進(jìn)行親和力移植也獲得了一定的成功?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對目前而言，還沒有采用非抗體來源的親和力轉(zhuǎn)移至cAbBCII10完整框架區(qū)的報道。為了評價駱駝來源的納米抗體cAbBCII10作為非抗體親和力轉(zhuǎn)移骨架的潛能，研究主要是把FSH結(jié)構(gòu)中與其受體結(jié)合的肽段FSH33-53[15]移植到cAbBCII10的抗原結(jié)合區(qū)，為今后快速獲得抗FSHR納米抗體提供新的途徑與方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

抗c-Myc標(biāo)簽單克隆抗體(HRP)購于Cell Signaling，蛋白Maker購自TaKaRa公司，鎳柱Ni Sepharose購于GE公司，抗FSHR單克隆抗體購買于R&D公司，TES緩沖溶液(10 mM Tris，1 mM EDTA，20%葡萄糖pH 8.0)其他試劑均為化學(xué)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 親和力轉(zhuǎn)移方法構(gòu)建cAbBCII10表達(dá)載體

采用全基因合成方法獲得cAbBCII10編碼序列，通過酶切位點NcoI和XhoI 將其克隆至pET22b載體上。采用同樣方法(由上海杰瑞生物公司合成)將FSH33-53編碼DNA序列分別插入到cAbBCII10的CDR1和CDR3區(qū)域，并命名為VHHhFSH1和VHHhFSH3，通過酶切位點NcoI和XhoI將其克隆至pET22b載體上。DNA測序驗證合成和構(gòu)建是否正確。

1.2.2 重組蛋白的胞間質(zhì)表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒pET22b-cAbBCII10、pET22b-VHHhFSH1和pET22b-VHHhFSH3通過熱擊法分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取單克隆，37℃培養(yǎng)。再把1%的一活菌液接種到在500 mL含有氨芐的LB培養(yǎng)基里，220 r/min的搖床中，4 h；加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。利用高滲法破碎細(xì)胞。TES緩沖溶液冰浴處理細(xì)胞4 h，5倍稀釋TES冰浴細(xì)胞4 h，-20℃過夜。之后冰浴溶解，離心20 min取得上清就為胞間質(zhì)蛋白。采用鎳離子親和柱對cAbBCII10、VHHhFSH1、VHHhFSH3抗體進(jìn)行純化。先用20 mM咪唑緩沖液緩慢的結(jié)合2 h，20 mM咪唑洗雜，500 mM咪唑緩沖液洗脫。取得的樣品經(jīng)15%SDS-PAGE凝膠電泳的方式檢測抗體蛋白的表達(dá)以及純化抗體的純度。再用Bradford法定量獲得純化之后的蛋白具體濃度。

1.2.3 間接ELISA方法檢測胞間質(zhì)表達(dá)的VHHhFSH1和VHHhFSH3與FSHR的結(jié)合活性和特異性

將濃度為8 μg/mL的抗原FSHR包被在96孔ELISA板中，4℃過夜。純化的抗體cAbBCII10、VHHhFSH1、VHHhFSH3 以及FSHR抗體(R&D公司)作為一抗，濃度固定在10 μg/mL；抗FSHR蛋白使用的二抗為C-myc-HRP鼠單克隆抗體(CUSABIO公司)，稀釋比例為1∶3 000；DAB進(jìn)行顯色。檢測合成抗體VHHhFSH1和VHHhFSH3對抗原FSHR的特異性。陰性對照BSA，陽性對照為商業(yè)化的抗FSHR單克隆抗體(由公司購買)。

1.2.4 非競爭ELISA檢測VHHhFSH1和VHHhFSH3對FSHR的結(jié)合親和力

選擇結(jié)合特異性顯著的VHHhFSH1、VHHhFSH3抗體，使用ELISA的方法驗證其對抗原FSHR的親和力?？乖璅SHR包被濃度為8 μg/mL，抗FSHR蛋白的一抗為VHHhFSH1、VHHhFSH3抗體的依次稀釋濃度為5、10、20、30、40、50、60、70和80 μg/mL；二抗為抗c-Myc標(biāo)簽HRP鼠單克隆抗體(Cell Signaling)，稀釋比例(1∶3 000)；DAB顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 VHHhFSH1、VHHhFSH3和cAbBCII10載體的構(gòu)建

實驗通過將人的FSH與受體結(jié)合的肽段FSH33-53分別移植到cAbBCII10的CDR1和CDR3區(qū)，命名為VHHhFSH1和VHHhFSH3(由上海杰瑞生物公司合成)。以制備能與FSHR特異性結(jié)合的抗體。移植氨基酸序列。利用基因合成方法獲得移植片段的DNA序列。將合成的DNA序列通過酶切位點NcoI和XhoI構(gòu)建到pET22b載體上，得到重組質(zhì)粒pET22b-cAbBCII10、pET22b-VHHhFSH1和pET22b-VHHhFSH3。表1

表1 框架移植的氨基酸序列

注：a.表中斜體加粗氨基酸序列為移植到cAbBCII10的CDR1的FSH33-53編碼序列；b.表中斜體加粗氨基酸序列為移植到cAbBCII10的CDR3的FSH33-53編碼序列

Note: a. The italicized amino acid sequence in the table is the FSH33-53 coding sequence of CDR1 grafted to cAbBCII10; b. The bolded amino acid sequence in the table is the FSH33-53 coding sequence of CDR3 grafted to cAbBII10

構(gòu)建好的重組質(zhì)粒經(jīng)過DNA測序及抗體序列分析表明，VHHhFSH1和VHHhFSH3序列均分別正確移植到cAbBCII10的CDR1和CDR3區(qū)域。圖1

注：圖中斜體部分為移植的FSH33-53的氨基酸序列

Note:

圖1 cAbBCII10、VHHhFSH1和VHHhFSH3的氨基酸序列比對結(jié)果

Fig.1 Comparison of amino acid sequences of cAbBCII10, VHHhFSH1 and VHHhFSH3

2.2 重組抗體在大腸桿菌中的表達(dá)與純化

質(zhì)粒pET22b-cAbBCII10、pET22b-VHHhFSH1和pET22b-VHHhFSH3轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過高滲低滲的方法，獲得的蛋白均以胞間質(zhì)的形式進(jìn)行表達(dá)。純化后的蛋白分子量大小在20kDa左右。 圖2

M：蛋白marker；1：未誘導(dǎo)菌液；2：IPTG誘導(dǎo)菌液；3：包涵體表達(dá)蛋白；4：胞間質(zhì)表達(dá)蛋白

M:protein marker；1:uninduced bacterial lysate; 2:IPTG induced bacterial lysate; 3:precipitation of induced bacterial lysate; 4:supernatant protein of induced bacterial lysate

圖2 cAbBCII10、VHHhFSH1、VHHhFSH3重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

Fig.2 Expression of the recombinant protein cAbBCII10, VHHhFSH1and VHHhFSH3

采取鎳離子親和層析，純化帶有His標(biāo)簽的cAbBCII10、VHHhFSH1、VHHhFSH3重組蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，可以看到單一且清晰的條帶，因此可以知道得到的納米抗體純度在90%以上。再利用Bradford法檢測純化各組分蛋白的濃度分別為cAbBCII10(200 g/mL)、VHHhFSH1(140 μg/mL)、VHHhFSH3(100 μg/mL)。圖3

2.3 VHHhFSH1和VHHhFSH3與FSHR的結(jié)合特性

將純化的重組蛋白VHHhFSH1、VHHhFSH3與抗原FSHR通過ELISA測定其親和力?？乖璅SHR蛋白包被濃度均為8 μg/mL每孔；重組抗體蛋白VHHhFSH1、VHHhFSH3為10 μg/mL。結(jié)果表明，與陰性對照BSA對比，VHHhFSH1、VHHhFSH3的特異性均有顯著性差異(**P<0.05)。圖4

隨后選擇特異性顯著的VHHhFSH1、VHHhFSH3 抗體，利用ELISA的方法檢測其對抗原FSHR的親和力。將抗原FSHR包被的濃度均設(shè)為8 μg/mL，隨著抗體濃度的提高，結(jié)合能力提高，最終在20 μg/mL時其結(jié)合飽和并趨于平衡。 VHHhFSH1、VHHhFSH3 抗體在濃度為20 μg/mL的時候，結(jié)合能力最好，隨著抗體濃度的提高，結(jié)合能力達(dá)到飽和，最終在40 μg/mL時結(jié)合飽和并趨于平衡。圖5

M：蛋白Marker(116 kD ，66.2 kD ，45.0 kD ，35.0 kD，25.0 kD，18.4 kD，14.4 kD)；1：未誘導(dǎo)菌液；2：IPTG誘導(dǎo)菌液；3：包涵體表達(dá)蛋白；4：胞間質(zhì)表達(dá)蛋白

M:protein marker(116 kD ,66.2 kD,45.0 kD,35.0 kD,25.0 kD,18.4 kD,14.4 kD); 1:uninduced bacterial lysate; 2:IPTG induced bacterial lysate; 3:precipitation of induced bacterial lysate; 4:supernatant protein of induced bacterial lysate

圖3 重組蛋白cAbBCII10、VHHhFSH1、VHHhFSH3的純化SDS-PAGE凝膠電泳圖

Fig.3 Purification of recombinant proteins cAbBCII10, VHHhFSH1, VHHhFSH3 SDS-PAGE gel electrophoresis

圖4 ELISA檢測cAbBCII10、VHHhFSH1、VHHhFSH3與FSHR的特異性

圖5 ELISA檢測重組抗體VHHhFSH1和VHHhFSH3對抗原FSHR的親和力

3 討 論

cAbCⅡ10的晶體結(jié)構(gòu)作為可移植的框架結(jié)構(gòu)已經(jīng)被報道[14]，將肽的序列移植到CDR1區(qū)或者CDR3區(qū)可能會導(dǎo)致cAbCⅡ10框架的細(xì)微的結(jié)構(gòu)變化，而移植到CDR2則會導(dǎo)致駱駝體內(nèi)典型的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)解體。因此在cAbBCII10的晶體結(jié)構(gòu)中CDR1和CDR3的移植具有合適的穩(wěn)定框架。實驗中移植CDR3的抗體要比移植CDR1的抗體的結(jié)合能力強(qiáng)。這表明CDR3相比其他CDR區(qū)，CDR3長度更長，可識別的區(qū)域更大。也可能原因是移植的肽段在cAbBCII10的CDR3區(qū)更有利于與其它FR區(qū)形成結(jié)合FSHR的空間結(jié)構(gòu)可能形成線性互補(bǔ)位。

對于選擇FSH33-53肽段進(jìn)行移植具有以下優(yōu)點：肽的氨基酸序列短，10～30個氨基酸序列；氨基酸的序列≥50%為親水殘基序列(Leu，Val，Ile，Phe，Trp)；可以直接識別跨膜的受體的表面，利用結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可以直接對胞外環(huán)或者胞外區(qū)進(jìn)行定位，獲得抗原的表位圖譜[16-19]。據(jù)文獻(xiàn)報道，駱駝抗體cAbBCII10 VHH的可變片段可以作為結(jié)合肽的移植的新框架材料，研究也成功利用這個框架制備得到了抗FSHR的抗體。這說明cAbBCII10VHH片段是單結(jié)構(gòu)域可以對各種CDR區(qū)耐受，而且CDR1和CDR3結(jié)構(gòu)可以充分暴露在空間結(jié)構(gòu)表面[20]。

4 結(jié) 論

研究主要是把FSHR結(jié)合肽FSH33-53編碼序列，分別移植入納米抗體cAbBCII10的CDR1和CDR3區(qū)域中，并在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)過誘導(dǎo)和表達(dá)得到了可溶性的納米抗體VHHhFSH1、VHHhFSH3蛋白。通過驗證納米抗體與抗原FSHR的結(jié)合特異性，結(jié)果顯示在抗體濃度為10 μg/mL時，兩個納米抗體均可以與抗原結(jié)合。又進(jìn)一步驗證兩個納米抗體與抗原FSHR結(jié)合的親和力，在抗體濃度為20 μg/mL時結(jié)合能力最好，其中VHHhFSH3的親和力更強(qiáng)，表明VHH-hFSH3具有特異結(jié)合FSHR活性。在今后的研究中，我們將進(jìn)一步優(yōu)化FSH33-53的密碼子，以提高抗FSHR抗體與FSHR結(jié)合能力，對今后的設(shè)計有效的抗體片段具有一定的指導(dǎo)意義。

References)

[1] Wu, J., Wang, Y., Xiao, W., Meyer, K. B., Schmidt, K. M., & Morris, R. E., et al. (2004). Assessment of recombinant porcine follicle-stimulating hormone receptor using a novel polyclonal ectodomain antibody.EndocrineResearch, 30(2): 269-285.

[2] Vannier, B., Loosfelt, H., Meduri, G., Pichon, C., & Milgrom, E. (1996). Anti-human fsh receptor monoclonal antibodies: immunochemical and immunocytochemical characterization of the receptor.Biochemistry, 35(5): 1,358-1,366.

[3] 夏雪琴, 木亞沙爾·買買提拉洪, 翟田甜,等. 抗卵泡刺激素受體納米抗體的制備及鑒定[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2013, 29(8):829-833.

XTA Xue-qin, Muyashaer Maimaitilahong, ZHAI Tian-tian，et al. (2013). Preparation and identification of anti-follicle-stimulating hormone receptor nano-bodies [J].ChineseJournalofCellularandMolecularImmunology, 29(8): 829.(in Chinese)

[4] Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., & Songa, E. B., et al. (1993). Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Nature, 363(6428): 446-448.

[5] Huang, L., Muyldermans, S., & Saerens, D. (2010). Nanobodies?: proficient tools in diagnostics.ExpertReviewofMolecularDiagnostics,10(6): 777-785.

[6] 楊珂, 王冬. 納米抗體及其應(yīng)用[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2008, 24(4): 425-427.

YANG Ke, WANG Dong. (2008). Nanobody and its application [J].ChineseJournalofCellularandMolecularImmunology, 24(4): 425-427.(in Chinese)

[7] Decanniere, K., Muyldermans, S., & Wyns, L. (2000). Canonical antigen-binding loop structures in immunoglobulins: more structures, more canonical classes? 1.JournalofMolecularBiology, 300(1): 83-91.

[8] Lvgren, J., Pursiheimo, J. P., Pyykk, M., Salmi, J., & Lamminm?ki, U. (2016). Next generation sequencing of all variable loops of synthetic single framework scfv-application in anti-hdl antibody selections.NewBiotechnology, 33(6): 790-796.

[9] Hattori, T., & Mnakanishi, U. (2010). High affinity anti-inorganic material antibody generation by integrating graft and evolution technologies: potential of antibodies as biointerface molecules.JournalofBiologicalChemistry, 285(10): 7,784-7,793.

[10] Conrath, K. E., Lauwereys, M., Galleni, M., Matagne, A., Frère, J. M., & Kinne, J., et al. (2001). Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the camelidae.AntimicrobialAgents&Chemotherapy, 45(10): 2,807-2,812.

[11] Dumoulin, M., Conrath, K., Van, M. A., Meersman, F., Heremans, K., & Frenken, L. G., et al. (2002). Single-domain antibody fragments with high conformational stability.ProteinScienceAPublicationoftheProteinSociety, 11(3): 500-515.

[12] Stefan Ewert, Christian Cambillau, §., Katja Conrath, ‖. A., & Andreas Plückthun. (2002). Biophysical properties of camelid vhh domains compared to those of human vh3 domains?.Biochemistry,41(11): 3,628-3,636.

[13] Conrath, K., Vincke, C., Stijlemans, B., Schymkowitz, J., Decanniere, K., & Wyns, L., et al. (2005). Antigen binding and solubility effects upon the veneering of a camel vhh in framework-2 to mimic a vh.JournalofMolecularBiology, 350(1): 112-125.

[14] Saerens D; Pellis M; Loris R; Pardon E; Dumoulin M; Matagne A; Wyns L; Muyldermans S; Conrath K. (2005). Identification of a universal vhh framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies.Journalofmolecularbiology, 352(3): 597-607.

[15] Coloma, T. A. S., Dattatreyamurty, B., & Jr, L. E. R. (1990). A synthetic peptide corresponding to human fsh beta-subunit 33-53 binds to fsh receptor, stimulates basal estradiol biosynthesis, and is a partial antagonist of fsh.Biochemistry, 29(5): 1,194-1,200.

[16] Muyldermans, S. (2001). Single domain camel antibodies: current status.JournalofBiotechnology, 74(4): 277-302.

[17] Harmsen, M. M., & De Haard, H. J. (2007). Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.AppliedMicrobiologyandBiotechnology, 77(1): 13-22.

[18] De, M. A. (2011). Biotechnological applications of recombinant single-domain antibody fragments.MicrobialCellFactories, 10(1): 44.

[19] Hutchings, C. J., Koglin, M., & Marshall, F. H. (1900). Therapeutic antibodies directed at g protein-coupled receptors.Mabs, 2(6): 594-606.

[20] Vincke, C., Loris, R., Saerens, D., Martinez-Rodriguez, S., Muyldermans, S., & Conrath, K. (2009). General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold.JournalofBiologicalChemistry, 284(5): 3,273-3,284.

Rapid Generation of Anti-FSHR Nanobody by CDR3 Affinity Transfer Approach

XI Ou-yan, QIU Ling-ling, MA Xiao-ling, QIN Rui-ping, ZHAO Ting, LI Jiang-wei

(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering / College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046，China)

【Objective】 To evaluate the potential of camel-derived antibody cAbBCII10 as a non-antibody affinity transfer skeleton, the FSHR binding peptide was grafted to the antigen-binding region of cAbBCII10 using affinity transfer to rapidly obtain anti-FSHR antibody.【Method】The FSH binding motif FSH 33-53 coding sequence was inserted into the CDR1 and CDR3 regions of the nanobody cAbBCII10, respectively, and named VHH-hFSH1 and VHH-hFSH3. These DNA sequences were cloned into pET22b vector and transformed into E. coli BL21 (DE3), and purified single-domain antibody was obtained by IPTG induction and Ni-affinity affinity chromatography.【Result】Finally binding capacity and specificity of purified cAbBCII10, VHH-hFSH1 and VHH-hFSH3 with FSHR were identified by ELISA. The VHH-hFSH1, VHH-hFSH3 and cAbBCII10 proteins obtained by the framework transplantation were expressed in the intercellular space of bacteria. ELISA experiments showed that the VHH-hFSH3 obtained by grafting the FSHR binding peptide FSH33-53 to the CDR3 of cAbBCII10 had a specific binding to FSHR activity.【Conclusion】CAbBCII10 can be used as a graft framework, FSH and FSHR binding peptide grafted into the CDR1 and CDR3 regions of cAbBCII10 can obtain higher affinity anti-FSHR antibody.

affinity transfer; FSHR; FSH33-53; cAbBCII10; nanobody

LI Jiang-wei (1967-), male, native place: Urumqi, Xinjiang. Professor, research field: Molecular immunology , (E-mail)jwli67@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.07.016

2017-04-24

國家自然科學(xué)基金項目“駱駝單域抗體框架區(qū)作為小分子抗體通用移植骨架的研究”(31370933)；國家自然科學(xué)基金項目“基于高通量測序?qū)︸橊効贵w庫的多樣性分析和數(shù)據(jù)挖掘及新納米抗體的發(fā)現(xiàn)”(31570935)

席歐彥(1990-)，女，新疆伊犁人，碩士研究生，研究方向為生物學(xué)，(E-mail)1543687922@qq.com

李江偉(1967-)，男，新疆烏魯木齊人，教授，研究方向為分子免疫學(xué)，(E-mail)jwli67@sina.com

S188

A

1001-4330(2017)07-1298-07

Supported by: National Natural Science Foundation of China "Study on the Universal Transplantation Framework of Camel Single Domain Antibody Framework as Small Molecule Antibody"(31370933)；National Natural Science Foundation of China "Diversity Analysis and Data Mining of Camel Antibody Library Based on High Throughput Sequencing and Discovery of New Nanobody Antibody"(31570935)