臧延青，何飛，李執(zhí)坤，馮艷鈺，張超

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

野生蒲公英花多酚的提取和體外抗氧化活性研究

臧延青，何飛，李執(zhí)坤，馮艷鈺，張超

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

以Fenlin-Ciocalten法測(cè)定蒲公英花多酚（DFP）含量，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)來(lái)確定DFP的最佳提取條件，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶15（g·mL-1），提取溫度40℃，提取時(shí)間

40 min。在最優(yōu)提取條件下DFP的得率為2.31%?？寡趸囼?yàn)結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)DFP對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率分別為68.43%、89.35%、76.55%，表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。表明東北野生蒲公英可以作為功能性食品原料具有良好的開(kāi)發(fā)前景。

蒲公英花；多酚；提取工藝；抗氧化活性

蒲公英（Toraxacum mongolicum Hand.Mazz）是菊科植物中的一種多年生草本植物，原產(chǎn)于歐洲，廣泛分布于北半球的暖溫帶地區(qū)[1]。我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，資源豐富，據(jù)《本草綱目》記載，蒲公英性平味甘、微苦、性寒、有清熱解熱消腫之用，且對(duì)治療肝熱目腫痛、熱毒所致的瘡毒有良好的功效[2]。《神農(nóng)本草經(jīng)》《唐本草》等也對(duì)蒲公英在利尿、緩瀉、退黃疸、利膽的功效方面進(jìn)行了更全面的描述，并對(duì)其給予了高度評(píng)價(jià)[3]。現(xiàn)代研究表明，蒲公英具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功效，在食品、藥品、保健品等方面具有良好的開(kāi)發(fā)前景及應(yīng)用價(jià)值[4]。蒲公英含有多種化合物，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從蒲公英中提取分離出許多化學(xué)成分，主要包括黃酮類、倍半萜內(nèi)酯類、香豆素類、三萜類、植物甾醇類、酚酸類、胡蘿卜素類等，此外還含有多種脂肪酸、糖、膽堿、維生素、礦物質(zhì)、果膠、蛋白質(zhì)物質(zhì)[5]。

植物多酚在抗氧化、抗誘變、抗腫瘤、抗病毒、降血脂、抗衰老等很多方面具有良好的生物活性和藥理活性[6-9]。蒲公英的生物活性成分被不斷發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，研究表明，蒲公英葉片提取物具有治療非酒精脂肪肝的效果[10]，蒲公英根提取物可以殺傷前列腺癌細(xì)胞[11]，蒲公英水提物能夠抵抗流感病毒[12]。目前，蒲公英的功效研究多集中在葉片及根的健康功效，對(duì)于蒲公英花中所含多酚的研究較少。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)初步研究了東北野生蒲公英花多酚的提取工藝及其抗氧化活性，為開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)的天然抗氧化劑和功能性食品提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

東北野生蒲公英花，2013年5～6月采于黑龍江省大慶市薩爾圖區(qū)，55℃烘干冷藏，粉碎，60目過(guò)篩，備用。

1.2 儀器與試劑

722 s分光光度計(jì)，上海分析儀器總廠制造；DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海森信公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇省榮華儀器制造有限公司；HH.W21.600型電熱恒溫水箱江蘇省榮華儀器制造有限公司；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

茶多酚北京中生泰瑞科技有限公司，純度≥98%；DPPH日本Ruitaibio公司；沒(méi)食子酸上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，純度≥98%；其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及蒲公英花多酚量測(cè)定

配制0.5 mg·mL-1沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL，分別取溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，置于25 mL容量瓶中，蒸餾水定容。分別取5 mL于100 mL容量瓶中，加入4 mL Folin試劑，搖勻，靜置4～5 min。然后加入8 mL 10%Na2CO3溶液，75℃恒溫水浴10 min。顯色之后在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

稱取蒲公英花粉末1.00 g，在一定條件下浸提、抽濾，重復(fù)兩次，合并上清液，濃縮，除去乙醇，測(cè)定多酚含量。

多酚含量計(jì)算公式：

蒲公英花多酚（%）=（m/M）×100%

m-提取物質(zhì)量，M-蒲公英花質(zhì)量

1.3.2 蒲公英花多酚提取工藝條件

稱取1 g蒲公英花粉末，選取料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。以多酚提取量為考察指標(biāo)，乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%），提取溫度（30、40、50、60、70℃），料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30），提取時(shí)間（30、40、50、60、70 min）作為試驗(yàn)因素，研究各個(gè)因素對(duì)DFP提取量的影響。在單因素基礎(chǔ)上，采用4因素3水平正交設(shè)計(jì)探討DFP提取的最佳工藝。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1Factors and levels of orthogonal array design

1.3.3 蒲公英花多酚對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定

采用周向軍等[14]的方法并稍作修改，以95%乙醇為溶劑準(zhǔn)確配制成0.1 mg·L-1DPPH溶液。取DPPH溶液3 mL，加入1 mL DFP樣液，搖勻，避光靜置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度值。按照相同方法分別測(cè)定1 mL 95%乙醇溶劑與3 mL DPPH溶液，1 mL DFP樣液與3 mL 95%乙醇溶液在517 nm處的吸光度值。用茶多酚（TP）代替DFP進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)DFP樣液進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

DPPH清除率按如下公式計(jì)算：

式中：A1—DFP樣液與DPPH測(cè)定的吸光度值；

A2—95%乙醇與DPPH測(cè)定的吸光度值；

A3—DFP樣液與95%乙醇測(cè)定的吸光度值。

1.3.4 蒲公英花多酚對(duì)羥基自由基（·OH）清除率的測(cè)定

采用王永寧等[15]的方法并稍作修改，在25 mL試管中依次加入5 mL 2 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液和5 mL的6 mmol·L-1雙氧水溶液，混合均勻后用6 mmol·L-1水楊酸滴定至刻度。在36～37℃條件下恒溫水浴15 min，在510 nm處測(cè)定吸光度為A0。重新配制一份上述體系的溶液，在相同條件下，加入1 mL DFP樣液?；靹蚝?，于36～37℃條件下恒溫水浴15 min，測(cè)定在510 nm處的吸光度值為Ax。用茶多酚（TP）代替DFP進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

向10 mL試管中先后加入5 mL pH=8.4的磷酸鹽緩沖液，2 mLDFP樣液，0.1 mL 4.5 mmol·L-1鄰苯三酚溶液。25℃條件下恒溫水浴10 min，加入2滴鹽酸終止反應(yīng)，于420 nm處測(cè)定吸光度值，記為Ai。同時(shí)，向空白管依次加入5 mL PH=8.4的磷酸鹽緩沖液，2 mL蒸餾水，0.1 mL 4.5 mmol·L-1鄰苯三酚溶液。于420 nm處測(cè)定吸光度值，記為Aj。用茶多酚（TP）代替DFP進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)[16]。

超氧陰離子清除率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.1所述操作，得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.011 0 x+0.002 5，R2=0.992 2。說(shuō)明沒(méi)食子酸在濃度0～60 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蒲公英花多酚提取率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)DFP提取量的影響Fig.1The effect of ethanol concentration on extraction rate of DFP

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，DFP的提取率先增加后緩慢減小。低濃度乙醇提取時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶液之間的氫鍵和疏水鍵相互作用，使得DFP能更好的被提取出來(lái)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)，也達(dá)到最大的提取率。繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，有機(jī)溶劑與蒲公英花多酚極性差異變大，多酚提取率不再增加，甚至?xí)徛陆礫17]。因此，采用50%的乙醇體積分?jǐn)?shù)，能使DFP提取率達(dá)到最大，為最佳提取條件。

2.2.2 提取溫度對(duì)蒲公英花多酚提取率的影響

圖2 提取溫度對(duì)DFP提取率的影響Fig.2TheeffectofextractiontemperatureonextractionrateofDFP

由圖2可知，提取溫度對(duì)DFP的提取率具有較大的影響。在30～50℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，DFP的提取率呈上升趨勢(shì)，且增加幅度較大。原因可能是升溫加快了分子運(yùn)動(dòng)，也更快的使細(xì)胞壁破裂，更好的使多酚物質(zhì)溶解出來(lái)。50℃以后，DFP的提取率明顯下降?？赡苁怯捎诟邷厥苟喾宇愇镔|(zhì)發(fā)生氧化或降解反應(yīng)[18]。當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，乙醇容易揮發(fā)，浸提溶劑減少，DFP得不到充分溶解，從而致使多酚得率下降。綜合酚類的穩(wěn)定性和乙醇的揮發(fā)性，以50℃的提取溫度作為最佳提取條件。

2.2.3 料液比對(duì)蒲公英花多酚提取率的影響

圖3 料液比對(duì)DFP提取率的影響Fig.3Theeffectofmaterial-to-liquidratioonextractionrateofDFP

由圖3可知，在料液比為1∶10到1∶25的范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，DFP的提取率也在增加。當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，達(dá)到最大提取率。然而當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，DFP的提取率略有下降，總體料液比對(duì)多酚提取的影響不大。綜合從降低能耗，節(jié)約材料方面考慮，料液比選用1∶25為最佳提取條件。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)蒲公英花多酚提取率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)DFP提取量的影響Fig.4The effect of extraction time on extraction rate of DFP

由圖4可知，前期隨著提取時(shí)間的增加，DFP提取率逐漸增加。但在40 min后，隨著時(shí)間的增加，多酚得率反而逐漸下降。這可能是開(kāi)始時(shí)DFP含量高，提取速率較大，隨著時(shí)間增加，而多酚提取率也就越高。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚長(zhǎng)時(shí)間在浸提液中受熱，不停的進(jìn)行降解、縮合、氧化等反應(yīng)，結(jié)構(gòu)被破壞，從而降低了DFP的提取率[18]。因此，提取時(shí)間40 min為最佳提取條件。

2.3 蒲公英花多酚提取的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2的結(jié)果分析可知，DFP提取率的影響因素主次順序?yàn)椋篊＞A＞B＞D，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間。由k值可以分析得知，DFP的最佳提取條件為A1B1C2D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，提取溫度為40℃，料液比為1∶15，提取時(shí)間為40 min。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2Orthogonal array design and results

2.4 DFP對(duì)DPPH自由基的清除作用

由實(shí)驗(yàn)可知，在相同濃度梯度下，DFP對(duì)DPPH自由基的最大清除率為68.43%，陽(yáng)性對(duì)照的TP對(duì)DPPH自由基的最大清除率為64.18%。由圖6可知，隨著樣液濃度增大，對(duì)DPPH自由基的清除能力也隨之增強(qiáng)。且DFP和TP對(duì)DPPH自由基的清除率都較高，濃度在0.15 mg·mL-1前，TP的清除效果優(yōu)于DFP；在0.15 mg·mL-1后，DFP的清除效率明顯開(kāi)始高于茶多酚的清除效率。因此在一定濃度范圍內(nèi)，相同濃度的DFP對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于TP。

2.5 DFP對(duì)羥基自由基的清除作用

由實(shí)驗(yàn)可知，在0.1～0.3 mg·mL-1的樣品濃度中，DFP對(duì)羥基自由基的最大清除率為89.30%；TP對(duì)羥基自由基的最大清除率為74.54%。

由圖6可知，隨著DFP濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除作用成線性增強(qiáng)。而DFP的清除率明顯大于茶多酚，在樣品濃度為0.3 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最大清除率。因此，在一定的濃度范圍內(nèi)，DFP對(duì)羥基自由基的清除能力優(yōu)于同濃度的TP。

圖5 DFP對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.5The scavenging ability of DFP against DPPH free radicals

圖6 DFP對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.6The scavenging ability of DFP against·OH

2.6 DFP對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

圖7 DFP對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.7The scavenging ability of DFP against superoxide radicals

超氧陰離子自由基的衍生物過(guò)氧化物和羥自由基具有細(xì)胞毒性，且超氧陰離子自由基本身也具有毒害作用[19]。鄰苯三酚在堿性條件下迅速自氧化，由于自氧化速率依賴的濃度，清除抑制自氧化反應(yīng)，由此來(lái)評(píng)價(jià)樣品清除的能力[20]。

由實(shí)驗(yàn)可知，在0.1 mg·mL-1到0.3 mg·mL-1的樣品濃度中，DFP對(duì)超氧陰離子自由基的最大清除率為76.55%；TP對(duì)超氧陰離子自由基的最大清除率為71.14%。

由圖7可知，隨著DFP濃度的增加，DFP和TP對(duì)超氧陰離子自由基的清除率增強(qiáng)。在樣品濃度0.2 mg·mL-1以下，清除率增大幅度較大，0.2 mg·mL-1以后，變化相對(duì)較小。因此，在一定的濃度范圍內(nèi)，DFP對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力較強(qiáng)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究了東北野生蒲公英花多酚提取的最佳條件。并在此基礎(chǔ)上對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。

眾多學(xué)者研究表明，蒲公英葉片及根多酚提取物具有一定的活性[10-12]。但是對(duì)于蒲公英花多酚的活性研究較少，尤其東北野生蒲公英花多酚對(duì)于DPPH清除能力的研究未見(jiàn)報(bào)道?？寡趸囼?yàn)表明，東北野生蒲公英花多酚對(duì)DPPH、羥基自由基、超氧陰離子自由基都具有一定的清除作用，且清除率與蒲公英花多酚濃度成量效關(guān)系。與茶多酚清除自由基能力比較，東北野生蒲公英花多酚對(duì)DPPH、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力都優(yōu)于茶多酚，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，作為天然食品添加劑具有良好的開(kāi)發(fā)前景。

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Extraction and Antioxidant Activity in vitro of Polyphenols from Northeast Wild Dandelion Flowers（Toraxacum mongolicum Hand.Mazz）

Zang Yanqing，He Fei，Li Zhikun，F(xiàn)eng Yanyu，Zhang Chao
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The optimization extraction of total polyphenols from northeast wild dandelion flowers was studied by single factor test and orthogonal test.Results showed that the optimal conditions were 40%ethanol solvent，extraction temperature 40℃，1∶15 ratio of material to ethanol，extraction time 40 min.Under the extraction conditions，the extraction rate of total polyphenols was 2.31%. Antioxidant activities in vitro of the dandelion flower polyphenols（DFP）were investigated in three different assays，including scavenging activities of hydroxyl free radicals（·OH），superoxide anion（O2-·）and 1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl（DPPH）free radicals.Results showed that the highest scavenging rates for the radicals were 89.35%，76.55%and 68.43%，respectively.As a conclusion，DFP had good eliminate ability of free radical，could be used as functional food material.

dandelion flowers；polyphenols；extraction；antioxidant activity

TS207.3

A

1002-2090（2017）04-0062-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.014

2016-12-12

2015年省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201510223022）。

臧延青（1974-），女，講師，日本巖手大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事功能性食品方面的研究工作。