劉仁，蔣雪園，吳丹丹，金成浩，申貴男

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

含羥基的2-取代萘醌類衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B的抑制作用

劉仁，蔣雪園，吳丹丹，金成浩，申貴男

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

萘醌類化合物普遍被報(bào)道具備較好的抗腫瘤能力。以1，5-二羥基萘為原料，經(jīng)五步反應(yīng)得到了4個(gè)末端含有羥基的萘醌類衍生物（6a-d）和1個(gè)未含羥基的萘醌類衍生物（6e），并通過(guò)質(zhì)譜和1H NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，采用MTT法評(píng)價(jià)了5種化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果顯示取代基末端含羥基的萘醌類衍生物的抗腫瘤活性與碳鏈長(zhǎng)度有密切關(guān)系。研究中的6 d對(duì)腫癌細(xì)胞Hep3B抑制活性最強(qiáng)，IC50為9.1 μmol·mL-1。

萘醌類衍生物；Hep3B；抗癌；抑制

紫草素（shikonin）是一種從傳統(tǒng)中藥材紫草的活性成分，屬于萘醌類化合物[1]，萘醌類衍生物因其抗癌[2]、抗真菌[3]、抗瘧疾[4]、退熱[5]以及延緩機(jī)體衰老[6]等多種生物活性受到國(guó)內(nèi)外藥物化學(xué)研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。但其水溶性差一直是阻礙其廣泛應(yīng)用的問(wèn)題之一。本研究為了解決其水溶性差的問(wèn)題，以1，5-二羥基萘為原料，通過(guò)1，5-位羥基的甲基化[7]、4和8位的溴化[8]、甲氧基化及1，4-位甲氧基的氧化獲得中間體化合物：5，8-位含有甲氧基的1，4-萘醌，并通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)合成了末端含有羥基的萘醌類衍生物。產(chǎn)物通過(guò)MTT法評(píng)價(jià)了其對(duì)Hep3B肝癌細(xì)胞的抑制作用，旨在篩選活性更好的萘醌類衍生物，為今后的萘醌類衍生物對(duì)抗腫瘤的研究提供合理的構(gòu)效關(guān)系方面的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1，5-二羥基萘（AR Sigma-Aldrich）；硫酸二甲酯（AR Sigma-Aldrich）；N-溴代丁二酰亞胺（AR Sigma-Aldrich）；甲醇鈉（AR阿拉?。?；碘化鉀（AR華藍(lán)試劑）；硝酸鈰銨（AR Sigma-Aldrich）；3-巰基丙醇（AR阿拉?。?；4-巰基丁醇（AR Sigma-Aldrich）；5-巰基戊醇（AR阿拉?。?；6-巰基己醇（AR Sigma-Aldrich）；己硫醇（AR阿拉丁）。

1.2 儀器

Infinite M200pro酶標(biāo)儀，Bruker-Esquire3000離子阱液相色譜質(zhì)譜儀，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Bruker JNM-AL400核磁共振波譜儀。

1.3 方法

1.3.1 萘醌類衍生物的化學(xué)合成和修飾

將1，5-二羥基萘（1）于25℃弱堿性溶液中用硫酸二甲酯進(jìn)行羥基的甲基化得到1，5-二甲氧基萘（2）。經(jīng)溴化反應(yīng)使用N-溴代丁二酰亞胺（NBS）的自由基反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行溴化反應(yīng)，降低了傳統(tǒng)溴化反應(yīng)試劑毒性大的缺點(diǎn)，順利得到4，8-二溴-1，5-二甲氧基萘（3）。利用甲醇鈉在碘化鉀的催化下，甲醇和二甲基甲酰胺混合物為溶劑加熱回流約30 h，乙酸乙酯重結(jié)晶得1，4，5，8-四甲氧基萘（4），應(yīng)用硝酸鈰銨在乙腈和氯仿混合溶劑中氧化得到關(guān)鍵中間體5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（DMNQ）（5）。最后利用邁克爾加成反應(yīng)將末端含有羥基的化合物6a-d以及不含羥基的化合物6e順利加成于2-位（見(jiàn)圖1）。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通過(guò)核磁、質(zhì)譜等波譜學(xué)方法鑒定。

圖1 萘醌類衍生物的合成Fig.1The synthesis of naphthoquinone derivatives

1.3.2 細(xì)胞抑制活性檢測(cè)

將培養(yǎng)到2p的細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞5 min致細(xì)胞完全懸浮，加入完全培養(yǎng)基阻斷胰酶活性，1 000 rpm離心3 min后，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成1×105·mL-1，種入96微孔板，每孔加入100 μL Hep3B細(xì)胞懸液后，放入5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)22 h后，取出96孔板。吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含有1%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，饑餓處理2 h后，實(shí)驗(yàn)組加入1 μL化合物溶液（化合物的終末濃度分別為0.1，1，10，100 μmol·mL-1）對(duì)照組加入1 μL溶劑對(duì)照液?；衔锾幚聿捎?個(gè)濃度梯度，8個(gè)復(fù)孔，各溶劑對(duì)照也為8個(gè)復(fù)孔。

處理化合物后培養(yǎng)24 h，用平衡磷酸鹽緩沖液沖洗3次，去除死亡的細(xì)胞。每孔加入濃度為5 mg·mL-1的MTT染液10 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)4 h。

吸凈上清液，各孔加入100 μL DMSO，置于培養(yǎng)箱10～15 min，使甲瓚溶解。用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定（測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm）各濃度條件下的OD值，計(jì)算細(xì)胞的存活率計(jì)算公式：細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=100%－細(xì)胞存活率。運(yùn)用GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到50%時(shí)的化合物濃度，即IC50值，比較5種化合物物對(duì)Hep3B細(xì)胞抑制作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 5種萘醌類衍生物的結(jié)構(gòu)鑒定

為了驗(yàn)證獲得的6種萘醌類衍生物的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了1H-NMR（TMS為內(nèi)標(biāo)）和Mass鑒定，數(shù)據(jù)如下：

1H-NMR及質(zhì)譜的數(shù)據(jù)顯示，通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)獲得的5種化合物均屬于萘醌類衍生物，并且其化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量符合預(yù)先的合成設(shè)計(jì)，保證了化合物的準(zhǔn)確性。

2.2 MTT法檢測(cè)萘醌類衍生物對(duì)Hep3B的細(xì)胞毒性

稱取并溶解合成的5種萘醌類衍生物6a、6b、6c、6d、6e分別以0.1、1、10、100 μmol·mL-1處理Hep3B細(xì)胞24 h，通過(guò)MTT法檢測(cè)5種化合物的細(xì)胞毒性，其結(jié)果如表1。

表15 種萘醌類衍生物對(duì)Hep3B細(xì)胞的抑制活性Table 1The inhibitory effect of compounds 6a-6e on Hep3B

受試的5種萘醌類衍生物具有同樣的DMNQ母核，不同之處在于它們的2-位巰基取代基的碳鏈長(zhǎng)度，而化合物6e的2-位取代基末端未含有羥基。結(jié)果表明6e相對(duì)于其他化合物顯示較差的抗癌活性，說(shuō)明親水性基團(tuán)羥基對(duì)與抗癌活性就有明顯的影響?？赡苁怯H水性基團(tuán)更易與細(xì)胞的活性部位發(fā)生分子間的氫鍵，從而對(duì)Hep3B細(xì)胞有較好的增殖抑制作用。末端含有羥基的4個(gè)化合物相比，6a的活性相對(duì)較差一些，說(shuō)明碳鏈長(zhǎng)度對(duì)抗癌抑制作用有一定的影響。而碳鏈長(zhǎng)度在4～5時(shí)沒(méi)有顯著的差異。說(shuō)明2-位短鏈取代時(shí)效果較差，中等長(zhǎng)度時(shí)顯示了較好的抗癌抑制活性。至于長(zhǎng)鏈或超長(zhǎng)鏈的末端含有羥基的2-位取代化合物的抗癌活性正在研究中。

3 結(jié)論

化學(xué)合成方法以1，5-二羥基萘為原料經(jīng)五步合成了5種2-位取代的萘醌類衍生物，包括不同長(zhǎng)度的末端含有羥基（6a、6b、6c和6d）和不含羥基的化合物（6e）。并采用MTT法評(píng)價(jià)了這類化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞系Hep3B的抑制作用。2-（4-羥基正丁巰基）-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（6d）的對(duì)腫瘤細(xì)胞Hep3B抑制活性最強(qiáng)。結(jié)果表明萘醌類化合物的抗癌活性與其結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系。萘醌類取代基的親水基團(tuán)及碳鏈長(zhǎng)度是決定5，8-二甲氧基-1，4-萘醌為母核的萘醌類化合物對(duì)Hep3B生長(zhǎng)抑制的主要因素，碳鏈越長(zhǎng)顯示更強(qiáng)的抑制作用。應(yīng)用的萘醌類衍生物結(jié)構(gòu)的修飾方案，可以提高其對(duì)Hep3B的抑制作用，闡明了碳鏈長(zhǎng)度及親水基團(tuán)對(duì)抗癌抑制作用的構(gòu)效關(guān)系，但具體的化合物與Hep3B細(xì)胞作用機(jī)理有待于后續(xù)研究。

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Inhibition Effects of Hydroxy 2-substitutited Naphthoquinone Derivatives on Hep3B

Liu Ren，Jiang Xueyuan，Wu Dandan，Jin Chenghao，Shen Guinan
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Life Science and Technology College，Daqing 163319）

Naphthoquinones had been widely reported the antitumor effects.5 alkylated naphthoquinone derivatives were synthesized starting from 1，5-dihydroxynaphthalene through a five-step sequence.Four of the derivatives（6a，6b，6c and 6d）contained hydroxyl group at the alkyl terminal and one derivative（6e）had no hydroxyl group.These compounds’structures were determined by1H NMR and Mass spectrometry and were evaluated the inhibition activity on human hepatocarcinoma Hep3B cell line by MTT assay.Results suggested that such 5 compounds had definite anti-tumor ability on Hep3B human hepatomcarcinoma.The length of hydroxyl alkyl affected the inhibitory activity.Compound 6 d showed the strongest inhibition effect with IC509.1 μmol·mL-1.

naphthoquinone derivative；Hep3B；anti cancer；inhibition

TS264.2

A

1002-2090（2017）04-0087-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.019

2016-06-30

2012年黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目資助。

劉仁（1990-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2014級(jí)碩士研究生。

申貴男，男，講師，博士后，E-mail：gns1980@163.com。