孔清泉，王玉紅，周忠麗，王恒，蔡小彥，王星星，張振梅，王坤波，劉方

（棉花生物學(xué)國家重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽455000）

陸地棉野生種系瑪麗加朗特85基于SSR的遺傳圖譜

孔清泉，王玉紅，周忠麗，王恒，蔡小彥，王星星，張振梅，王坤波，劉方*

（棉花生物學(xué)國家重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽455000）

用陸地棉野生種系瑪麗加朗特85與栽培種中棉所16雜交的188個F2單株，利用SSR標記構(gòu)建了瑪麗加朗特85的遺傳圖譜。圖譜包含245個位點，26個連鎖群，覆蓋19條染色體，總長為1 866.05cM，標記間平均距離為7.62cM。其中79個標記偏離孟德爾分離比例，有5條染色體存在偏分離密集區(qū) （Segregation distortion region,SDR）：17號染色體上有2個SDR，3號、14號、15號和21號染色體上各有1個SDR。該研究為瑪麗加朗特85優(yōu)良性狀基因定位、分子標記輔助育種奠定了工作基礎(chǔ)。

半野生棉；瑪麗加朗特85；遺傳連鎖圖譜；SSR

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物，然而隨著“糧進棉退”趨勢的加劇，1980年以后我國棉花種植區(qū)域逐漸向西北方向轉(zhuǎn)移，其中向新疆集中轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象最為突出[1]。然而人們對當?shù)厮?、土資源的不合理開發(fā)利用，導(dǎo)致新疆土壤次生鹽漬化問題逐漸加重，并且已成為限制棉花持續(xù)發(fā)展的主要障礙性因子之一[2]。

陸地棉野生種系又稱半野生棉，具有抗病蟲、纖維強度高、品質(zhì)優(yōu)等特點，在干旱、鹽堿含量較高的土壤中依然具有較強生存能力，是遺傳育種研究及利用的重要種質(zhì)資源[3]。近幾年，科研工作者逐步開始挖掘半野生棉的優(yōu)異基因。2016年郭展[4]利用渝棉1號與陸地棉野生種系闊葉棉（Gossypium hirsutumracelatifolium）TX43構(gòu)建的F2群體，采用簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）標記，構(gòu)建了1張總長度為1 367.9cM的遺傳圖譜。2015年李曉娜等[5]對半野生棉的棉仁含油量與SSR進行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果證明闊葉棉141是高油分品種?，旣惣永侍孛蓿℅.hirsutumracemarie-galante）是7個半野生棉種系之一。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，瑪麗加朗特85對新疆的復(fù)合鹽堿具有高度抗性。中棉所16是1個陸地棉優(yōu)良品種，前期鑒定中發(fā)現(xiàn)它對新疆復(fù)合鹽堿的抗性較低[6]。本研究將中棉所16作為輔助材料，構(gòu)建瑪麗加朗特85的遺傳圖譜，有助于對其優(yōu)良基因的定位、克隆、功能研究以及分子標記輔助育種的利用。

1 材料與方法

1.1 材料

利用半野生棉瑪麗加朗特85為母本，陸地棉優(yōu)質(zhì)品種中棉所16作父本，配制雜交組合得F1，F(xiàn)1自交得F2。種植F2單株，隨機選取188個單株用于遺傳作圖。

1.2 方法

1.2.1 棉花基因組DNA提取引物篩選F2群體基因型檢測。從海南三亞野生棉種質(zhì)圃取親本、F1及188個F2單株的幼嫩葉片用改良的CTAB法[7]提取DNA。

從25 318對SSR引物中篩選在親本瑪麗加朗特85和中棉所16間具有多態(tài)性的引物，用于檢測F2單株的基因型?；驍U增、電泳及染色參照陳浩東等[8]的方法。

1.2.2 群體基因分型數(shù)據(jù)讀取及圖譜構(gòu)建。對于共顯性引物：和母本瑪麗加朗特85帶型相同的單株數(shù)據(jù)代換為A，和父本中棉所16帶型相同的單株數(shù)據(jù)代換為B，雜合單株記作H，缺失數(shù)據(jù)記作“-”。對于顯性引物：母本瑪麗加朗特85為顯性（有帶）以及分離群體中與母本瑪麗加朗特85帶型相同的單株記作D，純合中棉所16帶型單株記作B；父本中棉所16為顯性（有帶）以及分離群體中與父本中棉所16帶型相同的單株記作C，純合瑪麗加朗特85帶型單株記作A；缺失數(shù)據(jù)記作“-”。

參照陳浩東的方法[14]，利用JoinMap 4.0作圖軟件，設(shè)置不同連鎖群的LOD值設(shè)置為3～10。將連鎖運算輸出的結(jié)果，利用繪圖軟件MapChart 2.2繪制連鎖圖譜。根據(jù)使用的引物信息及已發(fā)表的遺傳圖譜上的共同標記結(jié)果確定連鎖群所屬的染色體。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及F2群體基因型檢測

本研究使用25 318對不同系列的SSR引物在雙親間進行多態(tài)性篩選，共篩選出多態(tài)性引物298對，其中59個顯性標記，239個共顯性標記，多態(tài)率為1.18%（表1）。不同種類的引物在兩親本上的多態(tài)性也不同。

表1 本研究使用的SSR引物情況

利用298對多態(tài)性引物對188個F2單株進行基因型檢測，得到298個標記位點。圖1是引物SWU10161對F2作圖群體的基因分型電泳結(jié)果。

2.2 遺傳連鎖圖譜的特征

利用多態(tài)性的引物對F2群體進行基因型檢測后，獲得298個位點，除53個標記沒能進入任何連鎖群，另外245個標記進入26個連鎖群。根據(jù)已有的SSR遺傳圖譜[9-14]和SSR引物信息，將26個連鎖群歸入相應(yīng)的染色體，覆蓋19條染色體（圖2、表2），平均每條染色體上有12.89個標記。圖譜覆蓋染色體長度為1 866.05cM，標記間平均距離為7.62cM，平均每條染色體的圖譜長度為98.21cM。D2（17號染色體，Chr.17）染色體上標記數(shù)目最多，有25個；A6（6號染色體，Chr.6）最少，僅2個。遺傳距離最長的是D3（14號染色體，Chr.14），最短的是D6（25號染色體，Chr.25）；標記間平均距離最大的為A6（6號染色體，Chr.6），最小的為 D6（25號染色體，Chr.25）。At染色體組包含70個標記位點，圖譜長度為604.87cM，Dt染色體組包含175個標記位點，圖譜長度為1 261.18cM。

圖1 引物SWU10161對F2群體基因分型電泳結(jié)果

圖2 陸地棉野生種系瑪麗加朗特85基于SSR的遺傳圖譜

表2 瑪麗加朗特85×中棉所16構(gòu)建的F2群體遺傳連鎖圖譜信息

2.3 標記位點的偏分離檢測

對進入遺傳圖譜的245個標記位點進行卡方檢測，有79個位點不符合孟德爾分離比例 （P＜0.05），其中35個偏向瑪麗加朗特85，32個偏向中棉所16，有12個偏向雜合體。結(jié)果如表3。各染色體上的偏分離標記數(shù)相差較大。總的來說，Dt染色體組上的偏分離標記比例高于At染色體組上的偏分離比例。而且，部分偏分離位點成簇分布即偏分離熱點區(qū)（Segregation distortion region，SDR）。據(jù)統(tǒng)計，圖譜中有5條染色體存在SDR（≥3個偏分離標記），其中3、14、15、21號染色體上各存在1個SDR，17號染色體上有2個SDR。每個SDR內(nèi)部不同標記偏分離方向基本一致，3和21號染色體上的SDR內(nèi)部的標記大部分偏向雜合子，14號染色體上的SDR內(nèi)部的標記大部分偏向父本中棉所16，15號染色體上的SDR內(nèi)部的標記全部偏向母本瑪麗加朗特85，17號染色體上的2個SDR，偏離方向不穩(wěn)定。

3 討論與結(jié)論

到目前為止，已發(fā)表的棉花高密度遺傳圖譜均為陸海種間遺傳圖譜，對半野生棉的研究較少，缺乏標記密度大、有代表性的半野生棉遺傳圖譜。

本研究構(gòu)建了瑪麗加朗特85遺傳圖譜，共包含245個SSR標記，圖譜長度為1866.05cM。2016年郭展[4]構(gòu)建了1張陸地棉優(yōu)質(zhì)品系渝棉1號×闊葉棉TX43的總長為1 367.9cM的圖譜，包括At染色體組59個標記，Dt染色體組81個標記。宋憲亮[15]曾單獨使用SSR標記構(gòu)建的遺傳圖譜長度為5 644.3cM，后來又結(jié)合相關(guān)序列多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）標記，使圖譜長度增加近500cM，并且推測棉花遺傳圖譜長度不低于6200cM。本圖譜中標記在染色體上分布不均勻（每條染色體上2～25個），而且多態(tài)性引物比例較低，這可能是因為分子標記類型單一，或者是因為所用的親本在不同類型的引物間多態(tài)性差異較大。因此，在構(gòu)建遺傳圖譜時，應(yīng)該使用能擴增基因組不同區(qū)域的標記類型，充分利用不同類型的分子標記，以得到更多的多態(tài)性分子標記，提高對棉花基因組的覆蓋范圍和均勻性。

表3 本研究圖譜中的偏分離情況

本研究為瑪麗加朗特85優(yōu)良基因或數(shù)量性狀位點（Quantitative trait locus,QTL）的精細定位以及優(yōu)良基因向栽培品種轉(zhuǎn)育奠定了基礎(chǔ)。

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[4]郭展.陸地棉種內(nèi)遺傳圖譜構(gòu)建及衣分QTL定位[D].重慶：西南大學(xué)，2016.

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An SSR Genetic Map for AGossypium hirsutumracemarie-galante85

Kong Qingquan,Wang Yuhong,Zhou Zhongli,Wang Heng,Cai Xiaoyan,Wang Xingxing,Zhang Zhenmei, Wang Kunbo,Liu Fang*

S562.03

A

1000-632X（2017）08-0012-05

10.11963/1000-632X.kqqlf.20170811

2017-04-13 *通信作者：liufcri@163.cm

國家自然科學(xué)基金（31530053，31671745）；國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0100203）