張亮 陸磊 侯文潔 周秋云 丁紅梓 王潔

·藥物研究·

優(yōu)化高效液相色譜法檢測萬古霉素的血藥濃度

張亮 陸磊 侯文潔 周秋云 丁紅梓 王潔

目的建立人血漿中萬古霉素的高效液相色譜檢測方法，為臨床給藥方案提供參考。方法采用6%高氯酸沉淀血漿中的蛋白，以乙腈-0.05 mol/L三氟乙酸(22∶3)為流動相，流速1 ml/min，檢測波長280 nm。結(jié)果萬古霉素在1.56～100 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度的偏差<5%，批內(nèi)、批間精密度<8%，在室溫放置8、16、24 h及-20℃放置15 d后，萬古霉素保持穩(wěn)定，偏差小于5%。結(jié)論本方法測定萬古霉素血藥濃度具有準(zhǔn)確和靈敏度高的特點，適合在治療藥物監(jiān)測的應(yīng)用中進(jìn)行推廣。

萬古霉素；高效液相色譜法；藥物濃度檢測

萬古霉素是當(dāng)前治療革蘭氏陽性菌，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)最有效的藥物之一。一直以來，萬古霉素引起腎毒性是其在使用過程中最大的擔(dān)憂。腎毒性是由于純度較低導(dǎo)致的，隨著制藥工藝的優(yōu)化和純度的提高，毒性反應(yīng)的發(fā)生率顯著降低[1]。然而，臨床實際中的情況是非常復(fù)雜的，患者往往合并有其它的基礎(chǔ)疾病、老年患者還常常合用其他多種治療藥物。因此，對于萬古霉素相關(guān)的腎毒性不可掉以輕心[2]。萬古霉素屬于治療窗窄的藥物，據(jù)報道，即使在治療窗內(nèi)也有相關(guān)腎毒性報道[3]，若超過了治療窗，則風(fēng)險會大大增加。目前關(guān)于萬古霉素藥物濃度監(jiān)測的報道雖然有很多[4,5]，但在臨床進(jìn)行監(jiān)測要求方法簡單，操作簡便。我們認(rèn)為在已有的方法上依然有著進(jìn)一步優(yōu)化的空間。因此，本文參考了HPLC法檢測萬古霉素血藥濃度的相關(guān)報道，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了方法學(xué)的改進(jìn)，并成功用于臨床患者。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 LC-20AB高效液相色譜系統(tǒng)(檢測器為SPD-M20A，島津，日本)； 電子分析天平(EB224，0.1 mg，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；高速離心機(jī)(TG1650-WS，上海盧湘儀)；萬古霉素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：30360-200301)；注射用鹽酸萬古霉素(Eli Lilly Japan K.K，規(guī)格：0.5g，批號：MW19231)；乙腈(Merck,德國)為色譜純，三氟乙酸(國藥集團(tuán)，中國)為分析純，實驗用水為MILLIPORE自制超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：CLC-ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm，SMIMADZU，日本)；流動相：乙腈-0.05 mol/L三氟乙酸(3∶22)；柱溫40℃；流速1 ml/min；檢測波長280 nm；進(jìn)樣體積：20 μl。

1.2.2 血漿樣品處理 取血漿樣品500 μl于EP管中，加入6%高氯酸300 μl，渦旋震蕩1 min，15 000 r/min離心3 min后，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗 按“2.1”項下色譜條件，萬古霉素保留時間在8.6 min左右，峰形良好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對分析無干擾，無雜質(zhì)峰干擾檢測。見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 精密秤取萬古霉素對照品適量溶于10 ml容量瓶中，加水溶解成1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。在空白血漿中加入適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使血漿中藥物濃度分別為1.56、3.125、6.25、12.5、25、50和100 μg/ml。按“2.2”項下的方法操作，記錄下色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，通過加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運算，得到回歸方程。試驗結(jié)果表明萬古霉素血藥濃度在1.56～100 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限(LLOQ)為1.56 μg/ml。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度試驗 分別于500 μl空白血漿中加入標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成含低、中、高(2、10、80 μg/ml)3中不同的萬古霉素血漿樣品，每種濃度平行配制5份，再按“2.2”項下方法進(jìn)行處理，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出萬古霉素的血漿濃度，考察批內(nèi)準(zhǔn)確度和批內(nèi)精確度；連續(xù)3 d重復(fù)相同的操作考察批間準(zhǔn)確度和批間精確度。批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度的偏差<5%，批內(nèi)、批間精密度<8%?？疾熘笜?biāo)完全符合生物樣品分析的要求。見表1、2。

圖1 HPLC色譜圖

表1 批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度 n=5

表2 批間準(zhǔn)確度和精密度 n=5

2.4 回收率試驗 分別于500 μl空白血漿中加入標(biāo)準(zhǔn)儲備液，精確配制成含低、中、高(2、10、80 μg/ml)3中不同的萬古霉素血漿樣品，每種濃度平行配制5份，按“2.2”項下方法處理后再進(jìn)行分析，記錄峰面積。800 μl流動相代替空白血漿配制相應(yīng)的對照品溶液，每種濃度平行配制5份的樣品，進(jìn)樣20 μl進(jìn)行檢測，每個濃度測5遍，按“2.2”項下方法處理后再進(jìn)行分析，記錄峰面積。以每種濃度兩者峰面積之比計算提取回收率。絕對回收率大于90%。見表3。

表3 回收率試驗 n=5

2.5 穩(wěn)定性考察 血漿樣品分別在室溫放置8、16、24 h及-20℃放置15 d后進(jìn)行分析。在這幾個考察條件下，萬古霉素的測定值均保持穩(wěn)定，相對偏差小于5%。見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗 (n=5)

2.6 臨床實際應(yīng)用 本方法成功用于我院10例革蘭氏陽性菌感染患者的血藥濃度檢測，檢測對象大都是老年患者，用藥為每8小時1 g或每12小時2 g。檢測時間點為經(jīng)4劑萬古霉素治療后，第5劑給藥前30 min 的濃度。從測試結(jié)果看，患者的血漿中的藥物濃度有差異，濃度在7.8～18.6 μg/ml，平均濃度(14.5±4.3)μg/ml。

3 討論

早前由于萬古霉素在臨床上的使用受到很大程度的限制是由于其易引起毒性，相比較半合成青霉素更加安全。近些年(MRSA)感染率升高導(dǎo)致萬古霉素的使用增加[6]。由于萬古霉素的治療窗窄，低濃度導(dǎo)致耐藥和治療不佳，高濃度導(dǎo)致治療毒性。因此，對患者經(jīng)行治療藥物檢測是非常有必要的。美國感染病學(xué)在2009年萬古霉素治療指南中之處，其谷濃度應(yīng)維持在10 mg/L以上，對于藥敏結(jié)果提示最低抑菌濃度(MIC)達(dá)到1 mg/L需要將谷濃度維持在15～20 mg/L[7]。對于峰濃度來說由于沒有發(fā)現(xiàn)其與毒性和療效的之間有明確關(guān)系，所以不需要監(jiān)測峰濃度。

目前主要有兩種分析方法可以用來檢測血漿中萬古霉素濃度，一種是免疫法(包括放射免疫分析法和酶放大免疫檢測法)；另一種是色譜法[4,5]。免疫法的特點是簡單、快速、有商業(yè)化的試劑盒可供使用。但是免疫法有難以克服的缺陷，一是成本過高；二是萬古霉素相關(guān)物質(zhì)(降解產(chǎn)物或生產(chǎn)過程中引入的物質(zhì))也會與試劑發(fā)生反應(yīng)從而影響結(jié)果。大部分已報道檢測萬古霉素血藥濃度的方法還是色譜法[8-10]。色譜法具有更高的靈敏度和特異度，在檢測低濃度藥物時更有優(yōu)勢。

由于萬古霉素是水溶性抗生素，如果使用有機(jī)溶劑萃取就會導(dǎo)致藥物回收率的降低。所以蛋白沉淀法是更能夠確保準(zhǔn)確性的方法。大部分已有的方法所使用高氯酸的濃度都在10%以上[11,12]。而本實驗使用的是6%高氯酸。由于高氯酸屬于有強(qiáng)腐蝕性的強(qiáng)酸，若長期使用濃度較高的酸會對色譜柱有損傷。我們在使用了6%、8%、10%和15%四種高氯酸作為沉淀劑進(jìn)行試驗后，發(fā)現(xiàn)對于10 μg/ml萬古霉素的回收率并沒有顯示出差異。所以最終選用了6%的高氯酸。也有報道使用有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)沉淀蛋白的，我們經(jīng)過反復(fù)試驗認(rèn)為使用有機(jī)溶劑會減少有效保留時間，而且有可能將保留在色譜柱上的弱極性雜質(zhì)洗脫下來混進(jìn)待測物中，對分析結(jié)果造成影響。所以，在準(zhǔn)確度和精密度的前提下應(yīng)該可以優(yōu)先選擇有機(jī)酸溶液。

在流動相方面，幾乎所有研究中水相都使用了磷酸二氫鉀緩沖鹽。使用緩沖鹽體系有很多缺陷：(1)對色譜柱損傷較大；(2)結(jié)束后需要長時間用高比例水沖洗，否則易堵塞色譜柱；(3)配制過程較為麻煩；(4)用高比例有機(jī)相進(jìn)行分析時磷酸鹽有析出的可能。在本試驗中嘗試使用0.05%三氟乙酸溶液做為水相，由于萬古霉素的Pka為2.5～4.5，在偏酸性的流動相中待測物會以分子形式經(jīng)過色譜系統(tǒng)，不會形成拖尾。經(jīng)過試驗比對，使用0.05%三氟乙酸溶液各項檢測指標(biāo)都能達(dá)到要求。

本試驗具有簡單、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的特點，使用15CM高保留C18柱即可獲得很好的保留時間。能準(zhǔn)確測定血漿中的萬古霉素、特別適用于臨床樣本的檢測。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.18.039

項目來源：常州四藥-南京藥學(xué)會醫(yī)院藥學(xué)研究基金(編號：2014YX013)

210029 南京市，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京胸科醫(yī)院藥學(xué)部

王潔，210029 南京市，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京胸科醫(yī)院藥學(xué)部；

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R 917.1

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2017-02-20)