羅 祁，李 霞*

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院血液凈化中心，湖南 長沙 410000）

高通量與低通量血液透析對血清β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白產(chǎn)物和蛋白質(zhì)羰基的影響

羅 祁，李 霞*

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院血液凈化中心，湖南 長沙 410000）

目的 探討高通量血液透析對慢性血液透析患者中血清β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白產(chǎn)物及蛋白質(zhì)羰基的影響。方法 從我院招募的慢性低通量血液透析患者20例。研究初期，所有患者改用高通量血液透析8周（A期），隨后低通量血液透析2周作為洗出期；然后，患者再次進(jìn)行8周的低通量血液透析期（B期）。在A期（高通量前期和高通量后期）和B期（低通量前期和低通量后期）開始和結(jié)束時(shí)采集透析前血清樣品。使用ELISA檢測血清β-2微球蛋白，分光光度法測定晚期氧化蛋白產(chǎn)物和蛋白質(zhì)羰基。結(jié)果 高通量血液透析后血清β-2微球蛋白和晚期氧化蛋白產(chǎn)物水平顯著低于高通量血液透析前（分別為p=0.031和0.036），但蛋白質(zhì)羰基未觀察到顯著變化（p=0.8）。低通量血液透析后期血清β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白產(chǎn)物和蛋白質(zhì)羰基都顯著高于低通量血液透析前水平（分別為p=0.0002、0.019和0.0002）。低通量血液透析后期血清β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白產(chǎn)物顯著高于高通量血液透析后期（分別為p＜0.0001和p=0.0005），但蛋白質(zhì)羰基無顯著差異（p=0.112）。高通量血液透析后期蛋白質(zhì)羰基與晚期氧化蛋白產(chǎn)物（p=0.013）和B2MG（p=0.01）呈正相關(guān)。高通量血液透析后期蛋白質(zhì)羰基與β-2微球蛋白呈正相關(guān)（p=0.036）。結(jié)論 高通量血液透析能降低血清β-2微球蛋白和蛋白質(zhì)羰基含量，而晚期氧化蛋白產(chǎn)物則不受影響。另一方面，低通量血液透析可能導(dǎo)致三種標(biāo)記物水平的增加。因此高通量血液透析相對于低通量血液透析能更好地去除尿毒癥毒素。

高通量；低通量；血液透析；β-2微球蛋白；蛋白質(zhì)羰基；晚期氧化蛋白產(chǎn)物

尿毒癥的主要臨床特征是體內(nèi)毒素不能排出，體內(nèi)毒素不能排出不僅對各種代謝過程均有不利影響，而且和尿毒癥發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)。根據(jù)毒素分子大小和疏水性可將其分為：（a）水溶性小分子（分子量＜500 Da），如尿素。可通過任何透析方式清除。（b）中等量分子（分子量＞500 Da）。（c）結(jié)合蛋白質(zhì)的疏水性溶質(zhì)，如酚類化合物[1]。

中等量分子包括β-2微球蛋白（beta-2 microglobulin，B2MG）、晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGE）、晚期氧化蛋白產(chǎn)物（advanced oxidation protein products，AOPP）和其他肽類。使用大孔膜高通量血液透析清除這些大分子相對于使用小孔膜的低通量血液透析更有效[2]。

B2MG形成人類白細(xì)胞抗原I類分子的β鏈，存在于大多數(shù)真核細(xì)胞表面和體液，主要由腎臟排泄，腎臟外清除可忽略不計(jì)。B2MG分子量為11.8 kDa，已被廣泛應(yīng)用于評估中等量分子的透析清除效率[3]。血清B2MG水平長期升高與慢性血液透析患者透析相關(guān)淀粉樣變發(fā)展相關(guān)。

透析期間，與透析器膜血液接觸會(huì)激活單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，從而導(dǎo)致大量反應(yīng)性氧物質(zhì)產(chǎn)生，其所誘發(fā)的氧化應(yīng)激促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣化發(fā)展，同時(shí)也增加了慢性血液透析患者心血管疾病發(fā)生率[4]。

晚期氧化蛋白產(chǎn)物（Advanced oxidation protein products，AOPP）是氧化應(yīng)激期間氯化氧化劑與血漿蛋白反應(yīng)產(chǎn)生的尿毒癥毒素[5]。酪氨酸等氧化氨基酸殘基導(dǎo)致二氮芥形成、蛋白質(zhì)交聯(lián)、片段化以及酶或其他功能喪失。晚期氧化蛋白產(chǎn)物根據(jù)其交聯(lián)配體不同具有不同的分子量。除了作為氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，AOPP還具有促進(jìn)前炎癥反應(yīng)的作用。

碳水化合物和脂質(zhì)的氧化可產(chǎn)生反應(yīng)性羰基（reactive carbonyl groups，RCO）?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）和RCO與蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致血漿和組織中羰基化功能障礙蛋白質(zhì)形成。蛋白質(zhì)羰基（PCO）含量是氧化應(yīng)激依賴性細(xì)胞損傷的良好標(biāo)志物。已有報(bào)道稱尿毒癥患者血漿蛋白羰基化物水平普遍上升[6]。此外，蛋白質(zhì)碳水化合物是晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGE）前體，作為中等量分子毒素在腎功能衰竭進(jìn)展中起到了重要作用。

由于中等分子量尿毒癥毒素在其分子量和蛋白質(zhì)結(jié)合方面的異質(zhì)性可能影響其血液透析清除率，因此本實(shí)驗(yàn)旨在研究慢性血液透析患者高通量與低通量血液透析對血漿尿毒癥毒素β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白產(chǎn)物以及氧化應(yīng)激標(biāo)志物蛋白羰基的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從我院招募患有晚期末期疾?。╡nd stage renal disease，ESRD）的慢性正常血液透析的患者20例，其中，男16例，女4例，所有患者臨床狀況穩(wěn)定。以20名健康年齡匹配受試者作為對照組，吸煙者和接受抗腫瘤或抗氧化治療的受試者被排除在研究之外。所有研究參與者均已簽署知情同意，該研究由南華大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究開始前，所有患者均接受8周的低通量血液透析。研究開始時(shí)，所有患者改用高通量血液透析8周（A期），隨后低通量血液透析2周（W期）作為洗出期排除遺留效應(yīng)；然后，患者再次進(jìn)行8周低通量血液透析期（B期）以維持治療。在A期（高通量前期和高通量后期）和B期（低通量前期和低通量后期）開始和結(jié)束時(shí)采集透析前血清樣品。使用ELISA檢測B2MG，分光光度法測定AOPP和PCO。膜類型不同可能對血液透析患者氧化狀態(tài)產(chǎn)生不同影響，高通量和低通量膜都由相同的料（合成聚酰胺共混膜：分別為聚合物170H和聚合物17L，Gambro Co，USA）制成。

所有患者使用碳酸氫鹽透析液每周透析3次，透析液流速為500 mL/min，每個(gè)療程持續(xù)4～6 h不等，血流速度范圍為250～400 mL/min，平均值為（323±42.2）mL/min。調(diào)整血液透析期間持續(xù)時(shí)間和血液流速以達(dá)到＞65%尿素清除率（URR）。所有患者達(dá)到目標(biāo)血紅蛋白水平（11～12 g/dL）后使用維持劑量的人重組紅細(xì)胞生成素。研究期間患者未接受輸血治療。

高通量A期（前高通量透析期）第一次透析之前采集血樣，在此期（后高通量透析期）結(jié)束時(shí)采集另一個(gè)透析前樣品。B期（前低通量透析期）開始時(shí)取第三次透析前樣品，在此期（后低通量透析期）結(jié)束時(shí)取第四次透析前樣品。

所有患者進(jìn)行全面病史采集和臨床檢查。此外，還進(jìn)行了4周全血象檢查。調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素劑量以將血紅蛋白水平維持在11～12 g/dL。每月檢測一次透析前和透析后血清尿素水平以計(jì)算尿素還原比：URR =（尿素透析前-尿素透析后）/尿素透析前-100。

對每個(gè)患者采集的四個(gè)靜脈血樣本中進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)室檢查，所有對照組受試者接受同樣的檢查。

1.3 β-2微球蛋白測定

使用市售試劑盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）測定β-2微球蛋白。

1.4 晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）測定

使用分光光度法測定AOPP。96孔微量滴定板中，使用20 μL乙酸酸化200 μL血清（使用磷酸鹽緩沖鹽水以1：5的比例稀釋）。立即在340 nm處以含有200 μLPBS、10 μL1.16 mol/L碘化鉀和20 μL乙酸為空白對照讀取反應(yīng)混合物的吸光度。使用由氯胺-T標(biāo)準(zhǔn)溶液（Sigma-Aldrich，USA）構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定AOPP含量。AOPP濃度以1 mol/L氯胺-T當(dāng)量表示。

1.5 蛋白羰基檢測

使用OxiSelect蛋白質(zhì)羰基分光光度測定試劑盒通過分光光度法測量蛋白質(zhì)羰基。該測試以蛋白質(zhì)羰基與2，4-二硝基苯肼（DNPH）的衍生化為基礎(chǔ)。在375 nm通過分光光度法檢測產(chǎn)生的蛋白質(zhì)-水性區(qū)的量。以nmol/mg蛋白質(zhì)表示羰基水平。

在貝克曼化學(xué)自動(dòng)分析儀上測定血清蛋白，并使用蒸餾水調(diào)節(jié)為1 mg/mL。將1 mL DNPH加入到250 μL稀釋的血清中。孵育后，使用1.25 mL三氯乙酸20%沉淀蛋白質(zhì)。用1 mL乙醇/乙酸乙酯（1:1v/v）洗滌蛋白質(zhì)沉淀以除去游離DNPH，并將其溶于250 μL1M NaOH中。讀取370 nm吸光度，使用摩爾吸光系數(shù)DNPH（22·103 mol-1 cm-1）計(jì)算羰基含量。由于洗滌時(shí)可能損失一些蛋白質(zhì)，通過Lowry測量最終溶解沉淀中蛋白質(zhì)含量20。以蛋白質(zhì)含量為標(biāo)準(zhǔn)化的羰基含量，并以nmol/mg蛋白質(zhì)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。使用Mann Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行患者和對照組之間的比較。使用Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)分析患者組中研究參數(shù)的變化。使用斯皮爾曼相關(guān)性檢驗(yàn)來研究變量之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 受試者一般資料

20例慢性血液透析患者的臨床數(shù)據(jù)如表1所示。高血壓是慢性腎臟疾病最常見的原因（30%），而有15%患者病因尚不明確。3例患者（15%）心臟肥大，2例患者（10%）糖尿病性視網(wǎng)膜病變。表2給出了血液透析患者與對照組的基礎(chǔ)生化數(shù)據(jù)。血液透析患者血清B2MG、AOPP和PCO水平明顯高于對照組（P＜0.0001）。見表1、表2。

表1 慢性透析患者臨床參數(shù)

表2 慢性透析患者和健康受試者基線臨床參數(shù)和尿毒癥毒素比較

2.2 高通量和低通量患者對慢性透析患者B2MG、PCO及AOPP的影響

與前高通量期相比，高通量透析期末期（后高通量期）血清B2MG和PCO水平顯著降低（分別為P=0.031和P=0.036）。另一方面，此期未觀察到AOPP水平顯著變化（P=0.8），見表3。此期內(nèi)B2MG、AOPP和蛋白質(zhì)羰基的平均百分比變化（±s，SEM）為（-7.97±6.84）%、（1.82±3.63）%和（-7.69±5.04）%，見圖1。

高通量期（A期）和低通量期（B期）初期研究參數(shù)水平相當(dāng)，表明洗出期清除徹底（B2MG：P=0.313、AOPP：P=0.472、蛋白質(zhì)羰基：P=0.66）。

8周低通量血液透析（后低通量期）結(jié)束時(shí)與此期初期（前低通量期）相比，B2MG、AOPP和蛋白質(zhì)碳水化合物水平顯著增高（P=0.0002、0.019和0.0002），見表3。B期B2MG、AOPP和PCO的平均百分比變化（±s，SEM）分別為：（30.31±6.43）%、（9.13±3.27）%和（31.03±5.05）%，見圖1。

圖1 高通量和低通量透析后患者B2MG、PCO及AOPP變化情況

后低通量透析期B2MG和蛋白質(zhì)羰基化物的水平顯著高于后高通量透析期（分別為P＜0.0001和P=0.0005）。另一方面，AOPP水平無顯著差異（P=0.112）。高通量（P=0.41）或低通量（P=0.57）血液透析后血清尿素水平未觀察到顯著變化。

前高通量透析后，蛋白質(zhì)羰基和AOPP在基線處正相關(guān)（r=0.569，P=0.013）。蛋白質(zhì)羰基也與B2MG正相關(guān)（r=0.591，P=0.01）。A期末，后高通量透析時(shí)蛋白質(zhì)羰基與B2MG正相關(guān)（r=0.421，P=0.036）。

3 討 論

高血壓和心血管疾病等慢性血液透析相關(guān)疾病的發(fā)生，被認(rèn)為與低通量血透使用的小孔膜難以去除中分子尿毒癥毒素并導(dǎo)致其在人體內(nèi)蓄積有因果關(guān)系。最新臨床研究表明，可通過使用大孔徑高通量血液透析膜、增加透析頻率或延長透析時(shí)間來增強(qiáng)對這類化合物的清除，從而能提高終末期腎病患者的生存率和生活質(zhì)量[7]。

表3 高通量和低通量透析對慢性透析患者B2MG、PCO及AOPP含量的影響

本研究探討了高通量與低通量血液透析對中等量分子的代表：血清β-2微球蛋白和晚期氧化蛋白產(chǎn)物水平的影響,同時(shí)還研究了氧化應(yīng)激標(biāo)志物蛋白質(zhì)羰基的水平。結(jié)果表明，研究開始時(shí)慢性血液透析患者透析前血清B2MG水平基線值相對于對照組顯著增高，這與以往研究結(jié)果一致[8]。Okuno等研究表明血清β-2微球蛋白水平是血液透析患者死亡率的重要的獨(dú)立預(yù)測因子，提示降低這些患者血清β-2微球蛋白的重要臨床意義[9]。

本研究中，使用高通量膜血液透析8周后測得的血清B2MG水平顯著降低，而使用低通量透析其水平則顯著升高。同樣，另有研究表明，高通量透析透析前B2MG水平顯著低于低通量透析。

B2MG循環(huán)中的腎外清除率幾乎可以忽略不計(jì)，因此通常將其當(dāng)作“中等量分子”范圍內(nèi)尿毒癥毒素的標(biāo)記，特別是用于評估透析效率。然而，β-2微球蛋白水平不僅與透析清除率相關(guān)，同時(shí)也與標(biāo)志著尿毒癥中毒水平的炎癥因素有著密切聯(lián)系。此外，其他幾個(gè)中等量分子與蛋白質(zhì)相關(guān)，因此它們的動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)和區(qū)間的輸與β-2微球蛋白也不盡相同[10]。因此，對于單獨(dú)的B2MG分子是否足以評價(jià)血液透析患者中等量分子毒素清除率的充分性仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。除了B2MG之外，其他中等量分子物質(zhì)也許同樣能在此方面發(fā)揮作用。

在研究組血液透析患者AOPP水平比對照組更高。已有報(bào)道稱尿毒癥患者，特別是血透患者AOPP水平將有顯著升高[11]。本研究采取8周高通量血液透析治療的患者血清AOPP水平?jīng)]有發(fā)生改變。Bordoni等研究發(fā)現(xiàn)高通量血液透析患者的血漿羰基殘基而非AOPP水平的顯著降低[12]。他們還注意到：在低通量治療的患者中兩種標(biāo)志物水平均無下降。高通量血液透析對AOPP水平缺乏影響，這可能與白蛋白及更高分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生損害導(dǎo)致AOPP分子量較大有關(guān)。

對于尿毒癥患者，尤其是維持性血液透析的患者，其蛋白質(zhì)可能發(fā)生包括羰基化在內(nèi)的多種修飾。這導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能缺陷、晚期糖基化終末產(chǎn)物形成和細(xì)胞功能障礙[13]。本研究中，慢性血液透析患者PCO含量顯著高于對照組。對于血液透析患者而言，尿毒癥并不是導(dǎo)致羰基應(yīng)激的唯一因素，血液透析治療也可能對羰基平衡產(chǎn)生影響。血液透析期間，血液與透析膜接觸后發(fā)生生化反應(yīng)性和抗氧化物質(zhì)的損失，可增加氧化應(yīng)激而促進(jìn)羰基形成。另一方面，血液透析可通過去除低分子量反應(yīng)性羰基化合物來控制羰基過量。因此，蛋白質(zhì)羰基水平是產(chǎn)生和清除平衡的結(jié)果。本研究中，血清蛋白質(zhì)羰基水平在高通量血液透析期結(jié)束時(shí)顯著減少，而在低通量血液透析期結(jié)束時(shí)顯著增加。在低通量透析的情況下，有可能反應(yīng)性羰基的產(chǎn)生超過透析膜對這些基團(tuán)的清除能力。這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的羰基化，其分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于可以經(jīng)低通量膜有效去除的范圍。

總之，高通量血液透析時(shí)血清β-2微球蛋白和蛋白質(zhì)羰基化顯著減少，而晚期氧化蛋白產(chǎn)物卻不受影響。另一方面，使用低通量膜的血液透析導(dǎo)致三種標(biāo)記物的水平顯著增加。因此高通量血液透析能改善對更廣譜的尿毒癥毒素的清除效率，這將改善慢性血液透析患者的生活質(zhì)量并降低其發(fā)病率和死亡率。

[1] 夏 懿,周家俊.中藥灌腸對CKD3～4期患者血清中分子尿毒癥毒素β2-MG清除的臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志,2014,12(8):1658-1660.

[2] Vanholder R,Eloot S,Biesen W V.Do we need new indicators of dialysis adequacy based on middle-molecule removal[J].Nature Clinical Practice Nephrology,2008,4(4):174-5.

[3] 袁聿俊,孫漢瑛,李秀梅.四種不同血液凈化方式對血液透析患者β2-微球蛋白清除的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2015,53(23):31-33.

[4] 李子芊,周亦倫.維持性血液透析患者血壓變異與心血管疾病研究進(jìn)展[J].中國血液凈化,2015,14(2):116-119.

[5] 繆世梅,范亞平,徐學(xué)康,等.維持性血液透析患者氧化應(yīng)激、微炎癥狀態(tài)及其與透析時(shí)間的臨床分析[J].臨床腎臟病雜志,2016,16(6):345-349.

[6] 張秋生,張 猛,劉曉佳,等.蛋白質(zhì)羰基化的研究進(jìn)展[J].中華腦科疾病與康復(fù)雜志:電子版,2014,11(6):54-57.

[7] 畢 會(huì),張 敏,尹彩蘭,等.高通量透析膜對維持性血液透析過程中溶質(zhì)清除及皮膚瘙癢的作用[J].中國組織工程研究,2011,15(29):5493-5496.

[8] Cheung A K,Rocco M V,Yan G,et al.Serum beta-2 microglobulin levels predict mortality in dialysis patients:results of the HEMO study[J].Journal of the American Society of Nephrology Jasn,2006,17(2):546-555.

[9] Okuno S,Ishimura E,Kohno K,et al.Serum beta2-microglobulin level is a significant predictor of mortality in maintenance haemodialysis patients[J].Nephrology,dialysis,transplantation:official publication of the European Dialysis and Transplant Association-European Renal Association,2009,24(2):571-577.

[10] Obeid S N,Taramasso M,Nietlispach F,et al.RENAL FUNCTION POST TAVI,A SIGNIFICANT PREDICTOR OF MORTALITY:INTRODUCING THE ACEF-7 SCORE[J].Journal of the American College of Cardiology,2016,67(13):251-251.

[11] 楊 璞,楊京新,謝礎(chǔ)能.左卡尼汀聯(lián)合蔗糖鐵治療血液透析伴腎性貧血的療效及其對患者氧化應(yīng)激水平的影響[J].海南醫(yī)學(xué),2015,26(24):3680-3682.

[12] Bordoni V,Piroddi M,Galli F,et al.Oxidant and Carbonyl Stress-Related Apoptosis in End-Stage Kidney Disease:Impact of Membrane Flux[J].Blood Purification,2005,24(1):149-56.

[13] 王曉光,陳 宏,鄭劍琴,等.維持性血液透析患者透析相關(guān)性淀粉樣變的相關(guān)危險(xiǎn)因素分析[J].臨床腎臟病雜志,2015,15(5):264-267.

本文編輯：劉欣悅

R692.5

A

ISSN.2096-2479.2017.09.194.04

李霞