馬阮昕 王曉東 江曉妹

自擬解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎模型大鼠的保護(hù)作用

馬阮昕 王曉東 江曉妹

目的探討自擬解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎模型大鼠的肝臟保護(hù)作用。方法將SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。將大鼠按體重用56%酒精給予灌胃，7 mL/kg，1天1次，持續(xù)4周。從造模后第5周起，陽性對(duì)照組灌胃給予西樂葆0.05 mg/kg，解酒護(hù)肝湯治療組分別給予灌胃低、中、高劑量(5.0 mg/kg，15.0 mg/kg，30.0 mg/kg)，持續(xù)30天。末次給藥后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，以及取肝臟組織，稱重固定。隨后試劑盒檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)，ELISA和免疫組化法分別檢測(cè)血清和肝臟腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)，HE染色觀察肝臟組織形態(tài)。結(jié)果與模型對(duì)照組比較，解酒護(hù)肝湯各劑量組的ALT、AST顯著減少(P<0.05)，解酒護(hù)肝湯中、高劑量組的MDA、TNF-α顯著減少(P<0.05)。解酒護(hù)肝湯高劑量組的肝臟臟器系數(shù)顯著下降(P<0.05)。解酒護(hù)肝湯各劑量組肝臟TNF-α表達(dá)均有一定程度減少。結(jié)論自擬解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎模型大鼠肝臟有一定的保護(hù)作用。

解酒護(hù)肝湯； 酒精性肝炎； 血清； 大鼠； 腫瘤壞死因子α

酒精性肝病是由于長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，酒精性肝炎是酒精性肝病的一種病癥[1-2]。近年來，中國(guó)由酒精所致肝損害的發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢(shì)，酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因[3]。中醫(yī)學(xué)雖無酒精性肝病之稱，但有論治“傷酒”“脅痛”“黃疸”等病證的文獻(xiàn)[4]。因此，中醫(yī)治療酒精性肝病有獨(dú)特之處，本實(shí)驗(yàn)采用自擬解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎大鼠的作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD大鼠60只，雄性，體重180～220 g，8周齡，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2008-0020，動(dòng)物適應(yīng)3天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

自擬解酒護(hù)肝湯的藥物組成：葛根20 g、連翹20 g、石菖蒲20 g、茵陳20 g、虎杖20 g、柴胡20 g、甘草10 g，水煎煮，濃縮后生藥量為2 g/L。

1.3 試劑與儀器

兔IgG-免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，型號(hào)：SV1022)，Rat-TNFα ELISA試劑盒(BIOVALUE公司，批號(hào)：BV-E13052505)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130402)，葛根、連翹、石菖蒲、茵陳、虎杖、柴胡和甘草(廣州市嶺南中藥飲片有限公司，批號(hào)：131101)，賽科希德SA-5000自動(dòng)血流變測(cè)試儀(北京寒科希特科技發(fā)展有限公司)，BX50F-3型OLYMPUS顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，F(xiàn)A(N)/JA(N)系列電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，Bio-Rad 450型酶標(biāo)儀。

1.4 動(dòng)物模型及分組

SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只?？瞻讓?duì)照組給予等體積生理鹽水，分次灌胃，持續(xù)4周。陽性對(duì)照組、模型對(duì)照組和解酒護(hù)肝湯治療組均按體重用56%酒精給予灌胃，7 mL/kg，1天1次，持續(xù)4周[5]。從造模后第5周起，陽性對(duì)照組和解酒護(hù)肝湯治療組分別灌胃給予西樂葆0.05 mg/kg，解酒護(hù)肝湯低、中、高劑量(5.0 mg/kg，15.0 mg/kg，30.0 mg/kg)，持續(xù)30天；空白對(duì)照組和模型對(duì)照組則分別給予等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)10天。末次給藥后禁食24小時(shí)，10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，所有動(dòng)物經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，取肝臟組織分別在10%福爾馬林和4%多聚甲醛中固定。

1.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

生化指標(biāo)測(cè)定：血清中MDA、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)檢測(cè)分別嚴(yán)格按試劑盒要求操作。血清轉(zhuǎn)氨酶的變化：全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清AST、ALT含量。肝臟的臟器系數(shù)：通過各組大鼠肝臟的質(zhì)量與相應(yīng)的大鼠體重的比值來計(jì)算出肝臟的臟器系數(shù)。肝組織病理學(xué)檢查：常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織學(xué)變化。肝組織TNF-α的免疫組化檢查：常規(guī)石蠟包埋，作5 μm切片，免疫組化SABC法染色，DAB顯色。以組織細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色沉淀，染色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者為陽性表達(dá)，用磷酸鹽緩沖液作為陰性對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎大鼠的生化指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的MDA、TNF-α顯著增加(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組，解酒護(hù)肝湯中、高劑量組的MDA、TNF-α都顯著減少(P<0.05)。見表1。

表1 解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎大鼠的MDA、TNF-α的影響

注： 與模型對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01。

2.2 解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎大鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的ALT、AST顯著增加(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組，解酒護(hù)肝湯低、中、高劑量組的ALT、AST都顯著減少(P<0.01)。見表2。

表2 解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎大鼠的血清ALT、AST的影響

注： 與模型對(duì)照組比較，aP<0.01。

2.3 解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎大鼠的肝臟臟器系數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的肝臟臟器系數(shù)顯著減少(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、解酒護(hù)肝湯高劑量組的肝臟臟器系數(shù)都顯著增加(P<0.05)。見表3。

表3 解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎大鼠的肝臟臟器系數(shù)的影響

注： 與模型對(duì)照組比較，aP<0.05。

2.4 解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎大鼠肝臟病理組織的影響

圖1結(jié)果呈示，空白對(duì)照組大鼠肝小葉清晰，肝細(xì)胞索排列尚整齊，未見肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松化，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組大片肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松化，肝細(xì)胞索紊亂，有灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及輕度纖維增生。浸潤(rùn)的炎細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主，未見纖維間隔形成。陽性對(duì)照組與解酒護(hù)肝湯治療組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞胞質(zhì)輕度疏松化，較模型組輕，未見明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維增生。陽性對(duì)照組、解酒護(hù)肝湯治療組與模型對(duì)照組大鼠的肝臟病理比較，炎癥及纖維化增生程度均比模型對(duì)照組輕，這提示解酒護(hù)肝湯有減輕酒精引起的肝細(xì)胞的炎癥程度。

2.5 解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎大鼠肝臟TNF-α表達(dá)的影響

圖2結(jié)果呈示，空白對(duì)照組沒有TNF-α的表達(dá)，在模型對(duì)照組及解酒護(hù)肝湯各劑量組都有TNF-α的表達(dá)，可觀察到模型對(duì)照組的棕黃色較深，而解酒護(hù)肝湯低、中、高劑量組的棕黃色逐漸變淺，且棕黃色的范圍也逐漸減少。

3 討論

酒精性肝病的病因主要是乙醇在肝細(xì)胞內(nèi)分解代謝，乙醇在肝細(xì)胞質(zhì)的乙醇脫氧酶的作用下氧化為乙醛，乙醛為高活性化合物，能干擾肝細(xì)胞多方面的功能[1-2]，引起肝細(xì)胞代謝紊亂，使肝細(xì)胞變性和壞死，并發(fā)炎癥反應(yīng)以及膠原纖維和結(jié)節(jié)增生[6]。自擬解酒護(hù)肝湯方中的柴胡、茵陳、虎杖、葛根清利肝膽濕熱，柴胡行氣活血化瘀，葛根有解酒毒之功，甘草調(diào)合藥性，諸藥配合，共奏護(hù)酒肝、解酒毒，改善肝功能作用。

ALT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶可進(jìn)入血中，引起血ALT升高。

注：A空白對(duì)照組;B模型對(duì)照組;C陽性對(duì)照組；D解酒護(hù)肝湯低劑量組；E解酒護(hù)肝湯中劑量組；F解酒護(hù)肝湯高劑量組

注：A空白對(duì)照組；B模型對(duì)照組；C陽性對(duì)照組；D解酒護(hù)肝湯低劑量組；E解酒護(hù)肝湯中劑量組；F解酒護(hù)肝湯高劑量組

AST、γ-GT、LDH也存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，AST分布于線粒體內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞損害嚴(yán)重時(shí)，線粒體內(nèi)AST釋放入血，使血清AST升高大于ALT[7]。由于整個(gè)肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶含量約為血中含量的100倍，所以肝臟實(shí)質(zhì)性損害時(shí)，只要有1%的肝細(xì)胞壞死，就可使血清酶活性增加1倍。當(dāng)細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，即使無壞死，因肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶濃度高于血清1000～5000倍，可順濃度差而釋放入血[8]。因此轉(zhuǎn)氨酶是肝細(xì)胞損害的敏感標(biāo)志，也是乙醇所致肝損傷最敏感的指標(biāo)。

MDA是自由基攻擊膜不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，可以與蛋白質(zhì)的游離氨基作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[9]。正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)的MDA含量是極低的，其含量的高低可以反映機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的程度。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，肝臟庫否氏細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)活化后大量分泌的TNF-α等細(xì)胞因子是引起肝細(xì)胞壞死的重要介質(zhì)，TNF-α的產(chǎn)生是酒精性肝損傷最早的反應(yīng)之一[10-11]。

本研究結(jié)果觀察到，模型對(duì)照組的ALT、AST、MDA和TNF-α比空白對(duì)照組顯著增加，符合酒精性肝炎的臨床基本指征[4]。與模型對(duì)照組比較，解酒護(hù)肝湯各劑量組的ALT、AST都顯著減少(P<0.01)，這說明解酒護(hù)肝湯對(duì)模型大鼠肝臟損傷有減緩作用；解酒護(hù)肝湯中、高劑量組的MDA顯著減少(P<0.01)，這說明解酒護(hù)肝湯有抗氧化的作用；解酒護(hù)肝湯各劑量組的肝臟TNF-α表達(dá)都減少，說明解酒護(hù)肝湯對(duì)模型大鼠肝臟有抗炎作用；解酒護(hù)肝湯高劑量組的肝臟臟器系數(shù)顯著減少(P<0.05)，各劑量組肝臟炎癥及纖維化增生程度減輕，說明解酒護(hù)肝湯對(duì)模型大鼠的肝臟有保護(hù)作用。

綜上所述，自擬解酒護(hù)肝湯對(duì)酒精性肝炎模型大鼠可以緩解肝臟損傷，有抗氧化和抗炎作用，為自擬解酒護(hù)肝湯在臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 徐正婕,陸倫根.酒精性肝病的流行病學(xué)和自然史[J].中國(guó)處方藥，2010,(1):32-33.

[2] 厲有名.酒精性肝病的流行病學(xué)特點(diǎn)[J].實(shí)用肝臟病雜志，2012,15(3):180-182.

[3] 陳大堯，秦文喜.飲酒對(duì)血脂影響的調(diào)查研究[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2001，4(1):26-27.

[4] 關(guān)永霞，李曉梅，張永霞，等. 化滯柔肝顆粒對(duì)酒精聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的酒精性肝炎小鼠的保護(hù)作用[J].實(shí)用肝臟病雜志，2015，18(5):530-533.

[5] 陳奇.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：837.

[6] 韓振國(guó)，王巖，李國(guó)棟.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/擴(kuò)散因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)腫瘤血管再生的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2004，30(3):376-377.

[7] 河福金，賁長(zhǎng)恩，王德福，等.小柴胡湯對(duì)大鼠酒精性肝損傷的防護(hù)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，1995，4(1):19-21.

[8] 梁擴(kuò)寰，李紹白.肝臟病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1995:208.

[9] Papadlm IE，Loumbourdis NS.Exposure of the frog Rana ridibunda to coppe rimpact on two biomarkers，lipid peroxidation，and glutathione[J].Bulletin Environment Contaminant Toxicology，2002，69(6)：885-891.

[10] 方志紅,崔劍巍,胡義揚(yáng)，等.酒精性肝病的內(nèi)毒素?fù)p傷機(jī)制[J].中華肝臟病雜志,2005,13(8):636-638.

(本文編輯： 禹佳)

EffectsofJiejiuHuganDecoctiononAlcoholicHepatitisinRats

MARuanxin，WANGXiaodong，JIANGXiaomei.

TheSixthAffilitedHospitalOfSUNYatsenUniversity，Guangzhou510655,China

ObjectiveTo study the effects ofJiejiuHuganDecoction on alcoholic hepatitis in rats.MethodsSD rats were randomly divided into 6 groups (n=10). Model preparation was gastric gavage with 35% alcohol (15 ml/kg) for 4 weeks, once a day. After models were built, positive control group was given celebrex 0.05 mg/kg, and protect liver soup group was given,JiejiuHugandecoction low, medium and high dose (5.0 mg/kg, 15.0 mg/kg, 30.0 mg/kg) for 30 days. After the last administration, blood was collected by abdominal aortic blood, and liver tissue was weighed and fixed. The serum ALT, AST and MDA were detected. TNF-α in serum and liver was detected by ELISA and immunohistochemical method. And the HE staining was used to observe liver.ResultsCompared with the model group, the level of ALT, AST, MDA and TNF-α ofJiejiuHugandecoction was significantly reduce(P<0.05). The expressions of TNF-alpha and organ coefficients in liver were reduced inJiejiuHugandecoction groups and liver damage was slowed down.ConclusionJiejiuHugandecoction has a protect effect on alcoholic hepatitis in rats.

JiejiuHuganDecoction; alcoholic hepatitis; Serum; Rats; TNF-α

510655 廣州，中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院藥學(xué)部(馬阮昕、王曉東)；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部(江曉妹)

馬阮昕(1986-)，女，本科，初級(jí)藥師。研究方向：藥學(xué)研究。E-mail：657078890@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.08.002

2016-07-03)