沈杭琪胡偉民林 程關(guān)亞靜劉宏友安建宇胡 晉,*

1浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院種子科學(xué)中心, 浙江杭州 310058;2浙江省浦江縣種子管理站, 浙江金華 322200

不同脫水劑對(duì)雜交水稻制種種子質(zhì)量及基因表達(dá)的影響

沈杭琪1胡偉民1林 程1關(guān)亞靜1劉宏友2安建宇1胡 晉1,*

1浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院種子科學(xué)中心, 浙江杭州 310058;2浙江省浦江縣種子管理站, 浙江金華 322200

種子脫水干燥是雜交水稻制種過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，種子自然脫水速率慢, 遇雨天還易引起成熟期推后和穗發(fā)芽等問題。利用脫水劑快速降低種子水分對(duì)種子安全生產(chǎn)有重要意義。本研究以Y兩優(yōu)689雜交水稻品種為材料, 比較不同脫水劑對(duì)其制種種子脫水及種子質(zhì)量的影響。11種脫水劑均能加快種子成熟后期脫水, 7號(hào)和9號(hào)脫水劑噴施后5 d, 種子水分分別下降4.6%和3.6%, 且對(duì)種子千粒重、發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)無不良影響, 種子可溶性蛋白、可溶性糖、ABA和GA3含量則顯著高于對(duì)照。種子室溫貯藏6個(gè)月后, 與對(duì)照相比, 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理對(duì)種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)無顯著影響, 7號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子可溶性蛋白含量、α-淀粉酶活性、ABA含量與對(duì)照無顯著差異。7號(hào)比9號(hào)的脫水效果好, 可作為Y兩優(yōu)689的脫水劑。種子貯藏前, 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理能提高種子中OsNECD1和OsNCED2基因的表達(dá), 降低OsGA2ox1的表達(dá); 而種子貯藏6個(gè)月后, OsNECD1和OsNCED2表達(dá)量下降, OsCYP707A5和OsGA2ox1表達(dá)量上升。這表明經(jīng)過6個(gè)月貯藏, 脫水劑處理對(duì)種子ABA合成相關(guān)基因和GA3分解相關(guān)基因表達(dá)的影響減弱, 同時(shí)OsCYP707A5的高表達(dá)導(dǎo)致種子ABA含量減少, 可能是種子貯藏后萌發(fā)力提高的主要原因。

雜交水稻; 脫水劑; 種子質(zhì)量; 成熟脫水; 基因表達(dá)

雜交水稻制種過程中種子自然脫水速率慢, 如遇多雨天氣, 籽粒難以自然干燥, 易引起成熟期推后、穗發(fā)芽等問題, 直接影響種子質(zhì)量, 增加種子加工成本。因此, 利用脫水劑快速降低種子水分對(duì)種子安全生產(chǎn)有重要意義。目前用于農(nóng)作物的脫水劑主要有植物激素和部分除草劑(草甘膦、百草枯、敵草快等), 敵草快和百草枯屬于觸殺型除草劑, 通過抑制植株的光合作用, 使植株迅速枯死, 從而快速降低籽粒和植株的含水量[1]。陳軼等[2]以20%的敵草快作為水稻成熟時(shí)的脫水劑, 使籽粒水分下降 5%,從而有效降低后期水稻的干燥成本。郝洪波等[3]對(duì)立收谷、草甘膦和乙烯利等在谷類作物成熟后期的脫水作用研究發(fā)現(xiàn), 立收谷脫水效果良好。目前, 對(duì)脫水劑的研究大多側(cè)重于糧食生產(chǎn)的脫水效果, 對(duì)種子生產(chǎn)中活力的影響研究較少, 尤其在雜交水稻制種中的應(yīng)用研究更為缺乏。前期我們研究敵草快和百草枯在雜交水稻錢優(yōu) 1號(hào)種子上的脫水效果,篩選了合適的脫水劑[4], 但是不同的雜交水稻組合的脫水特性可能存在差異, 脫水劑處理后的種子質(zhì)量經(jīng)過貯藏后的變化情況也尚無報(bào)道。

本文結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀, 以Y兩優(yōu)689雜交水稻品種為材料, 研究了噴施不同脫水劑對(duì)種子水分、發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)情況及種子貯藏后種子質(zhì)量的影響。篩選出既能有效降低種子含水量又不影響種子質(zhì)量的適宜脫水劑, 并研究了施用脫水劑對(duì)發(fā)芽相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交水稻秈型品種組合Y兩優(yōu)689 (Oryza sativa L.)的母本和父本種子, 均由浙江農(nóng)科種業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

表1 11種脫水劑的成分和用量Table 1 Components and dosages of 11 dehydrating agents (g hm–2)

1.2.1 栽培方法與藥劑施用 2015年, 在浙江大學(xué)紫金港校區(qū)農(nóng)場(chǎng)制種。父本第1期于2015年5月22日播種, 6月15日移栽, 第2期于2015年5月29日播種, 6月22日移栽, 秧齡期均控制在25 d以內(nèi)。2期父本與1期父本按1 1∶ 比例移栽, 株距24 cm。母本于2015年6月23日播種, 7月13日移栽, 秧齡期均控制在20 d以內(nèi)。母本適當(dāng)密植, 為15 cm (株距) × 18 cm (行距), 每穴5株。采用11種脫水劑處理(表 1), 以清水處理為對(duì)照, 于 F1種子蠟熟末期(2015年9月26日)噴施, 每處理重復(fù)3次, 每個(gè)重復(fù)的小區(qū)面積8.55 m2。在脫水劑噴施后的第3、第5、第7天從田間取樣, 取一部分種子用聚乙烯袋包裝帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定種子水分; 另取一部分種子用冰袋保存帶回實(shí)驗(yàn)室, 液氮冷凍后, -80℃冰箱保存,用于測(cè)定種子的內(nèi)源激素含量; 剩下的種子用網(wǎng)袋包裝,懸掛在網(wǎng)室內(nèi)通風(fēng)晾曬至水分平衡, 用于測(cè)定種子千粒重、種子發(fā)芽、幼苗生長(zhǎng)等指標(biāo)。種子晾曬至安全水分以下, 用牛皮紙袋包裝在室溫下貯藏,貯藏6個(gè)月后, 測(cè)定種子發(fā)芽、幼苗生長(zhǎng)、可溶性糖、可溶性蛋白、內(nèi)源激素含量和相關(guān)基因表達(dá)量等指標(biāo)。

1.2.2 種子水分和千粒重測(cè)定 參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 3543.6-1995), 采用二次烘干法測(cè)定種子水分。待水分平衡后隨機(jī)數(shù)取1000粒稱重, 3次重復(fù), 計(jì)算種子千粒重。

1.2.3 種子發(fā)芽測(cè)定 種子經(jīng) 0.1% NaClO溶液消毒15 min后用清水洗凈[5], 選用規(guī)格為12 cm × 18 cm的發(fā)芽盒發(fā)芽, 每盒100粒種子為1次重復(fù),每個(gè)處理3次重復(fù), 將種子置20℃/30℃光照培養(yǎng)箱中, 16 h光照/8 h黑暗24 h交替, 每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù), 分別在發(fā)芽第5天和第14天計(jì)算發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。于統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率當(dāng)天, 隨機(jī)選擇每個(gè)處理10株幼苗, 測(cè)定其鮮重, 然后將幼苗置 105℃烘箱保持 30 min, 再調(diào)整溫度至80℃保持24 h, 取出放干燥器冷卻后測(cè)定其干重。根長(zhǎng)和苗高均為10株幼苗平均值,每個(gè)處理3次重復(fù)。并根據(jù)每天發(fā)芽數(shù)計(jì)算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)GI = ∑(Gt/Tt), 活力指數(shù)VI = GI×S式中, Gt為第t天的發(fā)芽種子數(shù), Tt為與Gt相對(duì)應(yīng)的發(fā)芽天數(shù), S為10株正常幼苗的干重(g)。

1.2.4 種子生理生化指標(biāo)測(cè)定 采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[6]。采用考馬斯亮藍(lán) G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量[7]。采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定α-淀粉酶活性[8]。

1.2.5 種子激素含量測(cè)定 參考秦國臣的方法[9]。稱取1 g水稻種子, 加液氮研成粉末, 加6 mL冷乙腈, 密封放入4℃冰箱浸提24 h, 12 298 × g (4℃)離心10 min, 取上清液, 再向殘?jiān)屑? mL冷乙腈,低溫超聲振蕩1 h, 12 298 × g離心10 min, 取上清液,重復(fù)提取2次, 合并3次上清液, 在35℃下用氮?dú)獯蹈? 加入3 mL 0.1 mol L–1pH 8.0磷酸緩沖溶液,放入-80℃超低溫冰箱中冰凍30 min, 在4℃條件下解凍, 12 298 × g離心15 min, 過濾棄去雜質(zhì), 用0.5 mol L–1鹽酸調(diào)節(jié)至pH 3.0～3.5, 再用等體積的乙酸乙酯萃取3次, 合并酯相, 在35℃條件下氮?dú)獯蹈?用流動(dòng)相定容至1 mL, 溶液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后用高效液相色譜儀測(cè)定(型號(hào)2487, Waters)。

1.2.6 種子基因的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定 取 100 mg的水稻種子采用GK類RNA提取試劑盒(Waryong,北京)提取RNA, 利用NanoDrop 1000分光光度計(jì)檢驗(yàn)RNA濃度和純度后, 添加RNase free H2O調(diào)節(jié)濃度至200 ng mL–1, 然后將所提RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以水稻β-OsActin基因作為內(nèi)參基因, 進(jìn)行qRT-PCR,采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物, 反應(yīng)體系含5×SYBR Green Mix 10 μL, 10 μmol L–1特異性正向引物和反向引物各1 μL, cDNA模板2 μL, 補(bǔ)水至20 μL, 程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s, 95℃變性5 s, 60℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。目的基因擴(kuò)增的特異性經(jīng)熔解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

表2 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的引物序列Table 2 Primer pairs of genes for quantitative RT-PCR

將試驗(yàn)所得百分率數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換, 用SAS軟件進(jìn)行方差分析和多重比較(α = 0.05, LSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫水劑對(duì)種子水分和千粒重的影響

脫水劑噴施后3 d, 1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和11號(hào)脫水劑處理的種子水分比對(duì)照顯著下降, 其余 7種脫水劑處理的種子水分與對(duì)照比無顯著下降, 所有脫水劑處理的種子千粒重與對(duì)照無顯著差異(表3)。脫水劑噴施后5 d, 所有脫水劑處理的種子水分均顯著低于對(duì)照, 其中1號(hào)脫水劑處理下降 7.4%, 脫水效果最明顯, 10號(hào)和11號(hào)脫水劑處理下降最少, 分別下降2.4%和2.3%。除1號(hào)、3號(hào)和6號(hào)脫水劑處理外, 其余處理的種子千粒重與對(duì)照無顯著差異。脫水劑噴施后7 d, 除了4號(hào)、5號(hào)、8號(hào)和9號(hào)處理的種子水分與對(duì)照沒有顯著差異外, 其余 7種處理的種子水分均比對(duì)照顯著下降。2號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)和 11號(hào)脫水劑處理后, 種子千粒重與對(duì)照無顯著差異, 其余 5種處理的種子千粒重顯著低于對(duì)照。

表3 不同脫水劑處理對(duì)雜交水稻Y兩優(yōu)689種子水分和千粒重的影響Table 3 Effects of different dehydrating agents on seed moisture content and 1000-grain weight of Y Liangyou 689 hybrid rice

2.2 不同脫水劑對(duì)新收獲種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響

脫水劑噴施后5 d, 4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照無顯著差異。6號(hào)、7號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與對(duì)照無顯著差異, 說明6號(hào)、7號(hào)和9號(hào)脫水劑處理對(duì)種子發(fā)芽無顯著影響(表4)。脫水劑噴施后7 d, 1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照無顯著差異。4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與對(duì)照無顯著差異, 說明4號(hào)、5號(hào)和9號(hào)脫水劑處理對(duì)種子發(fā)芽無顯著影響。

脫水劑噴施后5 d, 11號(hào)脫水劑處理的種子幼苗苗高和根長(zhǎng)顯著低于對(duì)照, 其余 10種脫水劑處理的幼苗苗高和根長(zhǎng)與對(duì)照無顯著差異(表 5)。11號(hào)脫水劑處理的幼苗鮮重顯著低于對(duì)照, 干重與對(duì)照無顯著差異, 其余 10種脫水劑處理的幼苗干鮮重與對(duì)照無顯著差異。說明除了11號(hào)脫水劑, 其余10種脫水劑處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)無顯著影響。脫水劑噴施后7 d, 3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)和 10號(hào)脫水劑處理的幼苗苗高和根長(zhǎng)與對(duì)照無顯著差異。2號(hào)脫水劑處理的幼苗干重顯著低于對(duì)照, 其余 10種脫水劑處理的幼苗干重與對(duì)照無顯著差異。1號(hào)、2號(hào)、6號(hào)和10號(hào)脫水劑處理的幼苗鮮重顯著高于對(duì)照, 其余7種脫水劑處理的幼苗鮮重與對(duì)照無顯著差異, 說明3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)和10號(hào)脫水劑處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)無顯著影響。

表4 不同脫水劑處理對(duì)雜交水稻Y兩優(yōu)689種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Table 4 Effects of different dehydrating agents on germination percentage (GP), germination energy (GE), germination index (GI), and vigor index (VI) of Y Liangyou 689 hybrid rice seeds

表5 不同脫水劑處理對(duì)雜交水稻Y兩優(yōu)689幼苗根長(zhǎng)、苗高、苗干重和苗鮮重的影響Table 5 Effects of different dehydrating agents on root length (RL), shoot height (SH), fresh and dry weights (SFW, SDW) of Y Liangyou 689 hybrid rice seedlings

2.3 不同脫水劑處理對(duì)種子貯藏的影響

脫水劑噴施后5 d采收的種子貯藏6個(gè)月后, 4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照無顯著差異, 4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與對(duì)照無顯著差異, 說明4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子貯藏6個(gè)月對(duì)種子發(fā)芽無顯著影響(表6)。脫水劑噴施后7 d采收的種子貯藏6個(gè)月后, 6號(hào)、10號(hào)和11號(hào)脫水劑處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)顯著低于對(duì)照, 其余 8種脫水劑處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照無顯著差異。8號(hào)和 9號(hào)脫水劑處理的種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與對(duì)照無顯著差異, 說明8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子貯藏6個(gè)月對(duì)種子發(fā)芽無顯著影響。

脫水劑噴施后5 d采收的種子貯藏6個(gè)月后, 5號(hào)脫水劑的幼苗根長(zhǎng)顯著高于對(duì)照, 苗高與對(duì)照無顯著差異, 3號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的幼苗苗高和根長(zhǎng)與對(duì)照無顯著差異(表7)。

表7 不同脫水劑處理的Y兩優(yōu)689種子貯藏6個(gè)月對(duì)幼苗根長(zhǎng)、苗高、苗干重和苗鮮重的影響Table 7 Effects of different dehydrating agents on root length (RL), shoot height (SH), fresh and dry weights (SFW, SDW) of Y Liangyou 689 hybrid rice seedlings after storage for 6 months

11號(hào)脫水劑處理的幼苗鮮重顯著低于對(duì)照, 其余10種脫水劑處理的幼苗干鮮重與對(duì)照無顯著差異, 說明3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子貯藏 6個(gè)月對(duì)幼苗生長(zhǎng)無顯著影響。脫水劑噴施后7 d采收的種子貯藏6個(gè)月后, 3號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)和10號(hào)脫水劑處理的幼苗苗高和根長(zhǎng)與對(duì)照無顯著差異。4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)和 9號(hào)脫水劑處理的幼苗干鮮重與對(duì)照無顯著差異, 說明6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子貯藏6個(gè)月對(duì)幼苗生長(zhǎng)無顯著影響。

綜合上述結(jié)果, 脫水劑噴施后5 d, 種子水分下降明顯, 種子千粒重比噴施后3 d明顯提高, 但是比噴施后7 d差異不明顯, 因此認(rèn)為脫水劑噴施后5 d是合適的收獲時(shí)間。脫水劑噴施后5 d, 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑脫水效果比較明顯, 種子水分分別下降4.6%、4.3%和 3.6%, 種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)較高, 且3種脫水劑處理與對(duì)照的種子千粒重?zé)o顯著影響。此外, 除了 8號(hào)脫水劑處理降低了種子發(fā)芽勢(shì)外, 3種脫水劑處理對(duì)種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)無不良影響。種子室溫貯藏6個(gè)月后, 3種脫水劑處理的種子活力和幼苗生長(zhǎng)與對(duì)照無顯著差異。為了深入研究脫水劑處理對(duì)種子的影響, 后續(xù)試驗(yàn)選用7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理后 5 d采收的種子進(jìn)行激素、基因表達(dá)等測(cè)定。

2.4 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理對(duì)種子可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

種子貯藏前, 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子可溶性糖和可溶性蛋白含量均顯著高于對(duì)照(圖1), 8號(hào)處理的種子可溶性糖最高, 達(dá)到107 mg g–1。7號(hào)和 9號(hào)處理的種子可溶性糖含量其次, 分別為102.9 mg g–1和102.3 mg g–1。9號(hào)處理的種子可溶性蛋白含量最高, 達(dá)到1.34 mg g–1。種子貯藏6個(gè)月后, 3種脫水劑處理的種子可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于對(duì)照, 其中 9號(hào)處理的種子可溶性糖含量達(dá)到顯著水平。與貯藏前相比, 3種脫水劑處理的種子貯藏后可溶性糖和可溶性蛋白含量均下降。

2.5 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理對(duì)種子α-淀粉酶活性的影響

種子貯藏前, 3種脫水劑處理的種子α-淀粉酶活性與對(duì)照無顯著差異(圖2), 但貯藏后種子的α-淀粉酶活性顯著高于貯藏前的種子。

2.6 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理對(duì)種子ABA和GA3含量的影響

種子貯藏前, 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子中ABA和GA3含量顯著高于對(duì)照(圖3), 其中, 7號(hào)處理的種子ABA含量最高, 9號(hào)處理的種子GA3含量最高。8號(hào)和9號(hào)處理的種子ABA/GA3值與對(duì)照無顯著差異, 7號(hào)處理的種子ABA/GA3值顯著高于對(duì)照。種子貯藏后, 7號(hào)和8號(hào)脫水劑處理的種子中ABA含量與對(duì)照無顯著差異, 7號(hào)和9號(hào)處理的種子 GA3含量顯著高于對(duì)照, 8號(hào)處理的種子 GA3含量與對(duì)照無顯著差異。7號(hào)和 9號(hào)處理的種子ABA/GA3值顯著低于對(duì)照, 8號(hào)處理的種子ABA/GA3值與對(duì)照無顯著差異。

2.7 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理對(duì)種子ABA和GA3合成、分解相關(guān)基因表達(dá)量的影響

種子貯藏前, 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子中ABA合成相關(guān)基因OsNECD1和OsNCED2的表達(dá)量顯著高于對(duì)照, 而 ABA分解相關(guān)基因OsCYP707A5表達(dá)量與對(duì)照無顯著差異(圖 4-A, B, C)。種子貯藏后, 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子中 OsNECD1基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照, 而OsNECD2基因表達(dá)量與對(duì)照無顯著差異; 3種脫水劑處理的種子中 ABA分解相關(guān)基因 OsCYP707A5表達(dá)量顯著高于對(duì)照。種子貯藏前, 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子中 GA3合成相關(guān)基因OsGA20ox1和OsGA20ox2表達(dá)量與對(duì)照無顯著差異, 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子中GA3分解相關(guān)基因OsGA2ox1表達(dá)量顯著低于對(duì)照(圖4-D, E, F)。種子貯藏后, 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子中OsGA20ox1和OsGA20ox2基因表達(dá)量與對(duì)照無顯著差異, 8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子中OsGA2ox1基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照, 7號(hào)脫水劑處理的種子中OsGA2ox1基因表達(dá)量與對(duì)照無顯著差異。

圖2 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理對(duì)Y兩優(yōu)689種子α-淀粉酶活性的影響Fig. 2 Effects of No.7, No.8, and No.9 dehydrating agents on the α-amylase activity in Y Liangyou 689 hybrid rice seeds柱狀圖上方不同字母表示不同脫水劑處理的種子之間差異顯著(α = 0.05, LSD)。Different small letters above error indicate significant difference among different treatments (α = 0.05, LSD).

圖3 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理對(duì)Y兩優(yōu)689種子ABA和GA3含量及其比值的影響Fig. 3 Effects of No.7, No.8, and No.9 dehydrating agents on the ABA content, GA3content and ABA/GA3ratio in Y Liangyou 689 hybrid rice seeds柱狀圖上方不同字母表示不同脫水劑處理的種子之間差異顯著(α = 0.05, LSD)。Different small letters above error indicate significant difference among different treatments (α = 0.05, LSD).

3 討論

本試驗(yàn)噴施脫水劑后的 2 d均為雨天, 導(dǎo)致噴施脫水劑后 3 d采收的種子, 種子水分下降并不明顯。其中 11號(hào)脫水劑處理后的種子水分下降最多,比對(duì)照下降2.2% (表3)。在噴施脫水劑后的3～5 d,天氣晴朗, 種子水分下降明顯, 脫水劑處理后種子水分比對(duì)照下降2.3%～7.4%。在噴施脫水劑后的7 d是雨天, 種子采收時(shí)含有大量水分, 因此種子水分與噴施后5 d采收的種子比沒有下降反而有所提高。噴施脫水劑后, 種子在5 d采收千粒重要顯著高于3 d采收的, 但是7 d采收的種子千粒重相比于5 d采收的種子沒有顯著的上升。說明噴施脫水劑后 5 d是一個(gè)合適的采收時(shí)間, 噴施后5 d收獲, 種子水分下降明顯且對(duì)產(chǎn)量影響較小。

植物體內(nèi)糖含量越高, 新陳代謝越旺盛, 植物抵抗病原菌的能力就越強(qiáng)。糖也是植物感病后啟動(dòng)或加強(qiáng)磷酸戊糖途徑的底物, 而磷酸戊糖途徑的最終產(chǎn)物和中間產(chǎn)物是合成抗病性有關(guān)的次生代謝產(chǎn)物的前體。植物受到逆境脅迫時(shí), 細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖濃度增加, 以提高植物細(xì)胞的抗逆性[10]。同時(shí), 有研究指出水稻種子在成熟脫水后期, 種子內(nèi)非還原性糖逐漸積累, 有助于種子獲得脫水耐性[11]。7號(hào)、8號(hào)和 9號(hào)脫水劑處理的種子可溶性糖和可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照(圖1), 這有助于種子獲得脫水耐性以及增強(qiáng)抵抗脫水干燥損傷的能力。徐亮等[12]研究表明, 種子可溶性糖含量隨著貯藏時(shí)間增加而不斷下降, 種子中含有較高的可溶性糖和蛋白質(zhì)有利于種子保持活力。本試驗(yàn)中, 種子貯藏 6個(gè)月后,脫水劑處理種子和對(duì)照種子的可溶性糖含量下降,與前人研究一致。9號(hào)脫水劑處理的種子可溶性糖顯著高于對(duì)照, 可溶性蛋白含量與對(duì)照無顯著差異, 7號(hào)和 8號(hào)脫水劑處理的種子可溶性糖和可溶性蛋白含量與對(duì)照無顯著差異, 說明這 3種脫水劑處理對(duì)種子的貯藏性無顯著影響。

圖4 7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)脫水劑處理對(duì)Y兩優(yōu)689種子ABA和GA3合成、分解相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 4 Effects of No.7, No.8, and No.9 dehydrating agents on the expression of ABA and GA3biosynthesis, catabolism genes in Y Liangyou 689 hybrid rice seeds柱狀圖上方不同字母表示不同脫水劑處理的種子之間差異顯著(α = 0.05, LSD)。Different small letters above error indicate significant difference among different treatments (α = 0.05, LSD).

研究表明, α-淀粉酶活性與種子活力呈正相關(guān)[13-14]。在本試驗(yàn)中, 8號(hào)脫水劑處理的種子α-淀粉酶活性下降(圖 2), 可能是引起種子發(fā)芽勢(shì)降低的原因。7號(hào)和9號(hào)脫水劑處理的種子α-淀粉酶活性與對(duì)照無顯著差異, 同時(shí)這 2種脫水劑處理的種子活力與對(duì)照也無顯著差異。種子貯藏6個(gè)月后, 3種脫水劑處理的種子 α-淀粉酶活性相比貯藏前顯著上升, 這與貯藏后種子活力提高相一致。

ABA和 GA3是調(diào)控種子萌發(fā)的主要激素。在nced3、nced5、nced9、aba2、aao3等ABA合成缺陷的擬南芥突變體種子中, ABA的合成受阻, 其萌發(fā)速率明顯快于野生型種子, 而NCED6和NCED9等過表達(dá)的擬南芥突變體種子發(fā)芽率明顯降低[15]。此外, 有研究指出ABA與種子成熟脫水過程中獲得脫水耐性密切相關(guān)[16], 且與貯藏養(yǎng)料的積累也有一定聯(lián)系[17]。周可金等[18]用敵草快催熟油菜種子時(shí),認(rèn)為敵草快引起種子 ABA含量的上升是加快種子成熟的原因之一。本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn) 3種脫水劑處理的種子中ABA含量顯著高于對(duì)照, 說明脫水劑能在內(nèi)源ABA激素調(diào)控上促進(jìn)種子成熟脫水(圖3)。與ABA的抑制作用相反, GA3可促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。Shu等[19]研究表明, 在 ga1等 GA3合成缺陷的擬南芥突變體種子中 GA3含量極低, 通過施加外源GA3后種子才能正常萌發(fā)。這與GA3促進(jìn)禾谷類種子中淀粉酶的產(chǎn)生與釋放以促進(jìn)種子萌發(fā)密切相關(guān)[20]。稻谷貯藏后, 3種脫水劑處理的種子與對(duì)照種子中ABA/GA3值顯著降低, 曹雅君等[21]發(fā)現(xiàn)水稻種子中ABA/GA3值降低, 種子萌發(fā)力加強(qiáng)。在本試驗(yàn)中, 同樣也發(fā)現(xiàn)貯藏后種子中ABA/GA3值下降, 種子萌發(fā)力加強(qiáng)。

在水稻中, 有 5個(gè) NCED家族基因, 3個(gè)CYP707A家族基因, 4個(gè) GA20ox家族基因和 5個(gè)GA2ox家族基因, 其中 OsNECD1、OsNCED2和OsCYP707A5被認(rèn)為與水稻中ABA的合成代謝密切相關(guān), 而 OsGA20ox1、OsGA20ox2、OsGA20ox3和OsGA2ox1與GA3的合成分解密切相關(guān)[22]。貯藏前, 7號(hào)、8號(hào)和 9號(hào)脫水劑處理的種子中OsNECD1和OsNCED2表達(dá)量均顯著上升, OsCYP707A5則與對(duì)照無顯著差異(圖4), 種子內(nèi)ABA明顯升高。3種脫水劑對(duì)種子中 GA3合成基因 OsGA20ox1和OsGA20ox2的表達(dá)量影響與對(duì)照無顯著差異, 但是顯著降低了GA3分解基因OsGA2ox1的表達(dá)水平。貯藏6個(gè)月后, 3種脫水劑處理的種子OsNECD1和OsNCED2表達(dá)量下降, 但仍明顯高于對(duì)照, OsCYP707A5和OsGA2ox1表達(dá)量有所上升, 且明顯高于對(duì)照。表明種子經(jīng)過貯藏, 脫水劑處理對(duì)種子ABA合成相關(guān)基因和GA3分解相關(guān)基因表達(dá)的影響減弱。同時(shí), OsNECD1、OsNCED2表達(dá)下降, 而OsCYP707A5表達(dá)升高, 導(dǎo)致種子 ABA含量下降,可能是種子貯藏后萌發(fā)力加強(qiáng)的主要原因, 3種脫水劑對(duì)種子基因表達(dá)的影響趨勢(shì)一致。

種子貯藏后, 3種脫水劑處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和 α-淀粉酶活性顯著上升, 而可溶性蛋白和ABA含量與對(duì)照無顯著差異, 表明脫水劑對(duì)種子的影響在貯藏一段時(shí)間后減弱。其中, 8號(hào)脫水劑脫水效果良好, 達(dá)到4.3%, 但是種子中 α-淀粉酶活性及種子發(fā)芽勢(shì)顯著低于對(duì)照。9號(hào)脫水劑對(duì)種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)均沒有不良影響, 但脫水效果與7號(hào)和8號(hào)相比較差。7號(hào)脫水劑脫水效果良好, 達(dá)到4.6%,且對(duì)種子質(zhì)量沒有影響, 因此 7號(hào)脫水劑被認(rèn)為是Y兩優(yōu)689雜交水稻制種成熟后期合適的脫水劑。

4 結(jié)論

雜交水稻Y兩優(yōu)689制種蠟熟末期, 噴施不同脫水劑能降低種子水分。其中以 7號(hào)脫水劑效果最好, 噴施后5 d, 種子水分比對(duì)照下降4.6%, 種子千粒重、發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)與對(duì)照無顯著差異, 種子可溶性蛋白、可溶性糖、ABA和GA3含量顯著高于對(duì)照。種子室溫貯藏 6個(gè)月后, 發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)以及種子可溶性蛋白含量、α-淀粉酶活性、ABA含量與對(duì)照無顯著差異。種子中OsCYP707A5的高表達(dá)導(dǎo)致種子ABA含量減少, 可能是種子貯藏后萌發(fā)力提高的主要原因。

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Effects of Different Dehydrating Agents on Seed Quality and Gene Expression in Hybrid Rice Seed Production

SHEN Hang-Qi1, HU Wei-Min1, LIN Cheng1, GUAN Ya-Jing1, LIU Hong-You2, AN Jian-Yu1, and HU Jin1,*

1Seed Science Center, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;2Seed Management Station of Pujiang County, Jinhua 322200, China

Seed dehydration is very important in hybrid rice seed production. For seed production safety, dehydrating agents are used in this process because natural dehydration is slow and easily affected by rainy weather, which often results in seed late mature of and pre-harvest sprouting. In this study, the effects of different dehydrating agents on seed dehydration and quality were compared using hybrid rice variety “Y Liangyou 689”. The eleven dehydrating agents tested all accelerated seed dehydration. Particularly, agents No.7 and No.9 resulted in seed moisture content at five days after spray decreased by 4.6% and 3.6%, respectively, and had no negative effects on 1000-grain weight, seed germination and seedling growth. Moreover, both agents significantly increased the contents of soluble protein, soluble sugar, ABA and GA3in seeds. After storage at room temperature for six months, agents No.7, No.8, and No.9 had no negative effects on seed germination and seedling growth as compared to the control. There were no significant differences in soluble protein content, α-amylase activity and ABA content among agents No.7, No.9 and the control. Agent No.7 was better in lowering seed moisture content than No.9, suggesting its potential use in Y Liangyou 689 seed production. Interestingly, agents No.7, No.8, and No.9 induced OsNECD1 and OsNCED2 expressions and reduced OsGA2ox1 expression in seeds before storage. After six-month storage, the expressions of OsNECD1 and OsNCED2 decreased and the expression of OsCYP707A5 and OsGA2ox1 increased in seeds treated with agents No.7, No.8, and No.9. This result indicate that the effects of dehydrating agents on ABA biosynthesis genes and GA3catabolism genes in seeds weakened during stor-age and the high expression level of OsCYP707A5 resulted in the decline of ABA content, which might be a main reason for better seed germination.

Hybrid rice; Dehydration agent; Seed quality; Mature dehydration; Gene expression

(

): 2016-12-09; Accepted(接受日期): 2017-05-10; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-05-25.

10.3724/SP.J.1006.2017.01308

本研究由國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203052), 浙江省科技廳項(xiàng)目(2013C02005, 2013C32023), 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LZ14C130002, LY15C130002)和江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目資助。

This study was supported by the China Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (201203052), the Science and Technology Department of Zhejiang Province (2013C02005, 2013C32023), the Natural Science Fundation of Zhejiang Province (LZ14C130002, LY15C130002), and the Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production.

*通訊作者(Corresponding author): 胡晉, E-mail: jhu@zju.edu.cn

聯(lián)系方式: E-mail: 736935396@qq.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170525.1021.002.html