范子玲，許楚楚，舒適，肖鑫煥，王剛，白云龍，張江，趙暢，夏成

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基于GC/MS技術(shù)的產(chǎn)后卵巢靜止奶牛血漿代謝譜分析

范子玲，許楚楚，舒適，肖鑫煥，王剛，白云龍，張江，趙暢，夏成

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

【目的】運(yùn)用代謝組學(xué)中氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）篩選卵巢靜止奶牛和正常發(fā)情奶牛的血漿差異代謝物，探究奶牛發(fā)生卵巢靜止時(shí)其體內(nèi)代謝的變化?！痉椒ā吭诤邶埥∧臣s化牛場(chǎng)選取產(chǎn)后60—90 d，年齡、胎次、體況相近的經(jīng)產(chǎn)高產(chǎn)奶牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。根據(jù)奶牛的發(fā)情表現(xiàn)、直腸檢查、B超檢查及激素檢測(cè)的結(jié)果，將奶牛分為發(fā)情組（A）22頭和卵巢靜止組（B）20頭。應(yīng)用GC/MS對(duì)兩組奶牛的血漿樣品進(jìn)行檢測(cè)得到其代謝組圖譜，利用Chroma TOF軟件對(duì)得到的峰圖進(jìn)行分析，得到原始數(shù)據(jù)。將標(biāo)準(zhǔn)化的GC/MS數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P+14.0軟件包中，進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，先進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的主成分分析PCA來(lái)觀察各樣本之間的總體分布和整個(gè)分析過(guò)程的穩(wěn)定性，然后用有監(jiān)督的（正交）偏最小二乘法分析(O)PLS-DA來(lái)區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。為防止模型過(guò)擬合，采用七次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)的方法來(lái)考察模型的質(zhì)量。采用多維分析(O)PLS-DA和單維分析（-test）相結(jié)合的辦法，來(lái)篩選組間差異代謝物。在（O）PLS-DA分析中，變量權(quán)重值VIP＞1的變量為差異變量；在-test中，＜0.05的變量為差異變量。篩選VIP＞1且＜0.05的代謝物作為差異代謝物，最后采用KEGG途徑數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)兩組奶牛血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)差異代謝物通路富集及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析?！窘Y(jié)果】與正常發(fā)情奶牛相比，卵巢靜止奶牛血漿中共有20種代謝產(chǎn)物表現(xiàn)異常，其中17種差異表達(dá)代謝物與奶牛卵巢靜止的發(fā)生密切相關(guān)，包括水平增加的膽酸，水平下降的香草扁桃酸、煙酸甘氨酸、6-羥基煙酸、β-丙氨酸、L-酪氨酸、苯丙酮酸等，這些代謝產(chǎn)物參與了苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成，并參與了丙酸乙酯、煙酸煙堿、苯丙氨酸和酪氨酸的代謝，它們通過(guò)單一途徑或綜合途徑對(duì)奶牛卵泡的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生干擾，從而引起卵巢靜止。另外3種化合物亞氨基二乙酸、N-甲基-L-谷氨酸、3-氨基異丁酸可能與氨基酸代謝和細(xì)胞能量轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，其在奶牛卵巢靜止中的生物學(xué)作用有待進(jìn)一步證實(shí)?！窘Y(jié)論】應(yīng)用GC/MS技術(shù)有效的篩選出正常發(fā)情奶牛和卵巢靜止奶牛之間的血漿差異代謝物，這些差異代謝物提示奶牛產(chǎn)后發(fā)生卵巢靜止與體內(nèi)多種物質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。這為今后深入探索奶牛產(chǎn)后卵巢靜止的發(fā)病機(jī)理以及防治策略奠定了基礎(chǔ)。

氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；奶牛；卵巢靜止；多元統(tǒng)計(jì)分析；差異代謝物

0 引言

【研究意義】卵巢靜止是由奶牛產(chǎn)后卵泡生長(zhǎng)障礙，卵巢機(jī)能暫時(shí)性紊亂，卵泡不出現(xiàn)周期性活動(dòng)所造成。該病是高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后乏情發(fā)生的主要卵巢疾病[1]。而且，在奶牛遺傳改良和良好的管理?xiàng)l件下，奶牛產(chǎn)奶量不斷提高，但繁殖效率卻逐漸下降[2]。對(duì)于現(xiàn)代奶牛養(yǎng)殖業(yè)，繁殖率低下正嚴(yán)重制約著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與經(jīng)濟(jì)效益[3]。因此，奶牛卵巢靜止的發(fā)病機(jī)理以及防治已成為世界奶牛疾病領(lǐng)域的一項(xiàng)重要研究課題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】卵巢靜止的發(fā)生常與營(yíng)養(yǎng)、季節(jié)、泌乳量和應(yīng)激因素等有關(guān)。其主要原因是產(chǎn)后飼料中某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、維生素或生長(zhǎng)因子的缺乏，使得奶牛營(yíng)養(yǎng)狀況不良，抑制了GnRH和LH的分泌[4-5]，卵巢對(duì)激素的反應(yīng)性降低，引起卵巢靜止。另外，飼養(yǎng)管理不善，泌乳過(guò)度，子宮、卵巢疾病，全身性的疾病等也會(huì)引起卵巢靜止。代謝組學(xué)技術(shù)現(xiàn)已在獸醫(yī)領(lǐng)域中得到較多應(yīng)用。許楚楚等應(yīng)用核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）技術(shù)確立了奶牛產(chǎn)后乏情的差異代謝物[6]。然而，氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS）技術(shù)可以對(duì)血漿樣品進(jìn)行有效的定性定量分析，具有高效的分離率和良好的靈敏度[7]。孫玲偉等[8-9]應(yīng)用該技術(shù)篩選了酮病和亞臨床酮病以及脂肪肝奶牛血清代謝標(biāo)識(shí)物，豐富了酮病、脂肪肝的發(fā)病機(jī)理和評(píng)估疾病病情。【本研究切入點(diǎn)】有關(guān)奶牛卵巢靜止的病因、臨床病理學(xué)及其生殖激素等已有報(bào)道，但是缺乏全景式的、系統(tǒng)的深入研究，即沒(méi)有從整體對(duì)發(fā)生卵巢靜止的奶牛血液中代謝物進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)首次應(yīng)用GC/MS技術(shù)篩選卵巢靜止奶牛和健康奶牛血漿差異代謝物，確定其參與的代謝通路及其差異代謝物網(wǎng)絡(luò)，以便更好地了解卵巢靜止的發(fā)生機(jī)制，為預(yù)防卵巢靜止的發(fā)生奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2015年5月在黑龍江8511牛場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)選取年齡、胎次相近的年泌乳量10噸左右的健康經(jīng)產(chǎn)奶牛共206頭，作為試驗(yàn)動(dòng)物。按中國(guó)泌乳奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范管理，飼喂泌乳盛期全混日糧（TMR），主要成分：青貯32.60 kg，豆粕3.37 kg，濕玉米4.00 kg，膨大豆1.58 kg等；營(yíng)養(yǎng)水平：干物質(zhì)（DM）：40.84%、粗蛋白：16.51%；脂肪：5.98%；鈣：180.07 g；磷：89.96 g；酸性洗滌纖維（ADF）：16.63%；中性洗滌纖維（NDF）：30.97%；產(chǎn)奶凈能：1.66 mcal/DM。平均每頭奶牛每天的干物質(zhì)采食量為21 kg，每天榨乳3次，持續(xù)供應(yīng)干凈的水。

正常發(fā)情奶牛：在產(chǎn)后60—90 d表現(xiàn)發(fā)情癥狀，直腸檢查和B超檢查子宮、卵巢無(wú)異常，通過(guò)直腸檢查有優(yōu)勢(shì)卵泡的生長(zhǎng)，B超檢查卵泡大小為正常的15—20 mm。

卵巢靜止奶牛：產(chǎn)后60—90 d仍未見(jiàn)發(fā)情表現(xiàn)，直腸檢查和B超檢查子宮無(wú)異常，通過(guò)直腸檢查卵巢上沒(méi)有優(yōu)勢(shì)卵泡的生長(zhǎng)，B超檢查卵泡直徑小于8 mm。

根據(jù)奶牛發(fā)情和卵巢靜止判定標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)排除異常樣本，本試驗(yàn)共選取22頭表現(xiàn)發(fā)情且臨床檢查無(wú)其他疾病的健康奶牛為發(fā)情組（A），20頭無(wú)發(fā)情表現(xiàn)且臨床檢查無(wú)其他疾病的奶牛為卵巢靜止組（B）。試驗(yàn)動(dòng)物臨床資料及四種生殖激素水平見(jiàn)表1。

1.3 血液樣品采集

所有試驗(yàn)?zāi)膛Ｓ谏衔绮墒澈驼ト榍敖?jīng)尾靜脈采血，每頭采集全血10 mL并置于加有3—5滴肝素鈉的抗凝管中，將抗凝管緩慢倒置一次充分混勻后靜置。5 min低速（4 000 r/min）離心，將600 μL上清液放于1.5 mL離心管中，再進(jìn)行5 min高速（12 000 r/min）離心，將500 μL上清液放于1.5 mL離心管中，于-80℃冷凍保存，待測(cè)。

1.4 血液生殖激素分析

采用雙抗體夾心法測(cè)定奶牛血漿中P4、E2、FSH和LH的水平，F(xiàn)SH酶聯(lián)免疫分析試劑盒（SBJ- B0061）、LH酶聯(lián)免疫分析試劑盒（SBJ-B0064）、P4酶聯(lián)免疫分析試劑盒（SBJ-B0063）、E2酶聯(lián)免疫分析試劑盒（SBJ-B0062）均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.5 血液樣品GC/MS分析

1.5.1 樣品預(yù)處理 血漿樣品室溫下解凍后，每50 μL樣品中加入10 μL的L-2-氯-苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)物，漩渦震蕩10 s后，再加入150 μL甲醇-乙腈混合溶液進(jìn)行蛋白沉淀，渦旋震蕩1 min 后，-20℃靜置10 min；蛋白沉淀后的樣品在低溫下超聲提取5 min，之后置于-20℃，靜置10 min，隨后樣品在低溫下離心10 min（15 000 r/min，4℃），并提取150 μL上清液于玻璃衍生瓶中，衍生瓶中的液體用快速離心濃縮儀揮干成固體；之后在玻璃衍生瓶中加入15 mg·mL-1的甲氧胺鹽酸吡啶溶液80 μL，渦旋震蕩2 min，放入震蕩培養(yǎng)箱中37℃肟化反應(yīng)90 min；之后在樣品中加入含1%TMCS的BSTFA衍生試劑80 μL和20 μL的正己烷，渦旋震蕩2 min，70℃恒溫箱反應(yīng)60 min后樣本取出，室溫下放置30 min后進(jìn)行GC/MS分析。

1.5.2 測(cè)定條件 本試驗(yàn)的分析儀器為Agilent公司的7890A-5975C氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent，USA），采用無(wú)分流模式，在氣相色譜質(zhì)譜儀器中加入1 μL經(jīng)過(guò)衍生化的提取物，經(jīng)過(guò)毛細(xì)管柱后，樣品經(jīng)過(guò)分離進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。在質(zhì)譜儀中利用高純氦氣作中間載氣，氦氣負(fù)載的氣流速1.0 mL·min-1。氣相色譜的程序升溫為：15℃·min-1，50—125℃；5℃·min-1，125—210℃；10℃·min-1，210—270℃；20℃·min-1，270—305℃，305℃維持5 min。在進(jìn)樣口時(shí)的溫度為260℃，EI源溫度為230℃，電壓為-70 V。質(zhì)量掃描范圍：m/z 50—600，延遲5 min開(kāi)始采集，采集速度為20譜/秒。

1.5.3 GC/MS數(shù)據(jù)預(yù)處理 將GC/MS的原始數(shù)據(jù)經(jīng)ChromaTOF (v 4.34, LECO, St Joseph, MI)軟件進(jìn)行預(yù)處理，將數(shù)據(jù)矩陣（CSV格式）導(dǎo)出。分析樣本共得到380個(gè)特征，內(nèi)標(biāo)用于數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制。一些特別影響結(jié)果的峰被從峰圖中刪除，包括內(nèi)標(biāo)峰和任何已知的假陽(yáng)性峰（包括噪音、柱流失和衍生物化試劑峰），提出的矩陣經(jīng)過(guò)去冗余和峰合并后[10]，得到109個(gè)代謝物。用峰面積歸一化法對(duì)樣本質(zhì)譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化，得到歸一化的數(shù)據(jù)矩陣[11]。

1.5.4 代謝物的鑒定 差異代謝物的鑒定通過(guò)如下方式進(jìn)行：GC/MS工作站軟件會(huì)自動(dòng)地把每個(gè)化合物的特征離子片段譜（fragmentation patterns）的碎片質(zhì)荷比和豐度與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)、Feihn代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)離子片段譜庫(kù)比對(duì)，一般而言，匹配度超過(guò)70%的檢測(cè)物均可被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[12]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

發(fā)情奶牛和卵巢靜止奶牛臨床資料及四種生殖激素檢測(cè)結(jié)果用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析（one- way, ANOVA），肩注“*”表示差異顯著（＜0.05），肩注“**”表示差異極顯著（＜0.01）；血漿樣品的GC/MS標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P+14.0軟件包（Umetrics，Ume?，Sweden），進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，先采用無(wú)監(jiān)督的主成分分析（PCA）來(lái)觀察各樣本之間的總體分布和整個(gè)分析過(guò)程的穩(wěn)定性，然后用有監(jiān)督的（正交）偏最小二乘法(O)PLS-DA分析來(lái)區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。為防止模型過(guò)擬合，采用七次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)的方法來(lái)考察模型的質(zhì)量。采用多維分析(O)PLS-DA和單維分析（t檢驗(yàn)）相結(jié)合的辦法，來(lái)篩選組間差異代謝物。PLS-DA分析中，變量權(quán)重值（variable important in projection, VIP）大于1的變量被認(rèn)為是差異變量。篩選VIP＞1；＜0.05的代謝物作為差異代謝物，最后進(jìn)行差異代謝物代謝通路歸屬分析，采用KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)兩組奶牛血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)差異代謝物的互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析。

2 結(jié)果

2.1 血液生殖激素檢測(cè)

卵巢靜止組和發(fā)情組奶牛的年齡、胎次、體況和日均泌乳量沒(méi)有差異。發(fā)情組與卵巢靜止組相比，奶牛血中FSH，LH和P4含量無(wú)顯著的差異，而E2含量顯著的高于卵巢靜止組（表1）。

2.2 GC/MS檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 代謝物總離子圖（TIC）分析 對(duì)質(zhì)控樣本（QC）的GC/MS總離子流圖（TIC）進(jìn)行重疊，初步考察分析方法的重現(xiàn)性。由圖1可知，QC樣本質(zhì)譜峰的保留時(shí)間和相應(yīng)強(qiáng)度重現(xiàn)性都很好，說(shuō)明整個(gè)分析方法穩(wěn)定可靠。

表1 卵巢靜止奶牛和發(fā)情奶牛臨床資料及四種血漿生殖激素水平（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

表中同行間注“*”表示組間差異顯著（＜0.05）

Within the same row with “*” means significant difference (＜0.05)

2.2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)A組和B組樣本分別進(jìn)行PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析，得分圖分別見(jiàn)圖2—4。通過(guò)對(duì)PCA得分圖分析，可知A組樣本和B組樣本分離較為明顯，進(jìn)一步采用PLS-DA和OPLS-DA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從兩個(gè)得分圖可以得出A組和B組之間的代謝物存在顯著差異；排列試驗(yàn)結(jié)果顯示2和Q2值均大于0.5，且比值接近于1；A組與B組的OPLS-DA得分圖結(jié)合排列試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果共同提示所建的模型成立，說(shuō)明組間代謝出現(xiàn)了顯著性差異。

圖1 QC 樣本的總離子流圖（TIC）進(jìn)行重疊

2.2.3 差異代謝物篩選和代謝通路分析 通過(guò)VIP值和值共篩選出20種差異代謝物，通過(guò)KEGG通路分析進(jìn)一步篩選與奶牛代謝相關(guān)的代謝物共17種，如表2所示。表中列出17種代謝物在KEGG中匹配的ID、氣相色譜化合物的保留時(shí)間、篩選時(shí)VIP和值、卵巢靜止組相對(duì)于發(fā)情組的變化趨勢(shì)和差異代謝物以及主要參與的代謝通路。

由表2可知，有16種代謝物在卵巢靜止組含量低于發(fā)情組。它們涉及的通路包括氨基酸代謝，煙酸和煙堿的代謝，糖代謝和能量代謝等方面。僅膽酸的含量在卵巢靜止組明顯的高于發(fā)情組，與膽汁酸的生物合成有關(guān)。此外，通過(guò)CHEBI網(wǎng)站（http://www.ebi. ac.uk/ chebi/）查詢3種代謝物（亞氨基二乙酸、N-甲基-L-谷氨酸、3-氨基異丁酸）的生物功能，根據(jù)文獻(xiàn)資料顯示與奶牛的代謝通路無(wú)關(guān)，可能與細(xì)胞能量代謝傳導(dǎo)有關(guān)。

圖5顯示了通過(guò)值的負(fù)log計(jì)算出17種代謝物的豐度，并進(jìn)行通路富集分析。它們涉及較多的通路為苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成，其次為丙酸乙酯、煙酸煙堿、苯丙氨酸和酪氨酸代謝。

表2 奶牛卵巢靜止和發(fā)情組血漿差異代謝物

aPLS-DA模型中VIP值＞1；b值為t-檢驗(yàn)所得（閾值為0.05）；c“↓”表示卵巢靜止組比發(fā)情組含量低；“↑”表示卵巢靜止組比發(fā)情組含量高

aVariable importance in the projection (VIP) is obtained from PLS-DA models with value higher than 1.0;bThevalue is calculated from the student's t test;cCompared to the estrous cows, metabolites in the cows with ovarian inactivity are down-regulated expression (↓) and metabolites in the cows with ovarian inactivity are up-regulated expression (↑)

組A（發(fā)情組）：圓點(diǎn)（）；組B（卵巢靜止組）：方塊（）；t[1]和t[2]表示構(gòu)建模型的前兩個(gè)主成分；R2X和Q2分別代表模型可解釋的變量和模型的可預(yù)測(cè)度

組A（發(fā)情組）：圓點(diǎn)（）；組B（卵巢靜止組）：方塊（）；t[1]和t[2]表示構(gòu)建模型的前兩個(gè)主成分

3 討論

3.1 卵巢靜止與血液生殖激素的關(guān)系

卵巢靜止組和發(fā)情組FSH，LH和P4的含量無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)中發(fā)情奶牛樣品采集的時(shí)間為優(yōu)勢(shì)卵泡生長(zhǎng)至排卵階段，而FSH的含量在卵泡從開(kāi)始生長(zhǎng)至優(yōu)勢(shì)卵泡階段上升，在卵泡生長(zhǎng)至優(yōu)勢(shì)卵泡階段開(kāi)始下降，因而與沒(méi)有卵泡生長(zhǎng)的卵巢靜止奶牛的FSH水平相近。在優(yōu)勢(shì)卵泡的生長(zhǎng)階段，LH呈脈沖式分泌，其每天的變化不定[13]。KAWASHIMA等報(bào)道不排卵奶牛的LH脈沖的頻率相比排卵奶牛較低[14]。由于試驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)條件的局限性，僅能在60—90 d依據(jù)是否發(fā)情以及直腸檢查和B超檢查卵巢卵泡狀況隨機(jī)確立發(fā)情和卵巢靜止奶牛對(duì)應(yīng)的相近天數(shù)采集血液，再者，因未做到連續(xù)每2 h或在每天的同一時(shí)間點(diǎn)跟蹤采樣，因此，結(jié)果呈現(xiàn)為兩組奶牛的LH含量無(wú)顯著差異。P4在排卵后，黃體形成階段分泌增加，因而未排卵階段發(fā)情奶牛和卵巢靜止奶牛P4含量無(wú)顯著差異。相對(duì)于卵巢靜止組，發(fā)情組奶牛的E2水平顯著升高，在卵泡從初始卵泡生長(zhǎng)至優(yōu)勢(shì)卵泡時(shí)，卵泡分泌的E2會(huì)增加，而卵巢靜止奶牛的卵泡不生長(zhǎng)或停止生長(zhǎng)，因而發(fā)情組奶牛的E2含量顯著高于卵巢靜止組。Beam等[15]報(bào)道排卵奶牛在產(chǎn)后8—14 d產(chǎn)生第一次卵泡波時(shí)，E2水平比不排卵奶牛高。P4濃度在奶牛排卵沒(méi)有差異，在排卵后排卵奶牛的P4濃度高于不排卵奶牛。

組A（發(fā)情組）：圓點(diǎn)（）；組B（卵巢靜止組）：方塊（）；t[1]和t[2]表示構(gòu)建模型的前兩個(gè)主成分；R2和Q2分別代表模型的可解釋率和可預(yù)測(cè)度，兩者比值越接近1說(shuō)明模型越可靠

1：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis；2：丙酸乙酯代謝 Propanoate metabolism；3：煙酸和煙堿代謝 Nicotinate and nicotinamide metabolism；4：苯丙氨酸代謝 Phenylalanine metabolism；5：酪氨酸代謝 Tyrosine metabolism

3.2 卵巢靜止與差異代謝物的關(guān)系

目前，代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為有機(jī)體疾病模型和疾病生物標(biāo)記物篩選，疾病診斷和生物途徑表達(dá)的一個(gè)強(qiáng)有力的分析工具。本試驗(yàn)共篩選出20種差異代謝物，其中17種代謝物與奶牛體內(nèi)代謝密切相關(guān)。而且，卵巢靜止組相對(duì)于發(fā)情組，除膽酸含量升高外，其余16種代謝物含量均降低。通過(guò)差異代謝物的KEGG分析，總結(jié)了其參與的代謝通路，并對(duì)其可能的影響機(jī)制進(jìn)行討論。

3.2.1 氨基酸代謝異常 差異代謝物富集到的通路中，關(guān)于氨基酸代謝的較多，包括酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的生物合成，苯丙氨酸、丙酸乙酯和酪氨酸代謝。卵巢靜止組中，篩選到的差異代謝物L(fēng)-酪氨酸、β-丙氨酸和苯丙酮酸表達(dá)降低。L-酪氨酸和苯丙酮酸參與苯丙酮酸/色氨酸/酪氨酸的生物合成，L-酪氨酸和香草扁桃酸參與酪氨酸的代謝，這三種物質(zhì)在卵巢靜止組含量均下降，說(shuō)明這兩個(gè)通路的氨基酸合成減少或降解增加。在賴氨酸分解通路中，賴氨酸的下游產(chǎn)物，差異代謝物2-哌啶酸含量下降，由此推測(cè)賴氨酸在卵巢靜止奶牛體內(nèi)含量可能減少。另外兩個(gè)通路，在丙酸乙酯代謝中β-丙氨酸含量下降，且其下游產(chǎn)物羥基丁酸含量也下降，說(shuō)明此代謝通路合成減少或降解增強(qiáng)。在精氨酸脯氨酸代謝通路中，精氨酸和脯氨酸的上游代謝物，丁二胺含量在卵巢靜止組下降，由此推測(cè)精氨酸和脯氨酸含量應(yīng)下降，實(shí)際變化還應(yīng)用后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

氨基酸在卵泡生長(zhǎng)中有著至關(guān)重要的作用，許多研究通過(guò)卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)，驗(yàn)證了卵泡液中不同代謝物對(duì)卵泡生長(zhǎng)的作用。SINCLAIR等的研究表明，甘氨酸和丙氨酸是卵泡液中含量最豐富的兩種氨基酸[16]。這兩種氨基酸有許多功能與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)，除了合成蛋白，還可參與核苷酸的生物合成，滲透調(diào)節(jié)[17]和解銨類物質(zhì)的毒性[18]。Matoba等人用代謝組學(xué)方法比較體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞，分析其正常生長(zhǎng)和中途停止生長(zhǎng)條件下，卵泡液中代謝物的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘氨酸、L-丙氨酸和L-谷氨酸與卵泡生長(zhǎng)成正相關(guān)[19]。一些特定的氨基酸（甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸等）通過(guò)顆粒細(xì)胞攝取，進(jìn)而轉(zhuǎn)到卵母細(xì)胞中，只有絲氨酸和谷氨酸在整個(gè)發(fā)情周期都維持著相同模式[20]。這說(shuō)明氨基酸會(huì)進(jìn)入卵泡腔中支持顆粒細(xì)胞層的發(fā)育。本試驗(yàn)中L-酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、β-丙氨酸、脯氨酸在卵巢靜止奶牛體內(nèi)含量下降，提示產(chǎn)后奶牛體內(nèi)氨基酸含量下降會(huì)影響或阻礙卵泡生長(zhǎng)，進(jìn)而會(huì)促發(fā)卵巢靜止。因此，奶牛體內(nèi)氨基酸的充足和平衡對(duì)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育以及發(fā)情有很大的影響。

3.2.2 煙酸代謝異常 相對(duì)于卵巢靜止組，煙酸甘氨酸和6-羥基煙酸兩種代謝物在發(fā)情組的含量高，均參與煙酸和煙堿代謝，均為煙酸的下游代謝產(chǎn)物。煙酸作為輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD+ 和NADP+）的前體，在能量代謝中是重要的參與者，能維持細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，維持機(jī)體免疫功能，調(diào)控細(xì)胞的存活時(shí)間和細(xì)胞凋亡[21]。煙酸有強(qiáng)大的抗脂作用，可以在能量負(fù)平衡狀態(tài)下減少非酯化脂肪酸（NEFA）水平。其在體內(nèi)可以抑制脂肪細(xì)胞中腺苷環(huán)化酶的活性或增加環(huán)磷腺苷（CAMP）磷酸二酯酶的活性[22]，進(jìn)而抑制脂肪分解，減少血中NEFA濃度。卵巢靜止奶牛煙酸含量下降，從而造成脂質(zhì)分解成脂肪酸的能力增強(qiáng)，奶牛體內(nèi)脂肪酸含量增多。這不僅會(huì)造成脂肪肝綜合癥，還會(huì)增加細(xì)胞毒性，甚至造成細(xì)胞死亡[23]。此外，血中NEFA的增加可以引起卵泡液中脂肪酸的增加，會(huì)影響卵母細(xì)胞復(fù)合體的形態(tài)和胚胎的質(zhì)量[24]。卵母細(xì)胞周?chē)鼑亚鸺?xì)胞，一起構(gòu)成卵母細(xì)胞復(fù)合體（COC），直接與卵泡液接觸。卵丘細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間的間隙相連，且細(xì)胞間隙允許小分子代謝物在卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間相互聯(lián)系，促進(jìn)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟[25]。在卵泡液中，卵丘細(xì)胞是第一個(gè)受NEFA影響的代謝區(qū)域。之后卵母細(xì)胞從卵丘細(xì)胞攝取NEFA，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成中性脂肪，最后轉(zhuǎn)化成脂質(zhì)供后期胚胎的營(yíng)養(yǎng)[26]。在卵母細(xì)胞內(nèi)NEFA比例的增多可以通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)酰胺形成、線粒體釋放細(xì)胞色素C和激活半胱天冬酶來(lái)增加脂肪毒性[27]，進(jìn)而影響卵泡初期的生長(zhǎng)。

3.2.3 糖類代謝異常 差異代謝物核糖醇、海藻糖、塔格糖，分別參與戊糖葡萄糖酮酸轉(zhuǎn)換、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝等與糖代謝相關(guān)的三個(gè)通路。在卵巢靜止組，三種物質(zhì)的含量均降低，且其下游代謝產(chǎn)物丙酮酸、葡萄糖參與三羧酸循環(huán)。戊糖葡萄糖酮酸轉(zhuǎn)換通過(guò)D-核酮糖-5-磷酸進(jìn)入磷酸戊糖途徑（PPP）。通過(guò)5-磷酸核糖基二磷酸（PRPP）進(jìn)入嘌呤代謝途徑參與嘌呤生成和代謝。在嘌呤代謝中氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）含量下降，它參與嘌呤代謝生成尿酸，其下游產(chǎn)物二乙酸和羥胺都呈下降趨勢(shì)，分別參與乙醛酸和吡啶二甲酸二甲酯代謝、NH3代謝。葡萄糖是卵巢的重要能量來(lái)源。它可能會(huì)在卵巢中經(jīng)厭氧途徑代謝成乳酸。Nandi等研究了葡萄糖、乳酸、丙酮酸對(duì)體外培養(yǎng)的卵泡細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)卵泡直徑隨著卵泡液中葡萄糖濃度的增加而增加。在小卵泡中乳酸的濃度增加，這可能會(huì)改變卵泡細(xì)胞的能量來(lái)源[28]。卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞可以通過(guò)三個(gè)主要的通路利用葡萄糖：葡萄糖氧化（糖酵解，檸檬酸循環(huán)（TCA）和氧化磷酸化），戊糖磷酸途徑（PPP），或轉(zhuǎn)換成細(xì)胞外代謝，用于細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)張[29]。本試驗(yàn)結(jié)果涉及到三個(gè)與糖代謝相關(guān)的代謝通路，且在卵巢靜止組代謝物呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明卵巢靜止奶牛的糖代謝通路受阻，進(jìn)而影響糖酵解和磷酸戊糖途徑，使卵泡中ATP和嘌呤生成減少，從而影響細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞核的生長(zhǎng)和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持。

3.2.4 膽酸代謝異常 相對(duì)于發(fā)情組，卵巢靜止組膽酸含量高。由于膽酸參與膽汁酸的合成，膽酸含量的升高，提示奶牛膽汁酸合成增加或分泌減少，這與Sejersen的結(jié)果一致，當(dāng)奶牛泌乳開(kāi)始時(shí)肝臟合成膽汁酸的能力增強(qiáng)[30]。在泌乳期血清膽汁酸增加，同時(shí)膽固醇和甘油三酯也會(huì)增加[31]。膽汁酸通過(guò)膜受體的內(nèi)分泌信號(hào)，使G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1（GPBAR1），對(duì)細(xì)胞和器官發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[32]。由于GPBAR1的廣泛表達(dá)，膽汁酸可以在不同的組織調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。卵巢靜止奶牛體內(nèi)膽汁酸合成增加，從而影響GPBAR1的表達(dá)，進(jìn)而影響卵巢顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)。膽汁酸可以通過(guò)核受體亞家族NR1H4介導(dǎo)的NR0B2阻止靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制其他核受體，NR5A2[33]。NR0B2會(huì)通過(guò)其對(duì)核受體NR5A2的抑制作用抑制類固醇類急性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，因此，NR5A2對(duì)卵巢的功能有重要的作用[34]，并推測(cè)與膽汁酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)可能會(huì)對(duì)顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)有作用，這有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2.5 其他差異代謝物異常 亞氨基二乙酸是甘氨酸的一種氨基羧酸，是甘氨酸的一種衍生物[35]，其在卵巢靜止組含量下降。甘氨酸在卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中起到重要作用，但該衍生物的生物學(xué)作用尚不清楚。N-甲基-L-谷氨酸是谷氨酸的一種化學(xué)衍生物，是甲烷代謝的中間代謝產(chǎn)物。其由谷氨酸N-甲基甲胺酶催化甲胺和谷氨酸發(fā)生反應(yīng)生成。其也可以被甲基谷氨酸脫氫酶催化生成谷氨酸[36]。在卵巢靜止組，N-甲基-L-谷氨酸含量下降，但有關(guān)谷氨酸對(duì)奶牛卵巢靜止的影響尚不知曉。3-氨基異丁酸是胸腺嘧啶的分解產(chǎn)物，由運(yùn)動(dòng)的肌肉中釋放到血中，到達(dá)脂肪組織激活產(chǎn)熱基因，從而使得白色脂肪褐變。最近有人推斷，3-氨基異丁酸在細(xì)胞代謝中起作用，其燃燒脂肪調(diào)節(jié)胰島素，總膽固醇和甘油三酯的代謝[37]。在卵巢靜止奶牛體內(nèi)檢測(cè)到其含量下降，說(shuō)明卵巢靜止奶牛的細(xì)胞能量代謝可能處于減弱狀態(tài)，造成產(chǎn)能減少，從而影響卵泡生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選出了產(chǎn)后卵巢靜止奶牛血漿差異代謝物，揭示了奶牛卵巢靜止代謝輪廓以及可能的發(fā)病機(jī)理。相對(duì)于正常發(fā)情奶牛，卵巢靜止奶牛血漿中有20種代謝物表現(xiàn)異常，其中17種與卵巢靜止密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)卵巢靜止奶牛和發(fā)情奶牛不同代謝特征的分析，闡明了差異代謝物與奶牛卵巢的內(nèi)在聯(lián)系以及潛在的生物作用，并且新發(fā)現(xiàn)一些奶牛卵巢靜止的差異代謝物，為今后深入探討奶牛產(chǎn)后卵巢靜止的發(fā)生機(jī)制和防治措施提供了新的方向。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Plasma Metabolic Profiling of Postpartum Dairy Cows with Inactive Ovaries Based on GC/MS Technique

FAN ZiLing, XU ChuChu, SHU Shi, XIAO XinHuan, WANG Gang, BAI YunLong, ZHANG Jiang, ZHAO Chang, XIA Cheng

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Heilongjiang)

【Objective】This trial was designed to screen plasma differential metabolites between postpartum dairy cows with inactive ovaries and estrous cows and to clarify the changes of metabolites in dairy cows suffering from inactive ovaries by gas chromatography/mass spectrometry technique (GC/MS).【Method】Dairy cows which had similar age, parity and body condition score were selected at 60-90 d postpartum from an intensive dairy farm in Heilongjiang Province. According to clinical manifestations, B-ultrasound scan, rectal palpation and hormone tests, 22 cows were divided into estrous group (A) and 20 to the inactive ovaries group (B). All plasma samples were detected by GC/MS to obtain plasma metabolic profiles between the groups, and ChromaTOF software was used to analyze peak figures and obtain raw data. The standardized GC/MS data matrix was imported into SIMCA-p＋14 to conduct multivariate statistical analysis including principal component analysis (PCA) to observe the overall distribution between the samples and the stability of the whole analysis process, and (orthogonal) signal correction-partial least squares-discriminant analysis (O)PLS-DA to distinguish the overall differences in metabolic profiles between groups and find differential metabolites between groups. In order to prevent the model from over-fitting, the quality of the model was examined by seven cycles of reciprocal verification and 200 response sequencing tests. Differential metabolites between groups were screened by (O)PLS-DA and t-test. In the PLS-DA analysis, the variable weight value VIP＞1 was considered as the difference variable; in the t-test, the variable with＜0.05 was considered as the difference variable. The metabolites with VIP＞1 and＜0.05 were screened as differential metabolites. Finally, plasma differential metabolites between two groups were analyzed by KEGG pathway database including channel enrichment and interaction network construction.【Result】Compared to estrous cows, there were 20 differential metabolites in cows with ovarian inactivity, of which 17 differential metabolites were closely related to cows with ovarian inactivity, including level increased cholic acid and decreased vanillylmandelic acid, nicotinoylglycine, 6-hydroxynicotinic acid, beta-alanine, L-Tyrosine, phenylpyruvate and so on. These metabolites were involved in biosynthesis of phenylalanine, tyrosine and tryptophan, and metabolism of ethyl propionate, nicotinic acid, nicotine, phenylalanine and tyrosine. The normal growth of follicle in cows was interfered with these differential metabolites by a single or comprehensive pathway. The other three compounds, Iminodiacetic acid, N-Methyl-L-glutamic acid and 3-Aminoisobutyric acid, may be related to amino acid metabolism and cell energy transport, and their biological role in dairy cows’ inactive ovaries remains to be further confirmed.【Conclusion】The plasma differential metabolites between cows with inactive ovaries and estrous cows were identified effectively by GC/MS technology. These differential metabolites suggested that the occurrence of ovarian inactivity may be related with metabolic disorders of various substances. Results of this study will lay a foundation for further study on the pathogenesis, prevention and treatment of postpartum inactive ovaries in dairy cows.

gas chromatography/mass spectrometry; dairy cows; inactive ovaries; multivariate statistical analysis; differential metabolites

2016-09-18；接受日期：2017-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31372488）

范子玲，E-mail：973514036@qq.com。通信作者夏成，Tel：0459-6819202；E-mail：xcwlxyf@sohu.com