● 朱繼孝 文 樂 魏春華 慕澤涇 鐘國躍 曾金祥

無尾果黃酮類化學(xué)成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析※

● 朱繼孝*文 樂 魏春華 慕澤涇 鐘國躍 曾金祥▲

目的：通過UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對無尾果中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。方法：采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS，YMC-ULtraHT Pro C18色譜柱(100 mm×3 mm，2μm)以甲醇-0.5%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫；質(zhì)譜采用電噴霧(ESI)離子源，在負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，通過保留時(shí)間、精確分子離子峰和二級質(zhì)譜裂解碎片，對無尾果進(jìn)行成分鑒定。結(jié)果：初步鑒定了無尾果中10個黃酮類成分。結(jié)論：UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法能快速鑒別無尾果中的黃酮類化學(xué)成分，該方法簡單、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，為無尾果的藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

無尾果 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 化學(xué)成分 裂解規(guī)律 黃酮

無尾果(ColurialongifoliaMaxim),藏藥名為熱袞巴，是薔薇科無尾果屬的植物，分布于中國大陸的甘肅、云南、西藏、四川、青海等地，全草入藥，有止血止痛、清熱作用。藏藥志記載，熱袞巴能治療高血壓引起的發(fā)燒、神經(jīng)性發(fā)燒、疝痛等，具有清熱解毒功效[1]。無尾果在藏區(qū)使用廣泛。目前國內(nèi)外對于無尾果化學(xué)成分的研究并不多見。本課題組前期對無尾果的抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用進(jìn)行了研究。前期研究結(jié)果表明，無尾果具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用，其抗炎作用與提高抗氧化能力、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制炎癥因子TNF-α、PGE2的釋放有關(guān)。但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍不清楚，限制了無尾果的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。因此，建立一種有效、準(zhǔn)確的方法對無尾果進(jìn)行化學(xué)成分研究具有重要意義。近年來，液質(zhì)聯(lián)用在中藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，已成為分離鑒定各種化合物的重要手段之一[2-3]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測器的不足，它集LC的高分離能力和MS的高靈敏度、高選擇性于一體[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)以無尾果為研究對象，應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對無尾果甲醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行研究，根據(jù)其準(zhǔn)分子離子以及二級碎片離子、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)等鑒定無尾果的化學(xué)成分，并總結(jié)其質(zhì)譜裂解規(guī)律，為無尾果活性成分的鑒定和研究提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為藏藥化學(xué)成分的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1儀器島津LC-30A超高效液相色譜儀，PDA紫外檢測器；Triple-TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀，配備 ESI 離子源及 Analyst 1.6 數(shù)據(jù)處理軟件、PeakView數(shù)據(jù)處理軟件(A美國B SCIEX 公司)；KQ-5200DB 型超聲清洗機(jī)(昆山市超聲波儀器公司)；AL204 型電子分析天平(Mettler Toledo 儀器(上海)有限公司)； Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)(德國默克密理博公司)。

1.2藥物與試劑異槲皮苷對照品(純度≥98%，批號：MUST-16051010)、金絲桃苷對照品(純度≥98%，批號：MUST-16032113)、木犀草素對照品(純度≥98%，批號：MUST-16011015)均購自成都曼思特生物科技公司；甲醇( HPLC 級，美國天地有限公司)，甲酸( HPLC 級，山西西亞化工有限公司)，水為Milli-Q 系統(tǒng)純化水(美國Millipore 公司)。

無尾果由課題組采自云南怒江貢山縣，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘囯躍研究員鑒定為薔薇科無尾果屬植物無尾果 (C.longigoliaMaxim)的干燥全草。

2 方法

2.1供試品溶液制備無尾果粉碎，稱取約2.0g置于50mL錐形瓶，加入25mL 75% 甲醇超聲提取45min，抽濾、旋干、定容至5mL容量瓶中，取定容后藥液過0.22μm 微孔濾膜過濾，供UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備分別精密稱取2mg對照品(金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草素)于5mL容量瓶中，用75%甲醇溶解稀釋至刻度，過0.22μm微孔濾膜，待分析。

2.3 LC-MS條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：YMC-ULtraHT Pro C18 色譜柱(100 mm×3 mm，2μm)；流動相：0.5%甲酸水溶液(A)，甲醇(B)，梯度洗脫：0～30min，8%～60% B；30～40min，60%～95% B；40～42min，95%～8% B；42～47min，8%～8% B；流速：0.4mL/min；柱溫：32℃；進(jìn)樣量：4μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源(ESI)，負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1000；噴霧電壓：-4500V，霧化氣溫度：500℃，氣簾氣：140.745kPa，輔助氣：344.74 kPa；去簇電壓(DP)：-100V；采用AB analyst TF軟件采集數(shù)據(jù)，TOF/MS 一級預(yù)掃描和觸發(fā)的二級掃描TOF/MS/MS 離子累積時(shí)間分別為200、100 ms，碰撞能量CE為40eV，CES碰撞能量疊加為(40±10)eV。

2.4數(shù)據(jù)處理采用AB Sciex公司 Peak View 1.6軟件，對UHPLC-Q-TOF-MS/MS采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3 結(jié)果

3.1無尾果化學(xué)成分分析采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 對75%甲醇提取無尾果藥材成分進(jìn)行定性分析，(-) ESI-MS 的質(zhì)譜總離子流圖(TIC)見圖1。應(yīng)用Peak View 1.6軟件分析75% 甲醇提取無尾果中各化學(xué)成分的保留時(shí)間及其質(zhì)譜信息，并結(jié)合分子離子峰與對照品、相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，對其中的化學(xué)成分進(jìn)行確認(rèn)，初步鑒定出無尾果提取物中黃酮類化合物10個，見表1。

圖1 無尾果提取物在負(fù)離子模式下總離子流圖

PeaknoCompoundidentityFormulaRt(min)Error(ppm)FoundatMass(Da)Fragmentionsm/z1CatechinhydrateC15H14O68．974．4289．0712245．0826、203．0715、187．0398、161．06032HyperosideC21H20O1220．751463．0681301．0351、272．0322、255．0299、243．0294、178．9990、151．00463MiquelianinC21H18O1320．860．5477．0678301．0362、151．0052、178．99934Apigenin7-glucosideC21H20O1022．470．6431．0966311．0581、269．0454、225．0572、200．0450、5QuercetinC15H10O726．573．1301．0363273．0393、178．9981、151．00436LuteolinC15H10O627．752285．0410257．0450、229．0501、151．00467TilirosideC30H26O1328．230．6593．1304447．0940、327．0516、307．0829、285．0415、284．0332、255．0304、227．0351、163．04018KaempferolC15H10O629．821．6285．0399257．0562、257．0453、229．0311、211．0405、187．04209ApigeninC15H10O530．312．1269．0461241．0467、225．0548、201．0541、197．0445、159．045910IsorhamnetinC16H12O730．612．8315．0519300．0275、283．0245、151．0048

3.2化合物的質(zhì)譜裂解特征化合物1tR為8.97min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z289.0712 [M-H]-，其分子式為C15H14O6，分子離子峰失去CO2得到碎片離子m/z245.0826，碎片離子m/z245.0826分別失去C2H2O、C3H6O得到碎片離子m/z203.0715、187.0398。碎片離子m/z203.0715失去C2H2O得到碎片離子m/z161.0603，裂解規(guī)律與文獻(xiàn)一致。因此，可以推測為兒茶素[5]。

化合物2tR為20.75min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z463.0681 [M-H]-，其分子式為C21H20O12，二級圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品一致，二級圖譜碎片離子峰為m/z301.0351、300.0278、271.0246、255.0299、243.0294、178.9990、151.0046。根據(jù)二級碎片離子m/z301.0351、300.0278、272.0322、255.0290、243.0294、178.9990、151.0046推測為槲皮素母核，分子離子峰,m/z463.0681失去一分子葡萄糖得到m/z301.0351，而m/z301.0351強(qiáng)度高于m/z300.0278和碎片離子m/z271.0254、255.0299，可以推測糖連接在3位，見圖2a。因此，推測此化合物為金絲桃苷[6]。

化合物3tR為20.86min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z477.0747[M-H]-，其分子式為C21H18O13，分子離子峰失去一分子葡萄糖醛酸得到碎片離子m/z301.0362，根據(jù)碎片離子m/z179.0344、151.0052、150.9874推測m/z301.0362為槲皮素母核。因此，推測化合物3為槲皮素-3-0葡萄糖醛酸，裂解規(guī)律與文獻(xiàn)一致[6]。

化合物4tR為22.47 min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z431.0970 [M-H]-，其分子式為C21H20O10，分子離子峰失去C4H8O5得到碎片離子m/z311.0581，失去一分子葡萄糖得到碎片離子m/z269.0454。碎片離子m/z269.0454分別失去CO2和C3O2得到碎片離子m/z225.0572、200.0450，推測化合物4為芹菜素7-O-葡萄糖苷,裂解規(guī)律與文獻(xiàn)一致[7]。

化合物5tR為26.57 min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z301.0363 [M-H]-，其分子式為C15H10O7，分子離子峰m/z301.0363 分別失去CO、C7H6O2得到碎片離子m/z273.0405、178.9982，碎片離子m/z178.9982失去CO得到碎片離子m/z151.0042，推測此化合物為槲皮素，裂解規(guī)律與文獻(xiàn)一致[8]。

化合物6tR為27.75 min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z285.0399 [M-H]-，其分子式為C15H10O6，二級圖譜與對照品一致，分子離子峰失去CO得到碎片離子m/z257.0562，碎片離子m/z257.0450失去CO得到碎片離子m/z229.0509。碎片離子m/z285.0399發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z151.0051、133.0291，推測此化合物為木犀草素，見圖2b，裂解規(guī)律與文獻(xiàn)一致[9]。

化合物7tR為28.23min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z593.1304 [M-H]-，其分子式為C30H26O13，碎片離子峰為m/z447.0940、327.0516、307.0829、285.0415、284.0332、255.0304、227.0351、145.0296，分子離子脫去C9H6O2得到碎片離子447.0940，碎片離子m/z447.0940進(jìn)一步脫去C6H10O5產(chǎn)生碎片離子m/z285.0415，推測中性丟失為葡糖糖基。由碎片離子m/z285.0415、284.0332、255.0304、227.0351可以推斷為山奈酚母核。因此，推測此化合物為銀鍛苷[9]。

a 金絲桃苷

b 木犀草素

c芹菜素

化合物8tR為29.82min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z285.0399 [M-H]-，其分子式為C15H10O6，分子離子峰m/z285.0399分別失去CO、C4H4O3得到碎片離子m/z257.0450、187.0395，碎片離子m/z257.0450分別失去CO和HCOOH得到碎片離子m/z229.0501、211.0395，推測化合物8為山奈酚，裂解規(guī)律與文獻(xiàn)一致[10]。

化合物9tR為30.31min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z269.0405[M-H]-，其分子式為C15H10O5，分子離子峰m/z269.0405分別失去CO、CO2、C3O2、C2O3得到碎片離子m/z241.0467、225.0548、201.0541、197.0445，碎片離子m/z201.0541失去C2H2O得到碎片離子m/z159.0459，見圖2c，推測化合物9為芹菜素，裂解規(guī)律與文獻(xiàn)一致[11]。

化合物10tR為30.61min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z315.2549 [M-H]-，其分子式為C16H12O7，分子離子峰m/z315.2549失去CH3得到m/z300.0275，碎片離子m/z300.0275失去H2O得到碎片離子m/z283.0246，先失去C7H6O再失去CO得到碎片離子m/z151.0048，推測化合物10為異鼠李素，裂解規(guī)律與文獻(xiàn)一致[12]。

4 討論

藏藥具有療效明顯、毒副作用小、資源豐富易得等優(yōu)點(diǎn)，屬我國較有影響、較為完整的民族藥之一。而無尾果化學(xué)成分相關(guān)的報(bào)道仍屬空白。

UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)為化合物的鑒定提供了一種全新方法，與傳統(tǒng)化學(xué)成分分離鑒別方法相比操作簡便、快速、準(zhǔn)確，已成為中藥藥效成分發(fā)現(xiàn)與鑒別的有力工具。本實(shí)驗(yàn)分析了無尾果甲醇提取物成分的質(zhì)譜行為，鑒別了10種黃酮類化合物。并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)以槲皮素為母核的化合物如槲皮素-3-0葡萄糖醛酸、金絲桃苷，其特征碎片離子為m/z301；芹菜素，其特征碎片離子為m/z269；木犀草素，其特征碎片離子為m/z285，為后續(xù)黃酮類化合物的鑒別提供了參考依據(jù)。

黃酮類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、保肝、抗病毒等活性[13]，如金絲桃苷具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用且通過抑制NF-κB的活化產(chǎn)生抗炎作用[14]；木犀草素具有抗炎鎮(zhèn)痛保護(hù)神經(jīng)的作用，其能降低炎癥因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性，減少促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[15]。這表明本實(shí)驗(yàn)推斷出的黃酮類化合物，在一定程度上闡明了無尾果的抗炎鎮(zhèn)痛藥效成分，為無尾果的藥理活性乃至質(zhì)量控制提供了初步物質(zhì)依據(jù)。從總離子流圖可以看出，仍有大量成分尚待進(jìn)一步解析，說明無尾果可能還存在其它抗炎鎮(zhèn)痛藥效成分，相關(guān)工作正在進(jìn)行之中。

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江西民族藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金項(xiàng)目(No.JXXT201402021)

朱繼孝，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：中藥與民族藥有效成分與作用機(jī)理。

▲通訊作者曾金祥，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：中藥與民族藥物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。Email：zjinxiang@163.com

江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心(330004)