胡唐玲 云云 徐志慶 +段強軍 邵菁 汪天明 汪長中

[摘要]該文探討白頭翁湯正丁醇提取物（butyl alcohol extract of Baitouweng decoction，BAEB）對白念珠菌細胞膜的抑制作用。以Spot assay觀察BAEB對白念珠菌細胞活性的影響；酶標儀檢測BAEB干預(yù)后白念珠菌細胞內(nèi)滲透壓變化；熒光顯微鏡觀察BAEB對白念珠菌細胞膜通透性的影響；高效液相檢測白念珠菌細胞膜麥角甾醇的含量；qRTPCR法檢測細胞膜麥角甾醇生物合成相關(guān)基因的表達。結(jié)果顯示，256，512，1 024 mg·L-1BAEB干預(yù)下白念珠菌活性逐漸降低；512，1 024 mg·L-1BAEB組白念珠菌胞內(nèi)甘油含量顯著性增多（P<005），與白念珠菌胞內(nèi)滲透壓相關(guān)的基因HOG1分別下調(diào)91，93，55倍；512，1 024 mg·L-1BAEB組白念珠菌紅色熒光細胞明顯增多；1 024 mg·L-1BAEB干預(yù)后麥角甾醇峰面積為35884 95，有顯著性差異（P<005）；1 024 mg·L-1BAEB干預(yù)組ERG1，ERG2，ERG3，ERG4，ERG5，ERG6，ERG10，ERG11，ERG13，ERG24，ERG25，ERG251，ERG26與UPC2 分別下調(diào)658，489，415，924，341，984，308，750，553，590，245，325，198，1007倍。BAEB可通過抑制麥角甾醇及其生物合成相關(guān)基因的表達，進而抑制白念珠菌細胞膜完整性。

[關(guān)鍵詞]白頭翁湯正丁醇提取物；白念珠菌；細胞膜；麥角甾醇

Butyl alcohol extract of Baitouweng decoction inhibits

Candida albicans cell membrane

HU Tangling 1，2， YUN Yun1，2， XU Zhiqing 1，2， DUAN Qiangjun 1，2， SHAO Jing 1，2，

WANG Tianming 1，2， WANG Changzhong 1，2*

（1Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Anhui University of

Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China；

2Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Anhui Academy of

Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China）

[Abstract]To study the inhibitory effect of butyl alcohol extract of Baitouweng decoction（BAEB） on Candida albicans cell membrane The effects of BAEB on the activity of C albicans were observed by Spot assay The changes of intracellular osmotic pressure of C albicans after BAEB intervention were detected by microtiter plate reader The effect of BAEB on cell membrane permeability of C albicans were observed by fluorescence microscopy The content of ergosterol in C albicans cell membrane was detected by high performance liquid chromatography， and the expression of ergosterol biosynthesis related genes in cell membrane was detected by qRTPCR The results showed that the activity of C albicans was significantly decreased in 256， 512 and 1 024 mg·L-1 BAEB group The intracellular glycerol content of C albicans was significantly increased in 512 and 1 024 mg·L-1 BAEB group（P<005） The gene HOG1 associated with intracellular osmotic pressure of C albicans was downregulated by 91， 93 and 55 times， respectively C albicans with red fluorescent were increased significantly in 512 and 1 024 mg·L-1 BAEB group The peak area of ergosterol in the 1 024 mg·L-1 BAEB group was 35884 95， with a significant difference（P<005）； ERG1， ERG2， ERG3， ERG4， ERG5， ERG6， ERG10， ERG11， ERG13， ERG24， ERG25， ERG251， ERG26 and UPC2 were downregulated by 658， 489， 415， 924，341， 984， 308， 750， 553， 590， 245， 325，198 and 1007 times respectively in 1 024 mg·L-1 BAEB group The study indicated that BAEB could inhibit ergosterol and its biosynthesis related genes expression in the cell membrane and inhibit the activity of C. albicans.endprint

[Key words]butyl alcohol extract of Baitouweng decoction； Candida albicans； cell membrane； ergosterol

白念珠菌是最常見的條件致病性真菌，常存在于口咽、胃腸道和陰道黏膜表面。正常情況下，白念珠菌一般不會引起人類疾病，但當宿主局部微環(huán)境失調(diào)或黏膜屏障受損時， 可造成黏膜感染，引起鵝口瘡、外陰陰道念珠菌病、間擦疹等疾病[12]，嚴重者可侵入血管內(nèi)引起播散性感染[35]。

現(xiàn)有的抗真菌西藥毒副作用大，易耐藥[69]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方白頭翁湯（由白頭翁、黃柏、黃連、秦皮組成）正丁醇提取物（butyl alcohol extract of Baitouweng decoction，BAEB）毒性低且具有顯著抑制白念珠菌的作用[1012]，但其作用機制不詳，本實驗以白念珠菌的基本結(jié)構(gòu)細胞膜為切入點，以探討B(tài)AEB對白念珠菌的抑制作用機制。

1材料

11菌株與藥物

白念珠菌標準株SC5314由第二軍醫(yī)大學藥學院姜遠英教授惠贈。白頭翁湯按白頭翁Pulsatilla chinensis （Bge） Regel 15 g、黃柏Phellodendron chinense Schneid 12 g、黃連Coptis chinensis Franch 6 g、秦皮Fraxini Cortex 12 g組成，購于安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學藥學院劉守金教授鑒定。使用80%乙醇70 ℃回流3 h后過濾，收集濾液，共重復(fù)回流3次，合并濾液分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取3次，萃取液65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)然后干燥結(jié)晶，得到白頭翁湯各溶劑提取物經(jīng)過活性篩選發(fā)現(xiàn)正丁醇提取物體外抗白念珠菌的活性最強，故本實驗以該提取物為供試藥；陽性對照藥氟康唑（fluconazole，F(xiàn)LZ）對照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號100314201204）。

12試劑

TotalRNA提取試劑、PCR反應(yīng)試劑（日本ToyoBo公司）；引物（上海生工生物工程有限公司）；RPMI1640液體培養(yǎng)基（上海玉博生物科技有限公司）；YPD培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)責任有限公司）；沙氏培養(yǎng)基（青島高科技海博生物技術(shù)有限公司）；甘油含量測定試劑盒（南京建成）；蛋白檢測試劑盒（碧云天）；PI熒光染料（上海BestBio貝博生物）；皂化劑（15%的氫氧化鈉乙醇溶液，本室配制）；麥角甾醇對照品（上海源葉生物科技有限公司）。

13儀器

CKX4132型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；DMI60000B倒置熒光顯微鏡（德國徠卡光學儀器公司）；ABI Spectra Max M2e多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；ABI7500熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1260 Infility）；色譜柱COSMOSIL 5C18MSⅡ柱（46 mm×250 mm，5 μm）。

2方法

21Spot assay檢測白念珠菌細胞活性[13]

從4 ℃保存的YPD培養(yǎng)平板上挑取單菌落白念珠菌，接種至液體沙氏培養(yǎng)液，37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，血細胞計數(shù)板計數(shù)，RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋至2×106 CFU/mL備用。將菌液稀釋成2×105 CFU/mL，再按10倍稀釋直至2×101 CFU/mL，取100 μL分別與100 μL終濃度為0，256，512，1 024 mg·L-1的BAEB和終濃度為128 mg·L-1的陽性對照藥氟康唑（FLZ）混合，依次取5 μL點種在固體沙氏培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)48 h后取出，觀察CFU生成情況并拍照。

22酶標儀檢測白念珠菌細胞內(nèi)滲透壓變化[14]

將1 mL（2×106 CFU/mL）菌液分別和1 mL終濃度為0，256，512，1 024 mg·L-1BAEB及終濃度為128 mg·L-1的FLZ混合，37 ℃培養(yǎng)12 h后，按照甘油含量測定試劑盒說明書檢測胞內(nèi)甘油總量，按照蛋白檢測試劑盒方法來測定樣品蛋白總量。根據(jù)甘油總量和蛋白總量來計算甘油含量：甘油含量=甘油總量/蛋白總量。

23熒光顯微鏡檢測白念珠菌細胞膜通透性變化[10]

取1 mL（2×106 CFU/mL）菌液分別與1 mL終濃度為0，256，512，1 024 mg·L-1BAEB和終濃度為128 mg·L-1的FLZ于6孔板中混合，37 ℃，培養(yǎng)12 h后，離心收集細胞，無菌PBS緩沖液洗3遍，重懸細胞濃度為1×106 CFU/mL，用PI熒光染料避光染色5 min，均勻涂抹在含有多聚賴氨酸的載玻片上，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

24HPLC檢測白念珠菌細胞膜麥角甾醇含量[1516]

取5支10 mL無菌試管，均加入2 mL 2×106 CFU/mL菌液，分別加入2 mL終濃度分別為0，256，512，1 024 mg·L-1BAEB和終濃度為128 mg·L-1的FLZ，37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)12 h，棄上清后，用無菌PBS清洗3次，每管均加入2 mL PBS和5 mL皂化劑混勻，80 ℃水浴皂化1 h，每隔15 min振搖1次，冷卻至室溫，每管加入5 mL石油醚劇烈振蕩3 min，重復(fù)萃取3次，合并萃取液，加入蒸餾水洗滌1次，劇烈振蕩3 min，取出醚層于60 ℃水浴揮發(fā)干即得未皂化酯（NSLs），加入1 mL甲醇充分混勻溶解，過濾后進樣10 μL進行HPLC分析。色譜條件：COSMOSIL 5C18MSⅡ色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇；檢測波長282 nm；柱溫室溫；流速1 mL·min-1。對照品配制：022 mg麥角甾醇溶于2 mL甲醇中，超聲溶解得110 mg·L-1麥角甾醇對照品溶液。endprint

25qRTPCR檢測細胞膜麥角甾醇生物合成相關(guān)基因的表達[10]

總RNA的提?。? mL菌液（2×106 CFU/mL）與2 mL終濃度分別為0，256，512，1 024 mg·L-1BAEB和終濃度為128 mg·L-1的FLZ混合，37 ℃孵育6 h后，離心收集菌體，用無菌PBS沖洗3次后進行總RNA提取，調(diào)節(jié)RNA濃度，使模板量一致，具體操作方法參照ToyoBo公司MagExtractorRNA提取試劑說明書進行。

26引物的設(shè)計與合成

基因序列從NCBI獲得，并用Oligo70軟件設(shè)計所需引物，委托上海生工合成引物，各引物情況見表1。

27逆轉(zhuǎn)錄cDNA

6 μL RNA預(yù)變性（65 ℃ 5 min，4 ℃ 1 min），后加入混合液（4×DNA Master Mix 55 μL和gDNA Remover 11 μL）2 μL，5RTMaster MixII 2 μL混合后按如下條件進行逆轉(zhuǎn)錄：50 ℃ 5 min；98 ℃ 5 min；4 ℃ 1 min反應(yīng)完成后將 cDNA稀釋10倍備用。

28實時熒光定量PCR反應(yīng)

采用SYBR熒光法，反應(yīng)體系25 μL：2×SYBRGreen Realtime PCR 125 μL，PCR forward primer（10 mol·L-1）1 μL，PCR reverse primer 1 μL，cDNA 05 μL，ddH2O 10 μL，在ABI7500熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件： 預(yù)變性 95 ℃ 60 s；擴增定量程序（amplification and quantification program）40個循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為：變性95 ℃ 15 s；退火50 ℃ 15 s；延伸72 ℃ 45 s；熔解曲線（melting curve）：60～95 ℃，加熱速率為01 ℃·s-1，內(nèi)參基因為ACT1，每個樣品均設(shè)置3個重復(fù)組，實驗重復(fù)3次。實時熒光定量PCR分別測定目的基因ERG1，ERG2，ERG3，ERG4，ERG5，ERG6，ERG10，ERG11，ERG13，ERG24，ERG25，ERG251，ERG26與UPC2及內(nèi)參ACT1的Ct值，實驗結(jié)果取其平均值，基因表達水平用倍數(shù)變化來表示（2-ΔΔCt法）。

29統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 23統(tǒng)計軟件分析處理，計量資料以±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析檢驗，P<005為有統(tǒng)計學差異。

3結(jié)果

31BAEB對白念珠菌細胞活性的影響

空白對照組白念珠菌細胞菌落數(shù)（CFU/mL）最多，細胞活性最好；BAEB干預(yù)下隨著濃度遞增，細胞菌落數(shù)逐漸減少，細胞活性減弱，見圖1。

32BAEB對白念珠菌細胞內(nèi)滲透壓的影響

與空白對照組相比，隨著BAEB濃度的遞增，白念珠菌胞內(nèi)甘油含量呈劑量依賴性升高，分別為（33751±05），（44464±09），（57193±43）μmol·g-1，其中512 mg·L-1BAEB組和1 024 mg·L-1BAEB組甘油含量升高，有顯著性差異（P<005），見圖2。qRTPCR 檢測滲透壓相關(guān)基因HOG1和RHR2的表達，HOG1分別下調(diào)為空白對照組的91，93，55倍，有顯著性差異（P<001），RHR2下調(diào)不明顯，見圖2。

33BAEB對白念珠菌細胞膜通透性的影響

熒光顯微鏡下，空白對照組幾乎看不到紅色熒光細胞，隨著BAEB濃度的增加，紅色熒光細胞逐漸增多。相對應(yīng)的明場視野下的菌體形態(tài)見圖3。

34BAEB對白念珠菌細胞膜麥角甾醇含量的影響

HPLC結(jié)果顯示：110 mg·L-1麥角甾醇對照品檢測出峰時間t為13266 min，峰面積為963091 31。

空白對照組t為13231 min，峰面積為60890 22；256 mg·L-1BAEB組t為13210 min，峰面積為41671 36；512 mg·L-1BAEB組t為13221 min，峰面積為36309 44；1 024 mg·L-1BAEB組t為13207 min，峰面積為35884 95。FLZ組未顯示峰，見圖4。

35BAEB對白念珠菌細胞膜麥角甾醇生物合成相關(guān)基因表達的影響qRTPCR結(jié)果顯示，1 024 mg·L-1BAEB干預(yù)組ERG1，ERG2，ERG3，ERG4，ERG5，ERG6，RG10，ERG11，ERG13，ERG24，ERG25，ERG251，ERG26與UPC2 分別下調(diào)658，489，415，924，341，984，308，750，553，590，245，325，198，1007倍；512 mg·L-1BAEB干預(yù)后，分別下調(diào)644，29，574，1042，348，

846，242，782，464，689，395，519，192，1872倍； 256 mg·L-1組分別下調(diào)1258，149，720，1264，412，1019，251，1179，689，1495，105，602，461，6971倍，見圖5。

4討論

抗真菌藥物根據(jù)作用機制或靶點分為抑制細胞膜麥角甾醇合成的唑類（如氟康唑等），抑制細胞壁β葡聚糖合成的棘白素類（卡泊芬凈等）以及抑制DNA合成的氟胞嘧啶等。但隨著抗真菌藥的廣泛應(yīng)用，白念珠菌耐藥情況越來越嚴重，亟需發(fā)掘新的抗真菌藥物。本課題組發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方白頭翁湯具有較強的抗白念珠菌作用，尤以其正丁醇提取部位（BAEB）的抗菌活性最強，但作用機制不詳。受現(xiàn)有抗真菌藥物作用靶點啟發(fā)，BAEB是否通過影響細胞膜等結(jié)構(gòu)而發(fā)揮其抗真菌作用成為本研究主要內(nèi)容。故本實驗擬研究BAEB對白念珠菌細胞膜的作用及機制。endprint

從Spot assay來看，BAEB干預(yù)組下白念珠菌菌落數(shù)（CFU/mL）明顯減少，BAEB可顯著抑制白念珠菌活性。細胞膜是白念珠菌的基本結(jié)構(gòu)，細胞膜的損傷會導(dǎo)致白念珠菌受到滲透壓力的脅迫，而高滲透壓力會激活胞內(nèi)的HOG通路合成更多的甘油以平衡滲透壓的改變[17]。1 024 mg·L-1BAEB組白念珠菌細胞內(nèi)甘油含量最高，有顯著性差異（P<005），滲透壓最高。此外，在基因水平上，256，512，1 024 mg·L-1的BAEB均使得HOG1明顯下調(diào)，而RHR2無明顯改變。

熒光染料碘化丙啶（PI）是可用于DNA染色的細胞核染色試劑，在嵌入雙鏈DNA后釋放20～30倍的紅色熒光。盡管PI不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色，從而間接提示細胞膜的損傷。熒光顯微鏡觀察顯示，空白對照組的白念珠菌紅色熒光細胞最少，1 024 mg·L-1BAEB組白念珠菌紅色熒光細胞最多，說明1 024 mg·L-1BAEB組細胞膜損傷最嚴重。

麥角甾醇是白念珠菌細胞膜的重要成分，由于其特殊的化學結(jié)構(gòu)，增加了細胞膜的堅固性，并參與其多項重要的生命活動，如保持細胞膜結(jié)合酶的活性及細胞活力，參與細胞物質(zhì)交換，對于維持細胞膜完整性及流動性十分重要，且參與白念珠菌的不對稱分裂等生理過程[18]。唑類藥物如FLZ能夠和羊毛甾醇的14α甾醇脫甲基酶（由ERG11編碼）活性位點中的血紅素基團相互作用，影響麥角甾醇合成途徑中羊毛甾醇的14α脫甲基作用，導(dǎo)致副產(chǎn)物14αmethy13，6diol的積累，改變細胞膜通透性和流動性[19]。HPLC結(jié)果顯示，空白對照組出峰時間t為13231 min，峰面積為60890 22，1 024 mg·L-1BAEB組t為13207 min，峰面積為35884 95，有顯著性差異（P<001）。麥角甾醇生物合成受一系列相關(guān)基因調(diào)控，qRTPCR顯示與白念珠菌麥角甾醇合成相關(guān)的基因ERG1，ERG2，ERG3，ERG4，ERG5，ERG6，ERG10，ERG11，ERG13，ERG24，ERG25，ERG251，ERG26與UPC2經(jīng)1 024 mg·L-1BAEB干預(yù)，分別下調(diào)658，489，415，924，341，984，308，750，553，590，245，325，198，1007倍，表明一定濃度的BAEB可能通過影響上述麥角甾醇相關(guān)基因的表達來抑制麥角甾醇的生物合成進而影響白念珠菌細胞膜的完整性。

綜上述研究顯示，BAEB能損傷白念珠菌基本結(jié)構(gòu)細胞膜，其抗白念珠菌作用機制可能與其有關(guān)，但詳細作用機制有待于進一步揭示。

[參考文獻]

[1]廖萬清. 21世紀真菌病學研究展望[J]. 上海醫(yī)學， 2000，23（3）： 132.

[2]Ruhnke M， Rickerts V， Cornely O A， et al. Diagnosis and therapy of Candida infections： joint recommendations of the German Speaking Mycological Society and the PaulEhrlichSociety for Chemotherapy[J]. Mycoses， 2011， 54（4）：279.

[3]潘搏. 白念珠菌甘露多糖疫苗評價及白念珠菌侵入人內(nèi)皮和上皮細胞動態(tài)觀察[D]. 上海：第二軍醫(yī)大學，2015.

[4]Guo F， Yang Y， Kang Y， et al. Invasive candidiasis in intensive care units in China： a multicentre prospective observational study[J]. Antimicrob Chemother， 2013， 68（7）：1660.

[5]Ma C F， Li F Q， Shi L N， et al. Surveillance study of species distribution， antifungal susceptibility and mortality of nosocomial candidemia in a tertiary care hospital in China[J]. Bmc Infect Dis， 2013， 13（1）：1.

[6]張瑾，高月平. 中藥治療陰道炎研究進展[J]. 實用中醫(yī)藥雜志，2009，25（2）：135.

[7]于曉虹，楊國玲，劉曉明，等. 氟康唑、特比萘芬和伊曲康唑?qū)Π咨钪榫捏w外敏感性試驗[J]. 中國皮膚性病學雜志，2008，22（11） ： 668.

[8]張文平，王小麗，黃真，等. 肉桂醛體外誘導(dǎo)白色念珠菌耐藥的實驗[J]. 中國臨床康復(fù)，2006，10（35） ： 148.

[9]陳文峰，張子平，程波. 抗真菌藥物的新作用靶點[J]. 中國真菌學雜志，2011，6（3）：190.

[10]張夢翔，陸克喬，夏丹，等. 白頭翁湯正丁醇提取物對白念珠菌VVC臨床株體外生物膜形成的抑制作用[J]. 中國真菌學雜志，2015，10（6）： 321.

[11]施高翔，汪云霞，馮鑫，等. 白頭翁湯正丁醇提取物誘導(dǎo)白念珠菌生物被膜細胞凋亡[J]. 中國真菌學雜志，2017， 12（1）：13.

[12]張夢翔，夏丹，施高翔，等. 白頭翁湯正丁醇提取物對堿性pH條件下白念珠菌VVC臨床臨床株形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響[J]. 中國中藥雜志，2015，40（4）：710.

[13]Sharma M， Manoharlal R， Puri N， et al. Antifungal curcumin induces reactive oxygen species and triggers an early apoptosis but prevents hyphae development by targeting the global repressor TUP1 in Candida albicans[J]. Biosci Rep，2010，30（6）：391.endprint

[14]Brewster J L， De V T， Dwyer N D， et al. An osmosensing signal transduction pathway in yeast[J]. Science， 1993， 259（5102）：1760.

[15]Pinto E， Afonso C， Duarte S， et al. Antifungal activity of xanthones： evaluation of their effect on ergosterol biosynthesis by highperformance liquid chromatography[J]. Chem Biol Drug Des，2011，77（3） ： 212.

[16]Sun S， Gao Y， Ling X， et al. The combination effects of phenolic compounds and fluconazole on the formation of ergosterol in Candida albicans determined by highperformance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Anal Biochem，2005，336（1） ：39.

[17]Gregori C， Schüller C， Roetzer A， et al. The highosmolarity glycerol response pathway in the human fungal pathogen Candida glabrata strain ATCC 2001 lacks a signaling branch that operates in baker′s yeast[J]. Eukaryot Cell，2007，6（9）：1635.

[18]曹立，譚軍艷，許雯倩，等. 白念珠菌生物被膜耐藥株麥角甾醇檢測的方法研究[J]. 口腔生物醫(yī)學，2013，4（2）：70.

[19]Ghannoum M A， Rice L B. Antifungal agents： mode of action， mechanisms of resistance， and correlation of these mechanisms with bacterial resistance[J]. Clin Microbiol Rev， 1999，12（4）：501.

[責任編輯張寧寧]endprint