潘琪，劉旭旭，彭浩然，蒲運丹，張永至，葉思涵，吳根土，青玲，孫現(xiàn)超

?

番茄的克隆及表達分析

潘琪，劉旭旭，彭浩然，蒲運丹，張永至，葉思涵，吳根土，青玲，孫現(xiàn)超

（西南大學(xué)植物保護學(xué)院，重慶400716）

【目的】克隆獲得番茄（，），分析其基因序列生物信息學(xué)特征和預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)特征，明確SYTA亞細(xì)胞定位和組織表達，并分析其在綠色熒光蛋白（green fluorescence protein, GFP）標(biāo)記的煙草花葉病毒（，TMV）侵染下的表達變化及其對TMV移動的影響，為明確SYTA在植物病毒侵染致病過程中的作用提供理論依據(jù)?！痉椒ā扛鶕?jù)番茄基因組含有的同源基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計克隆引物，采用RT-PCR技術(shù)克隆全長序列；應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析該基因的序列特征；使用MEGA 7.0對SYTA蛋白序列及其同源序列進行多序列比對，并構(gòu)建同源物種間系統(tǒng)進化樹；通過與GFP蛋白融合進行亞細(xì)胞定位；利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測番茄各部位的表達量以及在TMV脅迫的番茄中的表達變化；構(gòu)建植物瞬時表達載體pCV-SYTA-mGFP，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)在本氏煙草中瞬時表達，TMV-GFP攻毒，利用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測在本氏煙中瞬時表達SYTA時TMV-GFP的積累和移動情況?！窘Y(jié)果】克隆得到1 620 bp的基因開放閱讀框全長，序列比對及生物信息學(xué)分析表明，其編碼的氨基酸序列具有家族的典型特征，含有N端的跨膜區(qū)、胞間連接區(qū)和C端的兩個C2結(jié)構(gòu)域；多序列對比及系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，與茄科林生煙草、絨毛狀煙草等植物親緣關(guān)系較近，與黃瓜較遠(yuǎn)；亞細(xì)胞定位顯示SYTA定位于細(xì)胞質(zhì)膜。在番茄的根、莖和葉中的表達量從高到低依次為根＞葉＞莖；TMV-GFP侵染番茄導(dǎo)致其表達量在接種后第1天顯著上調(diào)，在第7天降至正常水平。在SYTA瞬時表達的本氏煙葉片部位接種TMV-GFP，TMV-GFP在接種第5天時已經(jīng)到達新葉，而接種部位僅表達空載體對照的本氏煙新葉中未觀察到TMV-GFP，且接種第5天時TMV-GFP在接種葉和新葉中的積累量均明顯高于其在空載體對照處理的葉片?！窘Y(jié)論】獲得的具有家族的典型特征。SYTA定位于細(xì)胞質(zhì)膜，在番茄根中表達量最高。在TMV-GFP脅迫下，番茄中表達呈現(xiàn)先上升后下降至正常水平。在本氏煙中瞬時表達SYTA有利于TMV-GFP侵染初期的積累和移動。

番茄；；克?。槐磉_分析；TMV-GFP

0 引言

【研究意義】番茄（）作為茄科植物的典型代表，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。而在全國各地番茄生產(chǎn)中，病毒病已成為重要病害之一。尤其在秋季發(fā)病率最為嚴(yán)重，可達10%—30%，有時甚至可達50%以上，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，并對番茄生產(chǎn)安全構(gòu)成威脅[1]。目前，隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，蔬菜病毒病的危害愈來愈嚴(yán)重，不僅危害范圍廣、經(jīng)濟損失大而且難以防治[2]。Synaptotagmin是一種膜轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛存在于內(nèi)分泌及神經(jīng)細(xì)胞上。它是囊泡融合中的Ca2+感受器，能夠觸發(fā)調(diào)節(jié)囊泡與質(zhì)膜之間的融合過程[3]，在蛋白質(zhì)及膜轉(zhuǎn)運過程扮演著重要的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥SYTA不但能夠調(diào)節(jié)核內(nèi)體的轉(zhuǎn)運循環(huán)，還可以影響植物病毒運動蛋白（movement protein，MP）介導(dǎo)的病毒基因組通過胞間連絲在植物細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運[4-5]。番茄基因組分析表明番茄中也存在的同源基因，明確SYTA的結(jié)構(gòu)、表達及其對病毒侵染移動的影響，對進一步解析SYTA在植物病毒侵染致病過程中的作用和尋找番茄病毒病防治策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Synaptotagmin最早是在大型致密核心囊泡（large dense core vesicle，LDCV）和突觸囊泡的膜表面上發(fā)現(xiàn)的抗原，1990年被命名為Synaptotagmin[6]。在動物中己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該家族16種以上的亞型，并且在植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)了該家族的6種亞型，命名為SYT A-F[7]。Synaptotagmin作為植物中第一個被發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞膜修復(fù)的蛋白質(zhì)[8]，能夠在植物細(xì)胞中廣泛表達，并且定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，基本結(jié)構(gòu)為囊泡內(nèi)腔的N末端為糖基化區(qū)；其后為4—62個氨基酸殘基組成的單連跨膜片段（transmembrane domain，TMD）；胞漿域包括連接片段和兩個串聯(lián)排列的C2結(jié)構(gòu)域（C2A和C2B）；最后是保守的C-末端[9]。其中C2結(jié)構(gòu)域平均長度約為135個氨基酸殘基，各自都由8個折疊和3個松散的環(huán)形結(jié)構(gòu)組成[10]。C2B的第7和第8個折疊中間有一個螺旋，C2A沒有[11]。目前，在動物SYTs的基因研究進展中對Syt1的了解較其余SYTs更詳細(xì)。Syt1在動物神經(jīng)系統(tǒng)和囊泡運輸中起著極其重要的作用[7,12]。而在植物中，僅在擬南芥中有關(guān)于SYTs的研究報道。Yamazaki等[13]發(fā)現(xiàn)擬南芥SYT1（也稱AtSytA）定位于細(xì)胞質(zhì)膜，在依賴Ca2+調(diào)控的植物細(xì)胞抗凍過程中維持質(zhì)膜的完整性和細(xì)胞活性，并在參與膜轉(zhuǎn)運過程等方面發(fā)揮重要作用。并且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥SYTA缺失后能使細(xì)胞膜的完整性下降，從而降低細(xì)胞活性[14]。Schapire等[15]認(rèn)為SYTA可能通過3種方式參與細(xì)胞膜的修復(fù)過程，即張力緩釋模型、囊泡融合模型、胞吞模型；高彬[16]對擬南芥進行了生物信息學(xué)分析，并分析在鹽脅迫下擬南芥的表達量，發(fā)現(xiàn)其受到高鹽環(huán)境的誘導(dǎo)，而功能的缺失會造成對鈣的敏感性降低，使細(xì)胞膜的不完整性進一步加劇，而過量表達可以提高植株對外源鈣的敏感性，提高植株對鹽脅迫的抗性；Kawamura等[17]對擬南芥進行冷處理時發(fā)現(xiàn)，的表達量隨耐受能力提高而增加。也有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥SYTA定位于核內(nèi)體，可直接與甘藍(lán)曲葉病毒（，CaLCuV）以及TMV的運動蛋白相互作用，并介導(dǎo)病毒在細(xì)胞間的運動[4-5]。Levy等[18]進一步證實了SYTA定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜的接觸點，是形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜接觸位點所必不可少的蛋白，并且在病毒細(xì)胞間運動時，質(zhì)膜組分能與SYTA發(fā)生互作而改變胞間連絲?！颈狙芯壳腥朦c】目前關(guān)于Synaptotagmin蛋白家族的研究多是集中在哺乳動物上，植物上僅有對模式植物擬南芥SYTA進行研究。番茄作為茄科植物的典型代表，基因組分析發(fā)現(xiàn)其含有編碼的同源基因，但其功能尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以2012年完成的番茄基因組測序為基礎(chǔ)，設(shè)計引物，克隆，獲得其全長開放閱讀框，分析基因序列生物信息學(xué)特征和預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)特征，明確SYTA亞細(xì)胞定位和組織表達，并分析其在TMV脅迫下的表達變化及其對TMV侵染移動的影響，為深入研究茄科SYTA在植物病毒侵染致病過程中的作用提供參考。

1 材料與方法

試驗于2014年12月至2016年10月在西南大學(xué)植物保護學(xué)院分子植物病理實驗室內(nèi)進行。

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 本氏煙（）和番茄于西南大學(xué)植物保護學(xué)院分子植物病理實驗室溫室內(nèi)育苗盆中播種，培養(yǎng)至4—6葉期備用。

1.1.2 試劑與菌株 供試大腸桿菌（）DH5購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；植物總RNA提取試劑盒（LS1040）購自上海普洛麥格生物公司；限制性內(nèi)切酶I和I、Ex Taq DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A）購自TaKaRa公司；SYBR染料購自德國凱杰生物公司；植物表達載體pCV-mGFP-C1[19]由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳劍平研究員實驗室饋贈；根癌土壤農(nóng)桿菌株EHA105由筆者實驗室保存；煙草花葉病毒熒光標(biāo)記載體TMV-GFP（pSPDK661）[20]由清華大學(xué)劉玉樂教授實驗室饋贈。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 將種植至4—6葉期的番茄樣品，按照植物總RNA提取試劑盒使用說明書提取樣品的根、莖、葉片以及總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，編號后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2克隆 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中SYTA的同源序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計P1引物對（表1），以番茄cDNA為模板，PCR擴增全長序列。PCR反應(yīng)體系25 μL：10×Ex Taq Buffer（Mg2+）2.5 μL、MgCl22 μL、dNTP混合物2 μL、Primer（F1）1 μL、Primer（R1）1 μL、cDNA產(chǎn)物1 μL、Taq DNA聚合酶0.3 μL、最后加ddH2O補充至25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 1 min；94℃30 s；65℃ 30 s；72℃ 2 min；30個循環(huán)?；厥誔CR產(chǎn)物并與pGEM-T easy Vector載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送至華大生物技術(shù)有限公司測序。

表1 引物序列

1.2.3SYTA的生物信息學(xué)分析 根據(jù)獲得的cDNA序列，利用NCBI站點的ORF Finder（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）推測開放閱讀框，NetNGlyc1.0server分析SYTA蛋白質(zhì)的糖基化位點。SingaIP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）分析信號肽，TMHMM Server2.0（http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測跨膜區(qū)域等[21]。利用SMART在線服務(wù)器（http://smart.embl-heidelberg. de/）分析蛋白結(jié)構(gòu)域。使用在線軟件ProtParam（http:// web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)氨基酸的理化性質(zhì)；使用DNAMAN分析SYTA與其他物種同源基因的一致性。在線預(yù)測SYTA三維空間結(jié)構(gòu)（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/help.cgi?id=help/faq），用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進化樹。

1.2.4SYTA的亞細(xì)胞定位 用I和I對質(zhì)粒pGEM-SYTA和pCV-mGFP分別進行雙酶切，構(gòu)建植物融合表達載體pCV-SYTA-mGFP，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5中，篩選陽性克隆進行測序檢驗。采用熱激法將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中[22]。選取培養(yǎng)至4—6葉期健壯的本氏煙，將含陽性克隆的農(nóng)桿菌重懸液采用注射法浸染本氏煙葉片[23]，48 h后將注射孔部位的葉片表皮組織制作成臨時玻片，倒置于共聚焦熒光顯微鏡觀察本氏煙表皮細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達情況。

1.2.5表達分析 番茄培育至4—6葉期后，含TMV-GFP的粗提病毒粒子以摩擦接種侵染番茄葉片，侵染7 d，設(shè)置健康對照，取TMV-GFP接種后1、3和7 d的番茄葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用qRT-PCR分析在不同組織部位的表達及在TMV脅迫下的表達變化，以番茄為內(nèi)參基因，熒光定量反應(yīng)引物對分別為P2、P3（表1），按照QuantiNova SYBR? Green PCR Kit使用說明進行，每個樣品設(shè)有3次重復(fù)。反應(yīng)條件：95℃3 min，95℃30 s，55℃ 30 s，變性到延伸循環(huán)40次。采用2-△△CT相對定量分析法計算基因的相對表達量，并用SPSS 16.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進行差異顯著性分析[24]。

1.2.6SYTA對TMV侵染的影響 將含有pCV-SYTA-mGFP的農(nóng)桿菌重懸液用注射法浸潤4—6葉期的本氏煙葉片，以含有pCV-mGFP的重懸液處理作為空白對照，2 d后用含TMV-GFP的重懸液注射侵染原接種葉的同一部位。TMV-GFP注射3 d后，開始在紫外燈下觀察TMV-GFP的移動情況，連續(xù)觀察、拍照記錄并收集3、5、10 d的接種葉及新葉葉片，每個時間點設(shè)置3個生物重復(fù)。利用間接ELISA法檢測病毒的含量，分別取TMV-GFP注射接種后3、5及10 d的接種葉和新葉樣品0.2 g，加入2 mL CBS（0.05 mol·L-1）一起研磨，5 000 r/min離心5 min，取上清液注入酶標(biāo)板，重復(fù)3次，置于4℃包被過夜后，用PBST（0.01 mol·L-1）洗滌3次，每次3 min，加入150 μL封閉液（0.01 mol·L-1PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5%），37℃孵育0.5 h后，用PBST洗滌3次。加入TMV的一抗（1﹕1 000封閉液稀釋），于37℃孵育2 h后用PBST洗滌3次。加入HRP標(biāo)記的二抗（1﹕ 5 000）37℃孵育2 h后用PBST洗滌3次。添加底物緩沖液（100 mL底物緩沖液內(nèi)含有5.677 g Na2HP04，0.56 g檸檬酸，40 mg OPD和40 μL 30% H2O2，臨用前用去離子水配制）37℃靜置15—20 min（避光反應(yīng)），待顯示結(jié)束添加酶終止劑（98%濃硫酸，按1﹕9倒入去離子水中配制）。底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，可根據(jù)顏色深淺進行定性或定量分析[25-27]。利用酶標(biāo)儀（BIO-Tek，USA）測定OD492的值，當(dāng)處理組與健康植株對照組的OD492比值＞2時，待測樣品判斷為陽性，存在TMV侵染。

2 結(jié)果

2.1序列及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析

引物對P1自番茄cDNA中克隆出，測序結(jié)果表明其片段大小為1 620 bp（圖1），上傳至GenBank獲得登錄號為KR005629。根據(jù)NCBI工具ORF Finder預(yù)測結(jié)果，具有1 620 bp完整開放閱讀框，編碼539個氨基酸。糖基化位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)，存在3個潛在的N端糖基化位點，分別為N153、N371及N505。通過蛋白質(zhì)跨膜區(qū)段預(yù)測發(fā)現(xiàn)蛋白序列中具有一個跨膜區(qū)段，為所編碼氨基酸第7—29位置。SingaIP 4.1分析其無信號肽位點。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其具有N端的跨膜區(qū)、中間連接區(qū)和C端的兩個C2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域為Synaptotagmin所特有，因此，推測屬于家族。

M：低分子量核酸marker BM5000+1.5K Low molecular DNA marker BM2000+1.5K；1、2：陰性對照Negative control；3：S.l SYTA

通過ProtParam預(yù)測顯示，SYTA蛋白的理論分子量61.3723 kD，等電點6.85，分子式為C2788H4411N715O793S23。酸性氨基酸殘基總數(shù)為73，堿性氨基酸殘基總數(shù)為72，脂肪指數(shù)為92.13，親水性平均數(shù)為-0.298，預(yù)測該蛋白為親水性蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)為32.59，屬于穩(wěn)定蛋白。該蛋白中相對含量比較多的氨基酸為亮氨酸Leu（L）與賴氨酸Lys（K）（55個，占10.2%）、纈氨酸Val（V）（49個，占9.1%）、谷氨酸Glu（E）與脯氨酸Pro（P）（38個，占7.1%）及天冬氨酸Asp（D）（35個，占6.5%），而相對含量最少的氨基酸為半胱氨酸Cys（C）（6個，占1.1%）。

根據(jù)Phyre2參照synaptotagmin 2模型（PDB編號c4p42B）預(yù)測SYTA的三維空間結(jié)構(gòu)圖（圖2）。SYTA模型有84%的覆蓋率，可信度＞90%（圖2-A）；擬南芥SYTA覆蓋率78%，可靠度100%（圖2-B）。從三維圖中可以發(fā)現(xiàn)SYTA包括無規(guī)則卷曲（占16%）、螺旋（占22%）、折疊（占42%），而擬南芥SYTA（NM_127668）包括無規(guī)則卷曲（占13%）、螺旋（占22%）、折疊（占41%）。

2.2編碼氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹

將的核苷酸及氨基酸序列與擬南芥、林煙草、絨毛狀煙草、胡楊、黑鼠、芝麻、番茄基因組、可可和黃瓜9個物種的核苷酸及氨基酸序列進行比對，氨基酸相似性分別為73.3%、91.1%、91.1%、79.4%、20.0%、82.9%、99.8%、80.7%和71.3%（表2），總體上與茄科植物的同源性最高，在91%以上。利用MEGA 7.0軟件將與上述物種序列進行聚類分析（圖3），結(jié)果顯示其與林煙草、絨毛狀煙草等植物親緣關(guān)系較近，與黃瓜較遠(yuǎn)，屬于植物類大分支。

A圖像繪制從N → C 端；模型尺寸(?)：X：73.431、Y：67.451、Z：65.895；B圖像繪制從N → C端；模型尺寸（?）：X：72.027、Y：66.611、Z：66.481。綠色螺旋代表α螺旋，藍(lán)色箭頭表示β折疊和微弱的線表示卷曲Image A colored by rainbow N → C terminus; Model dimensions (?): X: 73.431, Y: 67.451, Z: 65.895; Image B colored by rainbow N → C terminus; Model dimensions (?): X: 72.027, Y: 66.611; Z: 66.481. Green helices represented α-helices, blue arrows indicated β-strands and faint lines indicated coil

2.3SYTA的亞細(xì)胞定位

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)在本氏煙葉片細(xì)胞中表達SYTA-mGFP融合蛋白，2 d后在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示SYTA分布于本氏煙表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜，且存在不連續(xù)的聚集，與擬南芥SYT1在本氏煙表皮細(xì)胞中表達定位相似[13]（圖4）。

表2 不同物種SYTA核苷酸與氨基酸相似性比較

圖3 基于不同物種SYTA的氨基酸構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

圖4 S.l SYTA 在本氏煙中的亞細(xì)胞定位

2.4的表達分析

2.4.1在番茄不同部位的表達 在番茄的不同組織部位中呈現(xiàn)出了不同的表達模式，在番茄根中相對表達量最高，其次是葉，而在莖中的相對表達量相對較低（圖5）。

2.4.2 在TMV脅迫下的表達 隨著TMV脅迫時間的增加，表達量也發(fā)生變化。在接種后第1天時相對表達量呈現(xiàn)顯著的上調(diào)，達到緩沖液處理對照的2倍；第3天時相對表達量雖然下降，但仍然高于對照，到第7天時基本恢復(fù)到了與緩沖液處理對照一致的水平（圖6）。

2.4.3SYTA對TMV侵染的影響 在相同濃度的TMV-GFP處理下，SYTA瞬時表達的本氏煙及pCV-mGFP空載體對照中TMV呈現(xiàn)出不同的積累。在TMV侵染3 d后，SYTA瞬時表達的本氏煙及pCV-mGFP對照的接種葉上可以觀察到明亮的綠色熒光，且接種葉與健康植物的OD492比值均＞2，表明TMV已經(jīng)在葉片中積累表達；而它們的新葉都未觀察到有綠色熒光表達，并且新葉與健康植物的OD492比值均＜2，表明TMV均未侵染移動至新葉。第5天時，在SYTA瞬時表達的本氏煙新葉上觀察到有少量的綠色熒光，且新葉與健康植物的OD492比值＞2，TMV已經(jīng)侵染到了SYTA瞬時表達的本氏煙新葉上；而在表達pCV-mGFP空載體對照的本氏煙中未觀察到綠色熒光，新葉與健康植物的OD492比值＜2，TMV未侵染移動到新葉上，且TMV在接種葉和新葉中的積累量均明顯高于其在pCV-mGFP對照處理的葉片；第10天時，表達pCV-mGFP對照的本氏煙的新葉開始觀察到有少量綠色熒光，且新葉與健康植物的OD492比值＞2，TMV侵染移動到對照組的新葉上。這一結(jié)果說明SYTA對TMV的侵染移動具有一定的促進作用（圖7）。

圖中所標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

圖6 在TMV脅迫下S.l SYTA的表達量

A：S.l SYTA瞬時表達的本氏煙中TMV的侵染移動情況 Symptoms of TMV-GFP infected N. benthamiana transiently expressed S.l SYTA under the UV light；B：ELISA檢測不同處理本氏煙中TMV含量 Analysis of the accumulation levels of TMV in N. benthamiana under S.l SYTA treatment by enzyme-linked immunosorbent assay

3 討論

Synaptotagmin是一個廣泛存在于內(nèi)分泌及神經(jīng)細(xì)胞上的蛋白質(zhì)家族。在Ca2+依賴性神經(jīng)遞質(zhì)和激素釋放過程中，作為囊泡融合中的Ca2+感受器，能夠觸發(fā)調(diào)節(jié)囊泡與質(zhì)膜之間的融合過程，在蛋白質(zhì)及膜轉(zhuǎn)運過程中扮演著重要的作用[28-29]。在哺乳動物中關(guān)于SYT1功能了解得較多，SYT1在動物神經(jīng)系統(tǒng)囊泡運輸過程中起著極重要的作用，其余SYTs在動物神經(jīng)系統(tǒng)或其他組織中行使運輸功能[30]。植物中SYTs研究較少，僅見擬南芥中有關(guān)于SYTA功能研究的報道。本研究利用RT-PCR技術(shù)成功克隆了，通過的跨膜區(qū)、二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示，SYTA在整體結(jié)構(gòu)上與擬南芥SYTA相似，含有1個跨膜區(qū)和2個核心區(qū)C2A和C2B。但三維結(jié)構(gòu)顯示二者在無規(guī)則卷曲（含轉(zhuǎn)角）部位差異明顯。在跨膜區(qū)和2個核心區(qū)C2A和C2B，二者分別有5、38和27個氨基酸差異。其與擬南芥SYTA的核苷酸和氨基酸的同源性對比分別是72.4%和73.3%，明顯低于與茄科煙草之間的同源性（91%以上），也低于其與胡麻科的胡麻和楊柳科胡楊的同源性。因此，推測雖然同屬于SYT家族，其功能可能與擬南芥存在一定的差異性。

關(guān)于植物SYTA的定位，Yamazaki等[13]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥SYT1定位于細(xì)胞質(zhì)膜，Sondra研究組最初發(fā)現(xiàn)擬南芥SYTA主要定位于細(xì)胞膜上衍生出的內(nèi)核體上[4]，后來進一步確認(rèn)其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜的接觸點[18]。本研究在煙草表皮細(xì)胞中表達SYTA-GFP，共聚焦觀察SYTA主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜，并且沿著細(xì)胞壁不連續(xù)排列，與LEWIS等報道結(jié)果一致[4]。因為沒有精細(xì)的定位marker，所以不能夠進一步確定SYTA是否也是在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜的接觸點。

田文鵬[31]在關(guān)于擬南芥SYTs家族的研究中發(fā)現(xiàn)，擬南芥SYTA在葉中的表達量相對較高。而在番茄中，SYTA在根中的表達量最高，出現(xiàn)這一組織表達差異的原因尚不明確。Levy等[18]證實了SYTA是形成ER-PM接觸位點所必需的，MPTVCV與SYTA互作以形成病毒運動的復(fù)制位點。那么在TMV脅迫時，它在植物中的表達量是否會發(fā)生變化？本研究對6葉期的番茄進行TMV侵染，利用qRT-PCR檢測的表達量，發(fā)現(xiàn)在葉片中的表達呈現(xiàn)出先上升后下降，最后又恢復(fù)至正常。出現(xiàn)這一結(jié)果可能是番茄中SYTA對病毒侵染作出的積極響應(yīng)，大量表達來促進病毒侵染初期的細(xì)胞間移動。

在擬南芥SYTA突變體植株中，CaLCuV系統(tǒng)性侵染減慢，TMV和CaLCuV的運動蛋白在細(xì)胞間的移動受到抑制[4-5]。那么SYTA是否也能影響病毒在植物中的移動？本研究在本氏煙中瞬時表達SYTA，并用TMV以農(nóng)桿菌注射侵染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，在SYTA瞬時表達的本氏煙中，TMV的移動速度明顯增快，說明SYTA與擬南芥SYTA功能類似，對TMV在植物中的移動具有一定的促進作用。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是在瞬時表達SYTA的煙草細(xì)胞部位，SYTA通過調(diào)節(jié)胞間連絲促進了TMV侵染葉片初期的細(xì)胞間移動，使TMV在侵染初期得到在侵染點更快的擴散。

4 結(jié)論

全長1 620 bp，編碼蛋白具有類似于擬南芥SYTA蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，1個跨膜結(jié)構(gòu)域（從羧基端到氨基端）、1個連接鏈和2個處于胞質(zhì)中的C2結(jié)構(gòu)域，屬于SYT蛋白家族。SYTA主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜，在細(xì)胞質(zhì)周緣有少許分布。SYTA在根中的表達量最大。SYTA可能通過促進TMV在侵染初期的細(xì)胞間移動促進了TMV在本氏煙中的移動速度，并且在TMV侵染初期，積極響應(yīng)大量表達來促進病毒在番茄細(xì)胞間移動。

References

[1] 劉艷芝, 馬井玉, 徐祥文, 王付彬, 王淑霞. 1%香菇多糖水劑防治番茄病毒病田間藥效試驗. 蔬菜, 2014(6): 7-8.

LIU Y Z, MA J Y, XU X W, WANG F B, WANG S X. Field control efficacy experiment of 1% lentinan agent to prevent tomato virus disease., 2014(6): 7-8. (in Chinese)

[2] 呂佩珂, 李明遠(yuǎn), 吳鉅文. 中國蔬菜病蟲原色圖譜. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002.

Lü P K, LI M Y, WU J W.. Beijing: China Agriculture Press, 2002. (in Chinese)

[3] Yoshihara M, Montana E S. The synaptotagmins: calcium sensors for vesicular trafficking., 2004, 10(6): 566-574.

[4] Lewis J D, Lazarowitz S G.synaptotagmin SYTA regulates endocytosis and virus movement protein cell-to-cell transport.,2010, 107(6): 2491-2496.

[5] Uchiyama A, Shimada-Beltran H, Levy A, Zheng J Y, Javia P A, Lazarowitz S G. Thesynaptotagmin SYTA regulates the cell-to-cell movement of diverse plant viruses.,2014, 5: Article 584.

[6] Perin M S, Fried V A, Mignery G A, Jahn R, Südhof T C. Phospholipid binding by a synaptic vesicle protein homologous to the regulatory region of protein kinase C., 1990, 345(6272): 260-263.

[7] Craxton M. Synaptotagmin gene content of the sequenced genomes., 2004, 5(1): 43.

[8] Jensen R B, Lykke-Andersen K, Frandsen G I, Nielsen H B, Haseloff J, Jespersen H M, Mundy J, Skriver K. Promiscuous and specific phospholipid binding by domains in ZAC, a membrane-associatedprotein with an ARF GAP zinc finger and a C2 domain., 2000, 44(6): 799-814.

[9] Perin M S, Brose N, Jahn R, Sudhof T C. Domain structure of synaptotagmin (p65).,1991, 266(1): 623-629.

[10] Bai J, Chapman E R. The C2 domains of synaptotagmin-partners in exocytosis., 2004, 29(3): 143-151.

[11] Rizo J, Südhof T C. C2-domains, structure and function of a universal Ca2+-binding domain.,1998, 273(26): 15879-15882.

[12] Geppert M, Goda Y, Hammer R E, Li C, Rosahl T W, Stevens C F, Südhof T C. Synaptotagmin I: a major Ca2+sensor for transmitter release at a central synapse., 1994, 79(4): 717-727.

[13] Yamazaki T, Kawamura Y, Minami A, Uemura M. Calcium-dependent freezing tolerance ininvolves membrane resealing via synaptotagmin SYT1., 2008, 20(12): 3389-3404.

[14] Bai J, Tucker W C, Chapman E R. PIP2increases the speed of response of synaptotagmin and steers its membrane-penetration activity toward the plasma membrane., 2004, 11(1): 36-44.

[15] Schapire A L, Valpuesta V, Botella M A. Plasma membrane repair in plants.,2009, 14(12): 645-652.

[16] 高彬. 擬南芥SYTA基因在鹽脅迫響應(yīng)中的功能研究[D].濟南: 山東師范大學(xué), 2011.

GAO B. Response of theto salt stress[D]. Ji’nan: Shandong Normal University, 2011. (in Chinese)

[17] Kawamura Y, Uemura M. Mass spectrometric approach for identifying putative, plasma membrane proteins ofleaves associated with cold acclimation l., 2003, 36(2): 141-154.

[18] Levy A, Zheng J Y, Lazarowitz S G. Synaptotagmin SYTA forms ER-plasma membrane junctions that are recruited to plasmodesmata for plant virus movement.2015, 25(15): 2018-2025.

[19] Lu Y, Yan F, Guo W, Zheng H, Lin L, Peng J, Adams M J, Chen J.11-kDa protein granules move within the cytoplasm and traffic a host protein normally found in the nucleolus.,2011, 12(7): 666-676.

[20] Liu Y, Schiff M, Marathe R, Dinesh-Kumar S P. Tobacco,and/like genes are required for-mediated resistance to., 2002, 30(4): 415-429.

[21] Krogh A, Larsson B, Heijne G V, Sonnhammer EL L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes., 2001, 305(3): 567-580.

[22] 劉兆明, 劉宗旨, 白慶武, 方榮祥. Agroinfiltration在植物分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用.生物工程學(xué)報, 2002, 18(4): 411-414.

Liu Z M, Liu Z Z, Bai Q W, Fang R X. Agroinfiltration, a useful technique in plant molecular biology research., 2002, 18(4): 411-414. (in Chinese)

[23] Li Y, Geng Y, Song H, Zheng G, Huan L, Qiu B. Expression of a human lactoferrin N-lobe inwith-based agroinfection., 2004, 26(12): 953-957.

[24] 彭浩然, 潘琪, 魏周玲, 蒲運丹, 張永至, 吳根土, 青玲, 孫現(xiàn)超. 番茄抗性相關(guān)基因的克隆、表達與抗病毒功能. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(7):1242-1251.

PENG H R, PAN Q, WEI Z L, PU Y D, ZHANG Y Z, WU G T, QING L, SUN X C. Cloning, expression and anti-virus function analysis of tomato resistance-related gene., 2017, 50(7): 1242-1251. (in Chinese)

[25] 魏周玲, 彭浩然, 潘琪, 張永至, 蒲運丹, 吳根土, 青玲, 孫現(xiàn)超. 核糖體失活蛋白（-MC）亞細(xì)胞定位及對TMV 的抑制作用. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(5): 840-848.

WEI Z L, PENG H R, PAN Q, ZHANG Y Z, PU Y D, WU G T, QING L, SUN X C. Cloning, subcellular localization of the ribosome- inactivating protein-MC and its antiviral effect on TMV., 2017, 50(5): 840-848. (in Chinese)

[26] Voller A, Bartlett A, Bidwell D E, Clark M F, Adams A N. The detection of viruses by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)., 1976, 33(1): 165-167.

[27] 吳麗萍. 馬鈴薯兩種病毒的RT-PCR和ELISA檢測技術(shù)的研究[D]. 蘭州: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

Wu L P. Study on technology of detecting of two main virus of potato with ELISA and RT-PCR[D]. Lanzhou: Gansu Agricultural university, 2006. (in Chinese)

[28] Brose N, Petrenko A G, Sudhof T C, Jahn R. Synaptotagmin: a calcium sensor on the synaptic vesicle surface.1992, 256(5059): 1021-1025.

[29] 薛箭飛, 陳虹, 陳乃宏. Synaptotagmin在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中的作用. 生理科學(xué)進展, 2006, 37(1): 65-68.

XUE J F, CHEN H, CHEN N H. The role of Synaptotagmin in transmitter release., 2006, 37(1): 65-68. (in Chinese)

[30] Chen G H, Wang Y J, Qin S, Yang Q G, Zhou J N, Liu R Y. Age-related spatial cognitive impairment is correlated with increase of synaptotagmin 1 in dorsal hippocampus in SAMP8 mice.,2007, 28(4): 611-618.

[31] 田文鵬. 擬南芥synaptotagmin家族組織定位及非生物脅迫表達譜研究[D]. 蘭州: 蘭州大學(xué), 2011.

TIAN W P. Histochemical localization and expression profiling analysis under abiotic stresses of synaptotagmin family in[D]. Lanzhou: Lanzhou University, 2011. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 岳梅）

Cloning, Expression Analysis of

PAN Qi, LIU XuXu, PENG HaoRan, PU YunDan, ZHANG YongZhi, YE SiHan, WU GenTu, QING Ling, SUN XianChao

(College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】The objective of this study is to clone(), to analyze its bioinformatic characteristics, tissue expression and subcellular localization, the effect of green fluorescence protein (GFP) labeled(TMV) on the expression level of, its effect on the infection and movement of TMV and to provide a theoretical basis for further investigation of theinfluence on the process of the infection and movement of the plant viruses. 【Method】The primer pairs ofwere designed using Primer Premier 5.0 software based on the sequence of homologousin the genome ofthe. A complete coding sequence ofwas isolated and obtained by RT-PCR method. The sequence characteristics ofwas analyzed by bioinformatics tools. Multiple sequence alignments betweenand its homologous ones from other species and a phylogenetic tree of homologous species were made by MEGA 7.0. The subcellular localization ofSYTA was analyzed through fusing with GFP protein. The real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression ofin different tissues and the change of its expression level in the TMV-GFP infected. TheSYTA was transiently expressed in theby agroinfiltration, and then ELISA was used to detect the accumulation and movement of TMV-GFP. 【Result】A full-lengthof 1 620 bp was cloned fromSequence alignment and bioinformatics analysis revealed that the deduced amino acids ofhad common characteristics offamily with an N-terminal transmembrane region, a linker of variable size, and two C-terminal C2 domains. Furthermore,has the closest phylogenetic relationship to that of theandin amino acids sequences, and distanced from that ofSubcellular localization results showed thatSYTA was distributed at plasma membrane. The expression level ofin different tissues ofwas root＞leaf＞stem. The expression ofinobviously increased on the 1st day and decreased to the normal level on the 7th day after inoculation of TMV-GFP.Following the transient expression ofSYTA in, TMV-GFP was inoculated. After 5 days, TMV-GFP had moved to the new leaf of the. But no TMV-GFP was found in the new leaf of the controlin which the empty vectors were transiently expressed. ELISA assay results showed that the accumulation of the TMV-GFP in the samples under treatment was obviously higher than that in the control group after 5 days of TMV-GFP inoculation.【Conclusion】has the typicalcharacteristics of thefamily.SYTAlocated on theplasma membrane of epidermal cell of. Theexpressed highest in root of. Under the stress of TMV-GFP, the expression ofinobviously increased firstly and then decreased to the normal level. In theSYTA transient expression of, theSYTA could promote the initial accumulation and movement of TMV-GFP.

;; gene cloning; expression and analysis; TMV-GFP

2017-02-04；接受日期：2017-03-20

國家自然科學(xué)基金（31670148）、重慶市社會事業(yè)與民生保障創(chuàng)新專項（cstc2015shms-ztzx80012）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（XDJK2016A009，2362015xk04）

潘琪，E-mail：306077223@qq.com。通信作者孫現(xiàn)超，E-mail：sunxianchao@163.com