● 郭迎科 李瑞琴

紅花黃色素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡上皮A549細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的抑制作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究※

● 郭迎科 李瑞琴▲

目的：通過體外培養(yǎng)人肺泡上皮細(xì)胞A549，用TGF-β1刺激其發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)和超微病理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探討紅花黃色素在防治肺間質(zhì)纖維化上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的干預(yù)作用及機(jī)制。方法：將正常培養(yǎng)的人肺泡上皮細(xì)胞A549分6組：正常對(duì)照組、TGF-β1誘導(dǎo)組(TGF-β1終濃度為5ng/ml，誘導(dǎo)24h)、地塞米松組(地塞米松2μg/mL)、紅花黃色素低、中、高3個(gè)劑量干預(yù)組(紅花黃色素25μg/mL+TGF-β1 5ng/mL、紅花黃色素中劑量組紅花黃色素50μg/mL+TGF-β1 5ng/mL、紅花黃色素高劑量組紅花黃色素75μg/mL+TGF-β1 5ng/mL)。TGF-β1 5ng/L干預(yù)A549細(xì)胞生長(zhǎng)24h，采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)檢測(cè)不同劑量紅花黃色素作用于TGF-β1刺激A549細(xì)胞后其發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后各組的吸光值(OD值)，計(jì)算其增殖活性，繪制細(xì)胞增殖曲線。采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)與形態(tài)變化。結(jié)果：(1)MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比較，TGF-β1誘導(dǎo)組細(xì)胞活力略高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；紅花黃色素中藥干預(yù)組細(xì)胞的增殖活力下降，與正常對(duì)照組和TGF-β1誘導(dǎo)組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)倒置顯微鏡觀察顯示：經(jīng)過TGF-β1刺激后，A549細(xì)胞由正常的鋪路石樣貼壁生長(zhǎng)呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的特征，呈明顯的拉長(zhǎng)狀態(tài)，由鵝卵石狀轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N型或梭型，出現(xiàn)偽足樣改變，藤索樣生長(zhǎng)，類似于成纖維細(xì)胞，且細(xì)胞之間間隙增大。結(jié)論：通過觀察紅花黃色素各劑量組發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的形態(tài)逐漸接近正常的A549細(xì)胞，視野內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目按一定的劑量效應(yīng)關(guān)系減少。

肺纖維化 紅花黃色素 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化

肺纖維化又稱肺間質(zhì)纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)，是以彌漫性肺泡炎、肺間質(zhì)炎癥和間質(zhì)纖維化為特征的病變。隨著近年來汽車尾氣、工廠廢氣和工地的揚(yáng)塵等增多，大氣污染加劇，霧霾頻發(fā)，肺纖維化發(fā)病率持續(xù)攀升[1]。中醫(yī)中藥在治療肺纖維化方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探討紅花黃色素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡上皮A549細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的抑制作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究，為臨床應(yīng)用紅花黃色素治療肺纖維化提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料

1.1細(xì)胞株人肺泡上皮細(xì)胞A549(凱基生物公司)

1.2主要藥物與試劑人重組TGF-β1(美國(guó)PEPROTECH公司)；重組細(xì)胞因子溶解液稀釋套裝(聯(lián)科生物)紅花黃色素(山西德元堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)H41020330)；地塞米松磷酸鈉注射液(河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司，批號(hào)1607206)；0.9%氯化鈉注射液(山東華魯制藥有限公司，批號(hào)H37022750)RPMI 1640培養(yǎng)基(Solarbio生物公司)；青、鏈霉素混合液(Solarbio生物公司)；胎牛血清(杭州四季青)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶(Solarbio生物公司)；二甲基亞砜(DMSO，Solarbio生物公司)。

1.3儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(北京世安公司)；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器(日本TOMY公司)；超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(上海圣納堡生物公司)；超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)；純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)；制冰機(jī)(常熟雪科公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)[2-3]

2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇 將人肺泡上皮細(xì)胞A549從-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴鍋，一次性手套包裹輕輕搖晃使細(xì)胞凍存塊快速充分溶化；消毒凍存管管口四周后開啟，將溶解好的細(xì)胞懸液吸入10mL離心管中，加入雙倍體積的10%1640完全培養(yǎng)基，800r/min低速離心5min；去除凍存液，PBS洗滌細(xì)胞1～2遍；10%完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液按照預(yù)先設(shè)定好的實(shí)驗(yàn)步驟接種到新的培養(yǎng)瓶中；標(biāo)記后入37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱。

2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 細(xì)胞培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿約80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代；棄舊的培養(yǎng)基，PBS洗滌一次細(xì)胞，去除多余的培養(yǎng)基；加入適量的0.25%的胰酶消化，消化時(shí)間根據(jù)鏡下觀察的細(xì)胞形態(tài)(變小變圓，即將開始脫落)來控制，終止消化時(shí)加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行終止；收集細(xì)胞至15mL離心管，離心、洗滌細(xì)胞1～2次后制成單細(xì)胞懸液；將單細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶里；標(biāo)記細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)者信息，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.1.3 細(xì)胞凍存 取指數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，消化、離心，棄上清，制成1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，加入凍存液1mL(RPMI1640：FBS：DMSO=7∶2∶1)；放入細(xì)胞凍存管并標(biāo)記、封口，依次于4℃冰箱放置60分鐘，-20℃冰箱放置120分鐘，最后放入-80℃冰箱保存。

2.2造模及分組根據(jù)MTT預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)的綜合考慮，選取紅花黃色素75μg/mL、50μg/mL及25μg/mL的濃度梯度來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選取地塞米松2μg/mL，該實(shí)驗(yàn)分為6組：正常對(duì)照組、TGF-β1誘導(dǎo)組(TGF-β1終濃度為5ng/ml，誘導(dǎo)24h)、地塞米松組(地塞米松2μg/mL)、紅花黃色素低、中、高3個(gè)濃度干預(yù)組(紅花黃色素高濃度組75μg/mL+TGF-β1 5ng/mL、紅花黃色素中濃度組紅花黃色素50μg/mL+TGF-β1 5ng/mL、紅花黃色素低濃度組 25μg/mL+TGF-β1 5ng/mL)。先用5ng/mL TGF-β1刺激A549細(xì)胞24h，然后加入地塞米松及各濃度的紅花黃色素；正常對(duì)照組則為10%1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞。

2.3細(xì)胞增殖檢測(cè)收集細(xì)胞取正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加胰酶消化，離心后用10%的1640完全培養(yǎng)基制成含2.5×104個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液。接種96孔板根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取的紅花黃色素3個(gè)濃度，每個(gè)計(jì)量組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)板；在96孔板上加入所制成的細(xì)胞懸液，每孔200μL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁；吸棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的藥物和正常對(duì)照組的完全培養(yǎng)基200μL，培養(yǎng)箱里繼續(xù)培養(yǎng)；分別于12h、24h、48h取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h；棄上清，加150μL DMSO/孔，搖床震動(dòng)約20min，充分溶解沉淀；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定，設(shè)定波長(zhǎng)為490nm，測(cè)出各組的吸光度(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次[4-5]；以各時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，各組細(xì)胞相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖。

2.4細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置正常對(duì)照組、TGF-β1模型誘導(dǎo)組、地塞米松組和紅花黃色素高、中、低濃度干預(yù)組，倒置顯微鏡下觀察并拍照細(xì)胞在不同的時(shí)間點(diǎn)的狀態(tài)表現(xiàn)并拍照保存，取生長(zhǎng)24h的細(xì)胞圖片(放大100倍)，對(duì)比各組細(xì)胞的變化及不同。

3 結(jié)果

3.1倒置顯微鏡觀察結(jié)果倒置相差顯微鏡下，采用TGF-β1 5ng/mL干預(yù)A549細(xì)胞生長(zhǎng)24h后，細(xì)胞出現(xiàn)顯著變化。正常的A549細(xì)胞多呈鋪路石樣上皮細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)，TGF-β1刺激后，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榧忓N形或梭形，出現(xiàn)偽足樣改變，呈現(xiàn)拉長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞之間間隙加大，藤索樣生長(zhǎng)，連接變得稀疏，類似于成纖維細(xì)胞。紅花黃色素干預(yù)后A549細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于正常。見圖1。

a.正常對(duì)照組 b.TGF-β1模型誘導(dǎo)組 c.地塞米松組

d.紅花黃色素高濃度組 e.紅花黃色素中濃度組 f.紅花黃色素低濃度組

圖1倒置顯微鏡觀察結(jié)果

3.2 MTT檢測(cè)結(jié)果MTT法中測(cè)得的實(shí)驗(yàn)各組的吸光值，計(jì)算出不同濃度的紅花黃色素對(duì)細(xì)胞的增殖的作用。結(jié)果顯示：TGF-β1 5ng/mL誘導(dǎo)A549細(xì)胞，細(xì)胞的增殖活性略有增加，與正常對(duì)照組細(xì)胞比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；紅花黃色素干預(yù)細(xì)胞后，在一定的藥物劑量范圍內(nèi)，隨藥物劑量的增加，細(xì)胞的增殖受到影響。各組間進(jìn)行比較，12h、24h及48h時(shí)，紅花黃色素三個(gè)濃度組與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，12h、24h時(shí)紅花黃色素三個(gè)濃度組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，48h時(shí)僅低濃度組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 紅花黃色素對(duì)A549體外增殖的影響(n=5；；吸光值A(chǔ)490nm)

注：與正常對(duì)照組比較，#P<0.05；與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，*P<0.05。

圖2 紅花黃色素對(duì)A549體外增殖的影響

4 討論

肺纖維化是一個(gè)不可逆的漸進(jìn)性疾病，是多種肺部疾病的終末表現(xiàn)，目前缺乏有效的治療手段和治療藥物。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，肺纖維化發(fā)生機(jī)制的分子層次研究方興未艾，單味或復(fù)方中藥對(duì)不同通路的多靶點(diǎn)的協(xié)同治療將成為中醫(yī)藥防治肺纖維化的新趨勢(shì)[1]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指有極性的上皮細(xì)胞失去其上皮特征并逐漸轉(zhuǎn)化為具有遷徙和侵襲能力的間充質(zhì)細(xì)胞的過程。在致病因素的長(zhǎng)期作用下，肺泡上皮細(xì)胞的完整性和特征被打亂并重排，引起形態(tài)學(xué)或生理學(xué)上的改變，部分上皮細(xì)胞表型發(fā)生改變，發(fā)生上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT過程有多條信號(hào)通路參與，各條信號(hào)通路之間通過配體相互交聯(lián)，使EMT過程在一定程度上維持穩(wěn)態(tài)。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)是一種多效性的細(xì)胞因子，是目前肺纖維化的研究熱點(diǎn)和重要的藥物作用靶點(diǎn)。TGF-β可由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，通過自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、黏附，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrixc，ECM)的代謝，參與肺胚胎發(fā)育、組織損傷和修復(fù)。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，TGF-β在小鼠肺纖維化疾病的過程中起著關(guān)鍵的作用如調(diào)節(jié)膠原蛋白合成、成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞凋亡、以及成纖維細(xì)胞分化[6]。

研究[7]表明，其致纖維化作用不僅與下游Smad蛋白家族信號(hào)通路有關(guān)，還與絲裂原活化蛋白激酶家族ERK1/2信號(hào)通路密切相關(guān)，兩者共同調(diào)控相應(yīng)的靶分子轉(zhuǎn)錄。有研究顯示，博萊霉素(BLM)誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型中肺組織各時(shí)間段ERK1、ERK2、磷酸化ERK1/2的表達(dá)明顯高于同期對(duì)照組，說明信號(hào)蛋白ERK1/2在肺泡炎癥和纖維化階段均參與了BLM致肺纖維化的發(fā)病過程[8]。國(guó)內(nèi)外研究表明，在博來霉素、二氧化硅、石棉和電離輻射致肺纖維化的人和動(dòng)物模型中均有磷酸化的ERK(p-ERK)表達(dá)增加，再次證明ERK信號(hào)通路在一定程度上參與了纖維化病變的發(fā)生[9]。由此可見，ERK信號(hào)通路可能是TGF-β1對(duì)細(xì)胞調(diào)控作用中最為重要的通路之一。Davis等[10]與Mucsi等[11]均在各自研究中發(fā)現(xiàn)，給細(xì)胞轉(zhuǎn)染顯性失活的ERK，可抑制TGF-β1刺激的纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)和I型膠原(COL-I)增強(qiáng)子等的活性；而轉(zhuǎn)染相應(yīng)的野生型ERK質(zhì)粒卻引起膠原基因的表達(dá)增加。TGF-β介導(dǎo)的ERK通路是肺纖維化形成最為重要的通路之一。研究發(fā)現(xiàn)[12]，TGF-β受體I(TβRI)主要介導(dǎo)TGF-β1的促纖維化作用，TGF-β受體II(TβRⅡ)則主要參與抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。組織纖溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)是重要的ECM成分?；罨蟮慕z裂原活化蛋白激酶(motogen-activated protein kinases，MAPKs)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相應(yīng)效應(yīng)基因而發(fā)揮作用。研究顯示[13]，ERK磷酸化(p-ERK)蛋白水平明顯上調(diào)，ERK蛋白表達(dá)水平無大變化，TβRI可經(jīng)Ras/ERK通路促進(jìn)膠原合成，印證了ERK依賴的受體活化型Smad(R-Smad)接頭域的磷酸化作用增強(qiáng)了I型膠原合成，提示ERK和Smads信號(hào)之間在膠原產(chǎn)生上存在著協(xié)同作用。

TGF-β誘導(dǎo)的EMT在肺纖維化的形成過程中扮演非常重要的角色，EMT的分子機(jī)制及逆轉(zhuǎn)EMT的分子機(jī)制目前尚不是很明確，進(jìn)一步研究影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化這一病理生理現(xiàn)象的調(diào)控因素及其在肺纖維化中的作用及相關(guān)信號(hào)通路，是目前肺纖維化的靶向藥物研究和治療思路。

紅花黃色素(Saffower Yellower)是菊科植物紅花[14]的干燥花的主要生理活性成分，具有擴(kuò)張周圍血管、降低血壓、抑制血小板聚集、增強(qiáng)纖維蛋白溶解、降低全血黏度等作用。紅花活血通經(jīng)，祛瘀止痛，在臨床上主要用于治療閉塞性腦血管疾病、冠心病、脈管炎。近年來，關(guān)于紅花黃色素的抗纖維化作用引起了人們的關(guān)注，并進(jìn)行了許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)[2]。研究[3]已發(fā)現(xiàn): 紅花黃色素可緩解大鼠和小鼠急性肺部炎癥損傷所致的水腫、淤血及炎癥因子表達(dá)的升高，紅花黃色素能緩解大鼠慢性阻塞性肺疾病發(fā)病過程中的炎癥損傷；以紅花黃色素為主要成分的紅花注射液能緩解博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化以及紅花黃色素可抑制 TGF-β1誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞A549活化。

本研究表明TGF-β1能刺激人肺泡上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變，紅花黃色素作用后12h、24h及48h三個(gè)濃度組與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A549細(xì)胞形態(tài)逐漸趨向于正常。與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，12h、24h時(shí)紅花黃色素三個(gè)濃度組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而48h時(shí)僅低濃度組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由此可見紅花黃色素能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞A549發(fā)生向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)。其調(diào)控因素及在肺纖維化中的作用機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路的研究，是我們下一步探索的方向。

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2017年度河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(No.17A310020)；河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究(No.112300410052)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(No.17A310020)；河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(No.2016YCX004)

李瑞琴，女，教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事中醫(yī)藥防治肺纖維化。E-mail:xyzjane1314@163.com

河南中醫(yī)藥大學(xué)(450046)

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