尹明麗，史源，楊洋，鄭衛(wèi)萍，沈中陽(yáng)，宋紅麗（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植科，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津3009）

隨著肝移植技術(shù)的發(fā)展成熟和抗排斥藥物的不斷更新，肝移植已經(jīng)成為各種終末期肝病患者最有效的治療方法［1］。由于需要接受肝移植患者的不斷增加，供肝的短缺問(wèn)題日漸顯著［2］。為了解決供肝短缺問(wèn)題，心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）肝臟已成為我國(guó)肝移植的重要來(lái)源［3］。DCD供體可以擴(kuò)大供體池［4］，同時(shí)邊緣性供肝作為擴(kuò)大供肝來(lái)源的辦法已越來(lái)越受到重視［5］。

DCD供肝存在熱缺血時(shí)間長(zhǎng)、移植物損傷嚴(yán)重和術(shù)后受體生存時(shí)間短等問(wèn)題。缺血/再灌注是導(dǎo)致DCD供肝功能損傷的重要原因，目前尚缺乏有效的治療手段［6］。研究發(fā)現(xiàn)，使用機(jī)械灌注的方法保存供肝能夠減少供肝的缺血/再灌注損傷（ishemia reperfusion injury，IRI），從而改善肝移植的效果［7］，而常溫機(jī)械灌注（normothermic mechanical perfusion，NMP）能夠提供更多的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而改善邊緣供肝移植術(shù)后的效果［8］。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在缺血/再灌注的早期即可出現(xiàn)結(jié)構(gòu)及功能的損害［9］，但NMP并不能修復(fù)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等的損傷，因此，還需要增加一種方法在進(jìn)行NMP的同時(shí)對(duì)肝臟進(jìn)行修復(fù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）對(duì)IRI的肝臟具有明確的保護(hù)和修復(fù)的作用［10］。本研究在NMP系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，引進(jìn)BMMSCs，研究其在NMP下對(duì)DCD肝臟的影響結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 BMMSCs的獲?。簾o(wú)菌提取BMMSCs，培養(yǎng)到第3代，進(jìn)行檢測(cè)［11］。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：2～3周體重為40～60 g的健康雄性Wistar大鼠用于提取BMMSCs，5～8周體重為180～200 g健康的雄性Wistar大鼠用于DCD模型的建立。所有動(dòng)物均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)鼠食喂養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理?xiàng)l例，并由天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分成3組，A組為冷保存組（n＝5）、B組為單純NMP組（n＝5）、C組為NMP＋BMMSCs組（n＝5）。

1.3 動(dòng)物模型的建立：取Wistar大鼠，單籠飼養(yǎng)，禁食12小時(shí)以上。腹腔麻醉后，充分暴露肝臟，下腔靜脈注射0.4 ml（400 U）的肝素生理鹽水［12］，除去肝周圍不用的組織，分離出門靜脈、下腔靜脈及膽總管，夾閉胸主動(dòng)脈，計(jì)時(shí)45分鐘。結(jié)束時(shí)快速進(jìn)行門靜脈、下腔靜脈以及膽總管的插管。B組采用UW液進(jìn)行冷保存，另兩組進(jìn)行機(jī)械灌注，C組在進(jìn)行NMP前在器官室內(nèi)從門靜脈注射 BMMSCs 1ml（5×106個(gè) /ml）。門靜脈連接到膜肺的動(dòng)脈出口，下腔靜脈連接到膜肺的靜脈入口。門脈壓力灌注壓力一般控制在5～8 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）［8］，本實(shí)驗(yàn)灌注壓力控制在5.5 mmHg監(jiān)護(hù)儀持續(xù)監(jiān)控，灌注速度為4 ml/min。灌注液是含有10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液、1%雙抗混合液以及5%的自體全血。

1.4 血生化儀檢測(cè)血清肝功能酶的變化情況：出口閥抽取灌注液進(jìn)行肝功能酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspertate aminotransferase，AST）的分析，同時(shí)抽取A組肝下下腔靜脈的保存液進(jìn)行分析。

1.5 血?dú)夥治鰞x檢測(cè)灌注液血?dú)獾淖兓闆r：灌注過(guò)程中每小時(shí)從入口閥和出口閥抽取灌注液進(jìn)行血?dú)夥治?，觀察各項(xiàng)指標(biāo)。通過(guò)分析血?dú)鈾z測(cè)結(jié)果，計(jì)算灌注過(guò)程中肝臟的耗氧量。

1.6 組織形態(tài)學(xué)觀察肝臟的情況：觀察各組肝臟的外觀情況。每組樣本取自左外側(cè)葉，浸在4%的甲醛溶液中，制成組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMMSCs的檢測(cè)情況：培養(yǎng)BMMSCs到原代（圖1a）和3代（圖1b）分別拍照觀察細(xì)胞狀態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)率，檢測(cè)顯示第 3代 Wistar大 鼠 BMMSCs CD29、CD90、RT1A表達(dá)的陽(yáng)性率分別為96.7%、95.5%和95.0%；而CD34、CD45、RT1B均為陰性，陰性率均＞95%（圖1），體外獲得的細(xì)胞是BMMSCs。

圖1 BMMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)（a、b）和流式檢測(cè)結(jié)果（c、d、e）

2.2 各組ALT和AST的情況（圖2）：三組在機(jī)械灌注/冷保存前處于相同的狀態(tài)，ALT和AST之間無(wú)明顯的差異。實(shí)驗(yàn)后4小時(shí)發(fā)現(xiàn)B組ALT和AST水平明顯低于A組（均P＜0.05；）；C組ALT和AST水平明顯低于B組（均P＜0.05）；C組明顯低于A組（均P＜0.05）。NMP聯(lián)合BMMSCs的修復(fù)作用明顯優(yōu)于單純NMP和冷保存的作用。

圖2 各組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶

2.3 B組和C組在灌注過(guò)程中耗氧量的變化情況比較（圖3）：兩組開(kāi)始灌注時(shí)耗氧量快速增加，灌注0小時(shí)和1小時(shí)兩組之間沒(méi)有差異（均P＞0.05）；灌注的第2小時(shí)C組明顯高于B組（P＜0.05）；在灌注3小時(shí)和4小時(shí)耗氧量增加減慢，但C組仍明顯明高于B組（均P＜0.05）。NMP聯(lián)合BMMSCs能夠更好地修復(fù)DCD肝臟，使更多的肝細(xì)胞恢復(fù)活性。

圖3 灌注組耗氧量的變化情況

圖4 各組肝臟匯管區(qū)組織學(xué)的情況（HE染色 低倍放大）

2.4 肝臟組織學(xué)（圖4）：肝臟熱缺血45分鐘后肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷，肝竇淤血擴(kuò)張、小葉間動(dòng)靜脈和小葉間膽管有明顯的擴(kuò)張，部分肝細(xì)胞有空泡樣改變、點(diǎn)狀壞死和灶狀壞死（圖4b）。A組熱缺血4小時(shí)肝臟損傷加重，肝竇縮窄、小葉間動(dòng)靜脈和小葉間膽管官腔明顯縮窄變形，匯管區(qū)塌陷，肝細(xì)胞空泡樣變性加重（圖4c）。B組熱缺血4小時(shí)較A組肝竇、小葉間靜脈明顯擴(kuò)張，匯管區(qū)明顯改善（圖4d）；且肝細(xì)胞腫脹程度較熱缺血45分鐘的肝臟明顯降低。C組熱缺血4小時(shí)肝竇、小葉間動(dòng)靜脈和小葉間膽管輕微擴(kuò)張，匯管區(qū)已基本恢復(fù)正常，肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞仍有輕微的空泡樣變（圖4 e）；肝臟得到了明顯的改善，且效果明顯優(yōu)于冷保存組和NMP組。

2.5 形態(tài)學(xué)的情況：正常大鼠肝臟色澤紅潤(rùn)，呈鮮紅色（圖5a）。熱缺血45分鐘的肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的淤血（圖5b），肝臟呈現(xiàn)暗紅色，這也是缺血損傷的標(biāo)志。灌注過(guò)程中肝臟色澤發(fā)生明顯改變，C組4小時(shí)肝臟紅潤(rùn)（圖5e），B組4小時(shí)肝臟色澤變白（圖5d）。C組肝臟的形態(tài)明顯好于B組。而A組4小時(shí)肝臟色澤暗淡，表面出現(xiàn)花斑，明顯次于灌注組的肝臟（圖5c）。這提示NMP聯(lián)合BMMSCs能更好修復(fù)DCD肝臟組織結(jié)構(gòu)。

圖5 各組肝臟形態(tài)學(xué)的情況

3 討 論

肝移植是終末期肝病最有效的治療方案［13］，由于供肝短缺，阻礙了肝移植事業(yè)的發(fā)展。隨著臨床DCD供肝的使用，使得供肝匱乏的問(wèn)題在一定程度上得以解決，并且擴(kuò)大了可移植器官的范圍，使供體數(shù)量增加了10%～20%［14］，但DCD供肝存在IRI問(wèn)題，致使發(fā)生原發(fā)性移植肝無(wú)功能及移植肝功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)增加。IRI是由缺血的組織或器官重新恢復(fù)血流灌注而導(dǎo)致的組織結(jié)構(gòu)、功能及代謝的變化，這些變化造成組織水腫、出血和壞死等。因此，減少DCD供肝的IRI至關(guān)重要，臨床工作中應(yīng)運(yùn)用多種方式最大限度地降低DCD供肝IRI的發(fā)生，可以通過(guò)改善DCD供肝的獲取途徑、保存方式、微循環(huán)和減少DCD供肝的炎癥反應(yīng)等。目前，臨床上常用的減少IRI損傷的方法主要有缺血預(yù)處理，藥物治療及器官保存方法的改進(jìn)。缺血預(yù)處理和藥物治療只能在一定程度上緩解DCD供肝的IRI，并不能從根本上解決問(wèn)題［15］。因此，找到一種新的器官保存方法進(jìn)而改善DCD供肝的IRI是急需要解決的問(wèn)題。BMMSCs是一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞［16］。BMMSCs可通過(guò)旁分泌或趨化富集于IRI受損器官，抗凋亡、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)干細(xì)胞及祖細(xì)胞增殖分化、介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)、趨化到受損部位修復(fù)受損組織，從而發(fā)揮治療作用［17］。本研究在NMP的同時(shí)加入BMMSCs，BMMSCs（從門靜脈直接進(jìn)入肝臟） 直接作用于肝臟，進(jìn)而修復(fù)DCD供肝。

有研究顯示，大鼠熱缺血時(shí)間超過(guò)45分鐘時(shí)，術(shù)后受體雖獲得了短期的存活時(shí)間但生存時(shí)間很短，而熱缺血60分鐘時(shí)，供肝已發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷［18］。冷保存對(duì)DCD供肝的損傷嚴(yán)重，Mathur等［19］研究發(fā)現(xiàn)冷缺血時(shí)間每延長(zhǎng)1小時(shí)，移植物功能障礙的發(fā)生率將增加6%，Mathur等［20］認(rèn)為冷保存時(shí)間應(yīng)＜4小時(shí)。NMP能夠明顯改善DCD供肝的微循環(huán)［20-21］，對(duì)于供肝細(xì)胞的復(fù)蘇非常重要［22］。Xu等［7］的研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)4小時(shí)機(jī)械灌注肝臟得到了很大的修復(fù)，功能得到很好的改善。因此，我們通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終選取熱缺血45分鐘做為本實(shí)驗(yàn)的DCD模型，灌注/冷保存4小時(shí)做為本實(shí)驗(yàn)的觀察時(shí)間點(diǎn)，含有5%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液做為循環(huán)液，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察實(shí)驗(yàn)效果。

冷保存4小時(shí)肝臟外觀淤血呈暗紅色、病理表現(xiàn)肝細(xì)胞水腫并嚴(yán)重壞死、ALT和AST含量持續(xù)增高，說(shuō)明肝臟的損傷程度嚴(yán)重；采用單純的NMP，4小時(shí)肝臟的淤血情況得到很好的改善，色澤變白，肝臟病理顯示肝細(xì)胞水腫程度降低，ALT和AST水平降低；而NMP聯(lián)合BMMSCs修復(fù)，4小時(shí)肝臟的外觀色澤更紅潤(rùn)光亮，病理表現(xiàn)中央靜脈區(qū)和匯管區(qū)輕微異常，ALT和AST含量明顯降低且顯著低于NMP 4小時(shí)，說(shuō)明NMP聯(lián)合BMMSCs能夠改善肝竇微循環(huán)和修復(fù)肝臟功能。 機(jī)械灌注兩組耗氧量的比較也證實(shí)了這一點(diǎn)，NMP+BMMSCs組的耗氧量在1小時(shí)后均明顯的高于NMP組，說(shuō)明在同一灌注時(shí)間下，NMP聯(lián)合BMMSCs能夠使更多的肝臟細(xì)胞得到修復(fù)，使更多的肝臟細(xì)胞恢復(fù)活性。

含氧血液做為灌注液進(jìn)行NMP可以顯著改善DCD供肝的功能［23］。為了更好地修復(fù)DCD供肝，循環(huán)液的成分需要進(jìn)一步的改進(jìn)。同時(shí)修復(fù)時(shí)間也有待進(jìn)一步延長(zhǎng)和優(yōu)化。DCD供肝后的IRI目前缺乏有效的針對(duì)性治療手段，BMMSCs在其中的應(yīng)用拓展了細(xì)胞治療的應(yīng)用范圍，并為更多的DCD供肝應(yīng)用于臨床提供了可能的治療手段。

總之，本研究顯示常溫機(jī)械灌注能夠修復(fù)DCD熱缺血45分鐘的肝臟，常溫機(jī)械灌注聯(lián)合BMMSCs能夠更好地修復(fù)受損的肝臟，這將為如何更好地修復(fù)DCD供肝并應(yīng)用于臨床提供新的重要思路。