郝 鑫 張 剛 李 中

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，河北 保定 071000)

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中p-AKT的表達(dá)

郝 鑫 張 剛 李 中

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，河北 保定 071000)

目的探討人乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織內(nèi)p-AKT的功能和作用。方法對100例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織和30例正常乳腺組織內(nèi)p-AKT蛋白及mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行Western印跡和RT-PCR檢測。結(jié)果乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織和正常乳腺組織中p-AKT蛋白及mRNA的表達(dá)有顯著差異(P<0.05)；p-AKT蛋白及mRNA在乳腺癌不同臨床分期中表達(dá)存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論p-AKT的表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)生及臨床病理相關(guān)，可作為一個新的評價乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)。

乳腺癌；p-AKT；Western印跡；RT-PCR

AKT是一種Ser/Thr蛋白〔1〕，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號通路中的重要分子，而p-AKT是Akt的活化形式。PI3K/AKT信號通路參與了許多生理及病理過程，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及腫瘤的血管生成，其通過影響其下游多個效應(yīng)分子的活化狀態(tài)而發(fā)揮作用。本文觀察乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織p-AKT的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1研究對象 河北大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2010年1月至2013年5月100例臨床手術(shù)切除乳腺癌標(biāo)本，年齡35～78歲，平均(48.35 ± 5.14)歲。30例正常乳腺組織(即與標(biāo)本對應(yīng)的位于癌邊緣≥5 cm處的癌旁組織)，年齡36～72歲，平均(40.52 ± 5.13)歲。在手術(shù)之后進(jìn)行的常規(guī)腋淋巴結(jié)檢查中，每位病例檢取>10枚的淋巴結(jié)，常規(guī)石蠟包埋制成4 μm厚切片以方便對免疫組織的化學(xué)染色。為開展后續(xù)的RT-PCR和Western印跡檢測法，對乳腺癌新鮮組織進(jìn)行收集，液氮保存。

1.2試劑及器械 兔抗人p-AKT單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、引物合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、β-actin一抗(鼠抗人單克隆抗體)〔美國賽默飛世爾科(InvitrogenTM)〕、β-actin二抗(山羊抗鼠多克隆抗體)(美國 KPL公司)、紫外分光光度儀〔美國beckman公司(DU800)〕、酶標(biāo)儀MK3〔雷勃公司(Thermo labsystems)〕、DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海信然實業(yè)有限公司)、PTC-220-PCR擴增儀(美國Research 公司)2020D紫外熒光數(shù)字成像儀(GoldSpring產(chǎn)品)。

1.3Western印跡操作方法 -80℃下新鮮保存乳腺癌組織取1份，適量(50～80 mg)選取乳腺良性病變組織1份。剪碎后，在勻漿器內(nèi)添加400 μl單去污劑裂解液(含PMSF)，4℃ 12 000 r/min離心5 min后，去上清后用Eppendorf管進(jìn)行分裝，至于-20℃進(jìn)行保存。對BCA工作液內(nèi)的蛋白濃度進(jìn)行測定，分別配置12%分離膠以及5%濃縮膠，在泳道邊緣加1倍上樣緩沖液，接80 V電壓電極至濃縮膠，在分離膠時將電壓上調(diào)至120 V直至帶染料的蛋白質(zhì)到分離膠底部處即可停止。結(jié)束電泳之后，按照目的蛋白分子量對膠體進(jìn)行切割，轉(zhuǎn)膜2 h。在裝有5%脫脂奶粉封閉液的盒體中加入轉(zhuǎn)好的PVDF膜，置于4℃搖床上封閉2 h；雜交袋中倒入雜交膜，再倒入已過稀釋的一抗工作液于37℃孵化培育2 h或者過夜，三次TBST洗膜分別耗時15、10、10 min。按1∶5 000的比例對二抗進(jìn)行稀釋，1 h到時后TBST洗膜倒入稀釋的二抗，3次事件均為5 min；顯影再定影。用p-AKT/ β-actin灰度值來代表P-AKT蛋白的相對表達(dá),灰度經(jīng)過Quantity One 軟件進(jìn)行分析工作。

1.4RT-PCR操作方法 對p-AKT片段擴增至196 bp，其中p-AKT引物序列如下：正義鏈：5'-GTGCTGGAGGACAATGACT ACGG-3'；反義鏈:5'-AGCAGCCCTGAAAGCAAGGA-3'。β-actin片段擴增(250 bp)，引物序列：正義鏈:5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'；反義鏈:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。在冰浴之下剪碎100 mg取于液氮內(nèi)保存后置于勻漿器的組織，立即倒入1 ml預(yù)冷后的Trizol提取液，進(jìn)行勻漿工作。再將勻漿液倒入1.5 ml Eppendorf管中，靜置5 min。對總RNA進(jìn)行提取和檢測純度工作。如果 OD260/280比值1.8～2.0，說明RNA無降解現(xiàn)象及無蛋白污染。取0.3 μg總RNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件：30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為10 μl。對p-AKT擴增的反應(yīng)條件如下：于94℃下預(yù)變性2 min；94℃下進(jìn)行變性30 s，59℃下進(jìn)行30 s退火 ，1 min 72℃延伸 ，在進(jìn)行30次循環(huán)；10℃ 10 min延伸。對4%瓊脂糖凝膠。進(jìn)行45 min 120 V的電泳。使用ZF型的紫外透射反射分析儀進(jìn)行攝像工作，使用Quantity one4.62版軟件統(tǒng)計各條帶的積分光密度值，通過積分光密度值的比值對各樣本組間差異進(jìn)行定量分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1p-AKT蛋白與mRNA在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá) Western印跡檢測結(jié)果表明：正常乳腺組織中p-AKT蛋白的相對表達(dá)量是0.37±0.08，明顯低于癌組織(0.79±0.15，P<0.05)。RT-PCR結(jié)果表明：在正常乳腺組織中，p-AKT mRNA的相對表達(dá)量是0.35±0.17，顯著小于癌組織(0.78±0.16，P<0.05)。兩方法結(jié)果一致。見圖1，圖2。

2.2p-AKT蛋白及mRNA與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，p-AKT蛋白及mRNA表達(dá)水平與臨床分期有關(guān)(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織分級與年齡和腫瘤直徑無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 p-AKT蛋白及mRNA與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系(±s)

3 討 論

多種途徑或方法可顯著激活PI3K〔2,3〕,活化后的PI3K繼續(xù)激活可與細(xì)胞內(nèi)的信號蛋白相結(jié)合；以活化底物 PIP2和PIP3來作為第二信使，逐級進(jìn)行激活工作，最后，形成信號級聯(lián)復(fù)合物，通過對在 Thr308 和Ser473 位點的磷酸化而激活A(yù)KT。PI3K/AKT信號通路在腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展擴大的過程里扮演著不可忽視的角色。AKT，同源于能致小老鼠得白血病的病毒癌基因v-AKT 所編碼出得癌蛋白，很多因素會在其活化的過程中產(chǎn)生影響作用，如激素、生長因子和細(xì)胞因子等〔4〕。下游的分子會在激活的AKT作用下展開的細(xì)胞的增殖、分化乃至炎癥過程〔5〕。并且，此通路中任一信號分子表達(dá)上升或者下調(diào)都會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡，增殖以及侵襲等等方面的特殊情況發(fā)生。肺癌組織中AKT表達(dá)高水平，且與肺癌的分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期息息相關(guān)〔6〕。Zhang等〔7〕采用免疫組化以及熒光定量對11例正常小腸組織和53例小腸腺癌組織進(jìn)行檢測出后發(fā)現(xiàn)，在小腸腺癌癌變組織內(nèi)的PI3K/AKT信號通路被高度活化，表明PI3K/AKT信號通路可作為臨床潛在治療靶點〔7〕。彭雅亞〔8〕對PI3K/AKT信號通路在乳腺癌 、癌旁正常組織、乳腺纖維腺瘤中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測和研究之后發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路是乳腺癌產(chǎn)生和發(fā)展的重要可能誘因。惡性腫瘤在不斷的轉(zhuǎn)化過程中AKT身影不可忽視，活化之后的AKT經(jīng)由細(xì)胞存活信號的釋放，使其下游靶蛋白磷酸化，抑制或激活，下游靶蛋白分子有Bad，caspase-9及 Forkhead等〔9,10〕。其中Bad來源于Bcl-2家族，能使細(xì)胞凋亡。在生理狀態(tài)下，Bad 結(jié)合 Bcl-xl形成復(fù)合物發(fā)揮出促進(jìn)凋亡的功能，而活化的AKT促使Bad磷酸化最終會妨礙復(fù)合物的形成，中止凋亡的發(fā)生〔11〕。caspase-9經(jīng)AKT活化后，對細(xì)胞色素C誘導(dǎo)的半胱天冬酶活化有著抑制的功能。Ser183 和 Ser196是處于caspase-9上兩個AKT磷酸化的位點，尤其Ser196具有重要作用，AKT對caspase-9磷酸化后，降低了其蛋白酶活性進(jìn)而弱化其促進(jìn)凋亡的功能。Forkhead家族對多種凋亡因子的表達(dá)具有誘導(dǎo)作用，而AKT則經(jīng)磷酸化Forkhead家族磷間接由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)對其凋亡過程產(chǎn)生抵制和弱化作用。本文結(jié)果表明PI3K/AKT信號通路在乳腺癌的產(chǎn)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要功能。

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〔2016-03-04修回〕

(編輯 曹夢園)

河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)和基礎(chǔ)課題研究計劃項目(361007)；2017年河北大學(xué)“河北省研究生創(chuàng)新資助項目”(X201738)

李 中(1966-)，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事乳腺腫瘤學(xué)研究。

郝 鑫(1990-)，女，碩士，主要從事乳腺腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)16-3938-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.013