羅燕，徐崇明，段麗群

(湖北省腫瘤醫(yī)院 胸部放療科，湖北 武漢 430079)

外源性信號素3A信號通路對轉(zhuǎn)化生長因子- β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞侵襲、增殖的影響

羅燕，徐崇明，段麗群

(湖北省腫瘤醫(yī)院 胸部放療科，湖北 武漢 430079)

目的：探討外源性信號素3A(Sema 3A)信號通路對轉(zhuǎn)化生長因子- β1(TGF- β1)誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞侵襲、增殖的影響及可能作用機(jī)制。方法：將肺癌A549細(xì)胞分為3組，即空白對照組、TGF- β1誘導(dǎo)組(TGF- β1組)、Sema 3A預(yù)處理組(Sema 3A+TGF- β1組)?？瞻讓φ战M細(xì)胞正常培養(yǎng)；TGF- β1組加入5 μg·L-1TGF- β1；Sema 3A+TGF- β1組首先加入10 μmol·L-1Sema 3A，預(yù)處理40～50 min后再加入5 μg·L-1TGF- β1。檢測細(xì)胞增殖、侵襲能力和E- cadherin、Akt、P- Akt蛋白表達(dá)。結(jié)果：Sema 3A+TGF- β1組細(xì)胞Sema 3A mRNA相對表達(dá)水平顯著高于空白對照組和TGF- β1組(均P<0.05)。培養(yǎng)36 h～72 h內(nèi)，TGF- β1組細(xì)胞增殖率顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，Sema 3A+TGF- β1組細(xì)胞增殖率顯著高于空白對照組(均P<0.05)。TGF- β1組穿透濾膜細(xì)胞數(shù)顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，Sema 3A+TGF- β1組穿透濾膜細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)。TGF- β1組E- cadherin蛋白表達(dá)顯著低于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，P- Akt蛋白顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)；Sema 3A+TGF- β1組E- cadherin蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組(P<0.05)，P- Akt顯著高于空白對照組(P<0.05)。結(jié)論：Sema 3A能夠抑制TGF- β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞侵襲、增殖的效應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制Akt磷酸化、上調(diào)E- cadherin表達(dá)有關(guān)。

肺癌；外源性信號素3A；信號通路；轉(zhuǎn)化生長因子- β1；Akt磷酸化

侵襲和轉(zhuǎn)移是影響肺癌復(fù)發(fā)和死亡的主要原因之一[1- 2]。探討影響肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的信號路徑，能夠?yàn)榉伟┗蛑委煹姆肿幼饔冒悬c(diǎn)提供依據(jù)。研究[3]證實(shí),上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial- mesenchymal transition, EMT)與惡性腫瘤多種生物學(xué)行為密切相關(guān)，也是腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素。信號素3A(semaphorin 3A, Sema 3A)屬于信號素家族成員之一，能夠抑制PI3K和Akt磷酸化而抑制軸突的導(dǎo)向作用[4]。最近一項(xiàng)研究[5]顯示，Sema 3A能夠抑制非小細(xì)胞肺癌發(fā)生EMT，使肺癌細(xì)胞遷移能夠減弱，從而抑制肺癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究首先用外源性Sema 3A對A549細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，再通過轉(zhuǎn)化生長因子- β1(transforming growth factor- β1, TGF- β1)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞株A549發(fā)生EMT，觀察Sema 3A對A549細(xì)胞侵襲、遷移的影響及可能的作用機(jī)制，旨在為肺癌的基因治療提供依據(jù)，現(xiàn)將研究成果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院細(xì)胞資源中心，二甲基亞砜(DMSO)、溴化乙錠、胎牛血清、MTT染料、DMEM培養(yǎng)基、RPMI- 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、β- 肌動(dòng)蛋白(β- actin)購自美國Sigma公司，RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS- PAGE凝膠配制試劑盒、SDS- PAGE轉(zhuǎn)膜液、電泳液購自蘇州碧云天公司，TGF- β1購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，小鼠來源Sema 3A多克隆抗體、β- actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購均購自北京天根生化科技有限公司，Prime Script?反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeScript?RT Enzyme MixⅠ、RT Primer Mix、SYBR?Premix EX Taq TMⅡ購自寶生物工程(大連)有限公司，E- 鈣黏蛋白(E- cadherin)多克隆抗體購自美國Invitrogen公司，Phospho- Akt(P- Akt)、Akt抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Transwell小室購自美國Costar公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。取生長旺盛期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，待細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞收縮變圓時(shí)將消化液棄去，加入培養(yǎng)基終止消化。培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，并接種于培養(yǎng)瓶中體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理 將細(xì)胞分為空白對照組、TGF- β1誘導(dǎo)組(TGF- β1組)和Sema 3A預(yù)處理組(Sema 3A+TGF- β1組)。取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，空白對照組在含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；TGF- β1組在DMEM培養(yǎng)基(含0.5%胎牛血清)中加入5 μg·L-1TGF- β1；Sema 3A+TGF- β1組首先向DMEM培養(yǎng)基中加入10 μmol·L-1Sema 3A，預(yù)處理40～50 min后再加入5 μg·L-1TGF- β1。各組細(xì)胞均在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1.0×107個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，分別于0、12、24、36、48、60、72 h向每孔加入10 μl MTT(質(zhì)量濃度為5 g·L-1)溶液，培養(yǎng)4 h后將培養(yǎng)基棄去，再向每孔中加入150 μl DMSO，充分振蕩，置于酶標(biāo)儀上，通過測量各時(shí)段450 nm處吸光度值評價(jià)細(xì)胞增殖能力。

1.2.4 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)基將濃度調(diào)整為每孔1.0×109個(gè)細(xì)胞，Transwell上室每孔植入150 μl細(xì)胞，下室加入600 μl含有20%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基，每組分別設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)48 h，待培養(yǎng)結(jié)束后將Transwell小室濾膜用4%多聚甲醛固定，輕輕拭去表面細(xì)胞，結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，顯微鏡下觀察穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 RT- PCR檢測Sema 3A mRNA表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，參考RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，取5 μg總RNA，按照Prime Script?反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰箱4 ℃保存。采用RT- PCR檢測細(xì)胞Sema 3A mRNA表達(dá)，操作參考SYBR?Premix EX Taq TMⅡ試劑盒說明書，引物委托上海生工生物工程有限公司合成，Sema 3A引物序列上游為5′- GAGAAGCAGCATGAGGTGTATTGGA- 3′，下游為5′- GGATGTAGTTGAGGCACTCTGTCTG- 3′；β- actin引物序列上游為5′- CCAGCAAGAGCACAAGAGGAAGAG- 3′，下游為5′- GGTCTACATGGCAACTGTGAGGAG- 3′。以β- actin作為內(nèi)參照，檢測Sema 3A mRNA相對表達(dá)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測E- cadherin、Akt、P- Akt蛋白表達(dá) 向細(xì)胞中加入100 μl細(xì)胞裂解液充分裂解，4 ℃離心20 min(15 000 r·min-1)，吸取上清液，煮沸使蛋白變性。SDS- PAGE電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，電轉(zhuǎn)后脫脂牛奶封閉2 h，分別加入E- cadherin抗體、AKT抗體、p- AKT抗體、β- actin抗體，4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，再按照1∶1 000加入二抗，室溫下振蕩孵育2 h，PBS沖洗3次。ECL顯色，凝膠成像分析儀采集圖像，測定目的條帶灰度值，目的蛋白相對表對量為樣本條帶與β- actin條帶灰度值比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差(One- way ANOVA)分析，之后兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化

空白對照組細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞間排列緊密；經(jīng)TGF- β1誘導(dǎo)后，TGF- β1組細(xì)胞變成梭形，細(xì)胞間連接不明顯，呈離散狀態(tài)；給予Sema 3A處理后，Sema 3A+TGF- β1組細(xì)胞恢復(fù)橢圓形，細(xì)胞間存在連接。見圖1。

圖1 3組細(xì)胞形態(tài)變化(×200)

2.2 Sema 3A mRNA表達(dá)

RT- PCR檢測結(jié)果顯示，Sema 3A+TGF- β1組細(xì)胞Sema 3A mRNA相對表達(dá)水平顯著高于空白對照組和TGF- β1組(均P<0.05)，空白對照組Sema 3A mRNA相對表達(dá)水平又顯著高于TGF- β1組(P<0.05)，見圖2。

與TGF- β1組比較，aP<0.05; 與空白對照組比較，bP<0.05

圖2 3組細(xì)胞Sema 3A mRNA表達(dá)

2.3 細(xì)胞增殖和侵襲能力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3A)顯示，培養(yǎng)36～72 h TGF- β1組細(xì)胞增殖率顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，Sema 3A+TGF- β1組細(xì)胞增殖率顯著高于空白對照組(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3B)顯示，TGF- β1組穿透濾膜細(xì)胞數(shù)顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，Sema 3A+TGF- β1組穿透濾膜細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)。

2.4 E- cadherin、Akt、P- Akt蛋白表達(dá)

A.細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果; B.細(xì)胞侵襲能力檢測結(jié)果。與TGF- β1組比較，aP<0.05；與空白對照組比較，bP<0.05

圖3 細(xì)胞增殖和侵襲能力

Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF- β1組E- cadherin蛋白表達(dá)顯著低于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，P- Akt蛋白顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)；Sema 3A+TGF- β1組E- cadherin蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組(P<0.05)，P- Akt顯著高于空白對照組(P<0.05)；TGF- β1組、Sema 3A+TGF- β1組、空白對照組Akt蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

與TGF- β1組比較，aP<0.05；與空白對照組比較，bP<0.05

圖4 3組細(xì)胞E- cadherin、Akt、P- Akt蛋白表達(dá)水平

3 討 論

EMT是以細(xì)胞連接蛋白下調(diào)為基礎(chǔ)的生物學(xué)過程，并參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Sema 3A屬于軸突生長抑制因子，具有誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的作用，參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡。近年來研究[6]顯示，Sema 3A能夠抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，阻止腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移功能。在EMT過程中，緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)，蛋白激酶裂解基底膜，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生重組，細(xì)胞間黏附能力降低。另外EMT還會(huì)促進(jìn)應(yīng)力纖維的形成，增強(qiáng)細(xì)胞遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移的能力[7]。EMT能夠被分化因子和生長因子激活，其中TGF- β1被認(rèn)為是EMT的始動(dòng)因素。本研究對肺癌A549細(xì)胞株給予TGF- β1誘導(dǎo)，結(jié)果顯示TGF- β1組細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞間連接不明顯，呈離散狀態(tài)。提示TGF- β1能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT，通過改變細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞間連接，使A549細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。鄧陶然等[8]報(bào)道,TGF- β1能夠減弱細(xì)胞間的黏附作用，導(dǎo)致細(xì)胞處于離散狀態(tài)，使非小細(xì)胞肺癌獲得侵襲和遷移能力。Huang等[9]也證實(shí),TGF- β1是非小細(xì)胞化療耐藥、預(yù)后不佳的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10]證實(shí)，Sema 3A對多巴胺神經(jīng)元等細(xì)胞具有神經(jīng)毒性，在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Sema 3A通過與神經(jīng)纖毛蛋白1結(jié)合，拮抗血管內(nèi)皮生長因子的活性，導(dǎo)致腫瘤新生血管受阻，從而降低腫瘤微血管密度，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，在TGF- β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞前用Sema 3A預(yù)處理，細(xì)胞離散狀態(tài)受到抑制，細(xì)胞重新恢復(fù)緊密的連接，提示Sema 3A能夠抑制由TGF- β1誘導(dǎo)的EMT過程。MTT實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sema 3A預(yù)處理能夠明顯抑制A549細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Kaczmarek等[11]報(bào)道,Sema 3A能夠阻斷肌動(dòng)蛋白的重組，抑制張力絲的形成，使細(xì)胞間的黏附能力增加，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Sema 3A能夠介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過激活T淋巴細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮細(xì)胞毒作用抑制腫瘤細(xì)胞的生長[12]。另外,Sema 3A還能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞蛋白骨架延伸，并與血管內(nèi)皮生長因子競爭性結(jié)合單核細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤生長相關(guān)巨噬細(xì)胞由誘導(dǎo)腫瘤生長轉(zhuǎn)化為抗腫瘤作用[13]。

PI3K/Akt信號通路是與腫瘤進(jìn)展、侵襲密切相關(guān)的信號通路，PI3K被激活并產(chǎn)生磷脂產(chǎn)物，進(jìn)一步激活A(yù)kt并介導(dǎo)下游級聯(lián)反應(yīng)，因此PI3K/Akt也是聯(lián)系細(xì)胞外信號和細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答的重要橋梁信號路徑[14]。Sema 3A能夠通過第10號染色體同源丟失性磷酸酯酶-張力蛋白參與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路。Vadasz等[15]報(bào)道,Sema 3A與Plexin A特異性結(jié)合，抑制Ras，鈍化PI3K/Akt信號通路。PI3K/Akt信號通路被激活后，活化的Akt第Ser- 136位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，并釋放Bcl- 2蛋白，發(fā)揮細(xì)胞凋亡作用。Akt磷酸化能夠下調(diào)E- cadherin蛋白表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞黏附力降低，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力[16- 17]。本研究結(jié)果顯示,Sema 3A預(yù)處理后能夠抑制P- Akt蛋白表達(dá),增加E- cadherin蛋白表達(dá)，說明Sema 3A可能通過鈍化PI3K/Akt信號通路，抑制Akt磷酸化，并上調(diào)E- cadherin表達(dá)，增強(qiáng)A549細(xì)胞侵襲、增殖抑制能力。

綜上所述，Sema 3A能夠抑制TGF- β1誘導(dǎo)的侵襲、增殖作用，其機(jī)制可能與抑制Akt磷酸化、上調(diào)E- cadherin表達(dá)有關(guān)。

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Effect of semaphorin 3A signaling pathway on invasion and proliferation of lung cancer cells induced by transforming growth factor- β1

LUO Yan,XU Chong- ming,DUAN Li- qun

(DepartmentofChestRadiotherapy,HubeiProvinceTumorHospital,Wuhan430079,China)

Objective: To explore the effect of semaphorin 3A (Sema 3A) signaling pathway on invasion and proliferation of lung cancer cells induced by transforming growth factor - β1 (TGF- β1) and its mechanisms. Methods: The lung cancer A549 cells were divided into three groups: blank control group (control), TGF- β1 induced group (TGF- β1), 3A Sema pretreatment group (Sema 3A+TGF- β1). The control group was cultured with normal cultured, 5 μg·L-1TGF- β1 was added in TGF- β1 group, 10 μmol·L-1of Sema 3A was firstly added and pretreated for 40- 50 min and then 5 μg·L-1of TGF- β1 added in the Sema 3A+TGF- β1 group. Cell proliferation, invasion ability and the expression level of E- cadherin, Akt, P- Akt protein was measured. Results: After Sema 3A pretreatment, the Sema 3A+TGF- β1 group cells were round or oval. Sema 3A mRNA relative expression level in Sema 3A+TGF- β1 group were significantly higher than that in the control group and the TGF- β1 group(P<0.05). In 36- 72 h, the proliferation rate of TGF- β1 group was significantly higher than in Sema 3A+TGF- β1 group and the control group(P<0.05), the proliferation rate in Sema 3A+TGF- β1 group was significantly higher than that in the control group(P<0.05). The migrated cells number was significantly higher than that in Sema 3A+TGF- β1 group and the control group(P<0.05),migrated cell number in Sema 3A+TGF- β1 group was significantly higher than that in the control group(P<0.05). The expression of E- cadherin protein was significantly lower than that in Sema 3A+TGF- β1 group and the control group, P- Akt protein was significantly higher than that in Sema 3A+TGF- β1 group and the control group(P<0.05). E- cadherin protein in Sema 3A+TGF- β1 group was significantly lower than that in the control group, P- Akt protein was significantly higher than that in the control group(P<0.05). Conclusion: Sema 3A can inhibit invasion and proliferation induced by TGF- β1, the mechanism may be related to the inhibition of Akt phosphorylation and up regulation of E- cadherin expression.

lung cancer; semaphorin 3A; signal pathway; transforming growth factor- β1; Akt phosphorylation

2016- 12- 13

2017- 05- 04

羅燕(1979-)，女，湖北武漢人，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。E- mail:luoyan197904@163.com

羅燕,徐崇明,段麗群.外源性信號素3A信號通路對轉(zhuǎn)化生長因子- β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞侵襲、增殖的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2017，36(4)：609- 614.

R734.2

A

1671- 6264(2017)04- 0609- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.023