王 婧，張 淼，賀海燕，楊佳麗,2，石 娟,2,樸文花,3

·論 著·

轉(zhuǎn)錄因子SOX2抑制肺癌細胞系順鉑藥物敏感性的作用研究

王 婧1，張 淼1，賀海燕1，楊佳麗1,2，石 娟1,2,樸文花1,3

目的研究Wnt/β-catenin信號與SOX2相互作用對肺癌細胞系順鉑藥物敏感性的影響。方法分別以順鉑藥物敏感和耐藥的細胞系A(chǔ)549和A549/DDP為模型，轉(zhuǎn)染SOX2過表達或shSOX2質(zhì)粒，采用免疫印跡法對Wnt/β-catenin信號中相關(guān)蛋白表達情況進行檢測分析，運用流式細胞儀對SOX2抑制順鉑誘導(dǎo)的肺癌細胞凋亡進行觀察。結(jié)果SOX2過表達組中，Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白active-β-catenin、靶基因Cyclin D1的表達均下降，但GSK-3的表達量明顯增高，而shSOX2處理組中，ABC、Cyclin D1的表達均升高；過表達SOX2可以極顯著性地抑制順鉑誘導(dǎo)的凋亡，反之，shSOX2瞬時表達極顯著地增加順鉑誘導(dǎo)的凋亡。結(jié)論SOX2可抑制肺癌細胞中Wnt/β-catenin信號的活性，在肺癌順鉑藥物耐藥性中發(fā)揮重要的作用，可能作為肺癌耐藥性治療的一個新靶標。

肺癌；SOX2；Wnt/β-catenin；耐藥；順鉑；凋亡

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在近幾年仍不斷攀升[1]。在過去10年間，盡管肺癌的治療從手術(shù)切除到放化療及靶向治療都有很大提高，但肺癌患者5年存活率僅為17%[2]，其中腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性是降低存活率的主要原因，約90%的患者會發(fā)展為肺癌一線化療藥物順鉑的耐藥[3]。因此，進一步了解導(dǎo)致肺癌復(fù)發(fā)和耐藥的分子機制對提高患者的生存率有重要意義。本研究針對Wnt/β-catenin信號和SOX2、shSOX2相互作用對肺癌細胞系順鉑敏感性作用機制進行分析，旨在揭示其在肺癌細胞中對順鉑耐藥的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系和抗體:人肺腺癌A549細胞系(Cat，CCL-185)購自ATCC細胞庫，人肺腺癌順鉑藥物耐藥A549/DDP細胞系購自中科院北京細胞庫，所用抗體見表1。

表1 實驗中所用抗體信息情況

1.2 藥物與試劑:順鉑藥物(Cayman chemical company)；1640培養(yǎng)基(Gibico)；胎牛血清(BI公司)；所用全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(全式金生物公司)；凋亡檢測試劑盒(BD公司)；Lipofectamine LTX(Invitrogen公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1.1 SOX2質(zhì)粒構(gòu)建:為了產(chǎn)生能夠在哺乳動物細胞中過表達性別決定區(qū)Y-box基因2(SOX2)的質(zhì)粒，將人SOX2 cDNA(NM_003106)克隆到CMV啟動子(Invitrogen，USA)下游的pcDNA3.1骨架質(zhì)粒中，稱為pCDNA-SOX2。

1.3.1.2 shSOX2質(zhì)粒構(gòu)建:shSOX2即為抑制SOX2表達的質(zhì)粒構(gòu)建，通過使有義寡核苷酸5'-CCGGCGCTCATGAAGAAGGATAACTCGAG TTATCCTTCTTCATGAGCG TTTTTG-3'和反義寡核苷酸5'AATTCAAAAACGCTCATGAAGAAGGATAACTCGA

GTTATCCTTCTTCATGAGCG-3'退火而產(chǎn)生小發(fā)夾RNA(shRNA)，將得到的雙鏈shRNA克隆到GV248載體(GenePharma，上海)中。

1.3.2 A549、A549/DDP細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和順鉑刺激:將A549和A549/DDP細胞系培養(yǎng)在加有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、95%濕度及5%的二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待A549和A549/DDP細胞系長到70%～80%時，利用Lipofectamine LTX將SOX2或shSOX2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A549和A549/DDP細胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，加入濃度為5M順鉑藥物刺激24 h后，收集細胞，用于后續(xù)流式細胞檢測和Western-blot分析。

1.3.3 流式細胞檢測:按照凋亡檢測試劑說明書要求將各處理組細胞用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2遍，再用1×Binding Buffer緩沖液制成1×106/mL的細胞懸液，各處理組取出100 μl細胞懸液體，進行Annexin V和碘化丙啶(PI)染色，室溫(20～25 ℃)避光處放置15 min，使用流式細胞儀(BD FACSCalibur Ⅱ)上機檢測，用Cell Quest software軟件進行分析。

1.3.4 蛋白免疫印跡實驗:將提取的細胞總蛋白、胞漿蛋白及細胞核蛋白在測定總蛋白濃度后，調(diào)整蛋白濃度，使每孔上樣量為50 g，然后進行10%SDS PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，以5%脫脂奶粉室溫封閉1h；加入合適稀釋后特異一抗，4 ℃過夜孵育，次日平衡到室溫后PBST漂洗3次×10 min后，加辣根過氧化物酶(POD)標記的相應(yīng)二抗，室溫孵育1.5～2 h；漂洗后用ECL底物顯色，X線片曝光顯影，測定目的蛋白條帶灰度值。實驗組與對照組灰度值相比，得到相對表達量，以此來分析目的蛋白的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 SOX2抑制肺癌細胞中的Wnt/β-catenin信號活性:以順鉑藥物敏感和耐藥的細胞系A(chǔ)549和A549/DDP為模型，轉(zhuǎn)染SOX2過表達或shSOX2質(zhì)粒，采用免疫印跡方法對Wnt/β-catenin信號中關(guān)鍵蛋白表達的情況進行檢測分析。結(jié)果表明，與對照組相比，SOX2過表達組中，Wnt/-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白Active-β-catenin(ABC)、靶基因Cyclin D1的表達均下降，但GSK3的表達量明顯增高。反之，shSOX2處理組中，ABC、Cyclin D1的表達均升高，結(jié)果表明SOX2可能抑制肺癌細胞中Wnt/-catenin信號的活性，見表2。

表2 SOX2抑制A549和A549/DDP細胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白的結(jié)果

注:A組為全蛋白，B組為核蛋白。

2.2 SOX2減少順鉑藥物誘導(dǎo)的肺癌細胞凋亡:為了探討SOX2對順鉑介導(dǎo)的肺癌細胞凋亡的影響，運用流式細胞儀檢測結(jié)果表明，在A549和A549/DDP細胞系中，過表達SOX2可以極顯著性地抑制順鉑誘導(dǎo)的凋亡，反之，shSOX2瞬時表達極顯著地增加順鉑誘導(dǎo)的凋亡；A549細胞處理組中，Control(4.52±0.78)%，SOX2(16.70±2.54)%，shSOX2(25.82±4.07)%；A549/DDP細胞處理組中，Control(3.62±3.41)%，SOX2(2.44±1.94)%，shSOX2(7.46±3.82)%，但是凋亡細胞的總數(shù)較小。結(jié)果顯示，SOX2可能是用于順鉑耐藥型肺癌細胞化療的一個靶標。

通過免疫印跡法對SOX2抑制順鉑藥物誘導(dǎo)的肺癌細胞凋亡信號通路的關(guān)鍵蛋白進行驗證，結(jié)果顯示，在A549肺癌細胞系中，無順鉑藥物的存在時，過表達SOX2可以增加凋亡前提蛋白Caspase3的表達，抑制AIF的表達。在順鉑藥物耐藥的細胞系A(chǔ)549/DDP中，過表達SOX2可以降低Caspase3的表達；反之，在A549細胞系中，當順鉑藥物存在時，過表達SOX2或者shSOX2干擾會降低Caspase3的表達而增加AIF的表達。但是在A549/DDP中，過表達SOX2可以顯著增加Caspase3的表達而降低AIF的表達。

3 討論

化療是目前公認的治療肺癌的方法之一，其中順鉑藥物是臨床用于晚期肺癌治療的一線藥物[4]，然而化療藥物耐藥性的發(fā)展是最終導(dǎo)致肺癌化療失敗的主要原因。因此，通過對肺癌耐藥機制的深入研究，為癌癥耐藥治療發(fā)現(xiàn)新的靶標成為可能。

Wnt/β-catenin信號已被確認在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用，其在50%肺癌切除樣品中被檢測出異常的高表達，與肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。大量研究表明，Wnt/β-catenin信號在癌癥干細胞(CSC)命運決定中也起著關(guān)鍵的角色，且腫瘤干細胞對化療或靶向治療藥物具有抵抗作用[6]。Wnt信號通路在細胞增殖、遷移、器官形成及組織穩(wěn)態(tài)等過程中發(fā)揮著重要的作用[7]。最近越來越多的證據(jù)表明，SOX2和Wnt信號傳導(dǎo)途徑之間相互關(guān)聯(lián)[8]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A549細胞和A549/DDP細胞中SOX2通過調(diào)節(jié)GSK3的表達抑制Wnt/β-catenin信號通路。同時有研究發(fā)現(xiàn)，SOX2可協(xié)同β-catenin作用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)CCND1(細胞周期蛋白D1)基因的表達，并通過促進乳腺癌細胞在G1/S期的轉(zhuǎn)變促進細胞增殖和腫瘤發(fā)生[9]。這些研究和本結(jié)果一致，意味著SOX2調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路活性的雙重功能與細胞的種類相關(guān)。

SOX家族成員在肺臟發(fā)育以及肺腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。由于SOX2在胚胎發(fā)育以及包括肺癌在內(nèi)的許多癌癥的發(fā)生中起著關(guān)鍵性的作用，因此SOX2是目前研究最廣泛的一個基因[10]。SOX2參與許多癌癥發(fā)生的過程，例如細胞增殖，通過與其他致癌、發(fā)育途徑相互作用規(guī)避細胞凋亡和轉(zhuǎn)移[11]。此外，越來越多的證據(jù)表明，SOX2的基因在常規(guī)肺癌化療治療中具有重要影響[12]，且其在肺癌的發(fā)病和耐藥機理中MAP4K4、EGFR、Src/Akt和BMP4信號通路密切關(guān)聯(lián)。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制SOX2的表達可能提高A549/DDP細胞對順鉑的敏感性。有相關(guān)研究與本實驗結(jié)果一致，表明SOX2可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號途徑在乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌和骨肉瘤癌變中發(fā)揮重要作用。同樣值得注意的是，SOX2的敲除可誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡[13]，例如，shRNA介導(dǎo)SOX2在EGFR突變的肺癌HCC827細胞表現(xiàn)出降低細胞增殖，并對埃洛替尼的敏感性增加。因此，SOX2的基因在肺癌靶向治療中具有一定的意義。

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TranscriptionfactorSOX2inhibitthesensitivityofcisplatininthelungcancercellline

WANGJing1,ZHANGMiao1,HEHaiyan1,YANGJiali1,2,SHIJuan1,2,PIAOWenhua1,3

1.DepartmentofClinicalPathology,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002,China；2.GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China；3.TheFirstAffiliatedHospitalofNorthwestUniversityforNationalities,Yinchuan750002,China

Correspondingauthor:PIAOWenhua,Email:wenhuapiao@163.com

ObjectiveTo explore the interaction of Wnt/-catenin signal pathway and the transcription factor SOX2 to the sensitive of cisplatin in the lung cancer cells.MethodsA549 cells ware used as cisplatin sensitive model and A549/DDP cells as cisplatin resistant model.Over-expression SOX2 and shSOX2 plasmid were transfected respectively.The key proteins of Wnt/β-catenin signaling pathway were measured by western-blot; the apoptosis rate of lung cancer cell induced by cisplatin was detected by the flow cytometry.ResultsCompare to the control group,the expression rates of active-β-catenin and the target gene Cyclin D1 were decreased in the SOX2 group; while,the expression of ABC and Cyclin D1 were increased in the shSOX2 group.Compare to control group,over-expression of SOX2 group significantly suppressed the apoptosis induced by cisplatin,instantaneously,shSOX2 significantly increased the apoptosis induced by cisplatin.ConclusionThis results suggest that SOX2 may inhibit the activity of Wnt/β-catenin signal in the lung cancer cells.SOX2 may be an important regulator in development of chemoresistance,which may imply that SOX2 may be a novel therapeutic target for treatment chemoresistant lung cancer.

Lungcancer;SOX2;Wnt-β-catenin;Chemoresistance;Cisplatin;Apoptosis

寧夏自然科學基金項目(NZ14166)

1.寧夏人民醫(yī)院臨床醫(yī)學檢驗診斷中心，寧夏 銀川 750002 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，寧夏 銀川 750004 3.西北民族大學第一臨床學院，寧夏 銀川 750002

王婧(1986-)，女，碩士學位，主管技師，從事分子生物學研究方向。

樸文花，Email:wenhuapiao@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170814.1453.006.html

10.13621/j.1001-5949.2017.08.0676

R735

A

2017-02-03 [責任編輯]李 潔