孫博

廣東華生司法鑒定中心

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血液中20種毒品的殘留量

孫博

廣東華生司法鑒定中心

目的：試建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血液中20種毒品的殘留量方法。方法：配制20種毒品的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)行血液樣本預(yù)處理，蛋白用乙腈沉淀離心分離，進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。結(jié)果：建立了20種毒品的Y（色譜峰面積）與x（濃度）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)均大于0.970，線性范圍1～100μg/kg，回收率、回收率RSD均符合要求。同時1次性檢出樣本中的20種毒品殘留，無雜峰，無嚴(yán)重干擾。結(jié)論：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可同時測定人血液中多種毒品殘留。

毒品；血液檢驗(yàn)；殘留量；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

毒品泛濫已成為威脅人類健康以及社會穩(wěn)定的重要因素之一[1]。近年來，隨著化學(xué)合成技術(shù)的進(jìn)步，毒品的種類明顯增加，純度提高，給毒品人體殘留檢測增加了許多困難。隨著毒品的泛濫，全世界都加強(qiáng)了口岸吸毒人群的監(jiān)測，部分地區(qū)開始對入境人員進(jìn)行體內(nèi)毒品的檢測。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High perfor?mance liquid chromatography-Mass spectrometry,HPLC-MS/MS），是當(dāng)前最先進(jìn)的物質(zhì)成分檢測技術(shù)之一，結(jié)合了色譜以及質(zhì)譜法兩種技術(shù)的優(yōu)勢，可同時檢測多種物質(zhì)成分，相較于GC-MS/MS測定方法，樣品處理無需衍生，操作相對簡單，靈敏度高，國內(nèi)陸續(xù)開展了針對一種或數(shù)種毒品HPLC-MS/MS檢測體系，檢出限、線性范圍良好。本次研究嘗試構(gòu)建針對20種毒品殘留量高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定體系。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1260高效液相色譜串聯(lián)AB QTRAP 3000四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，IKA MS3渦旋混合器，METTLER TOLEDO電子天平，Milli-Q Reference超純水純化系統(tǒng)，氮吹儀，數(shù)控超聲波清洗器，低溫高速離心機(jī)，立式透明冷藏箱等。20種毒品標(biāo)準(zhǔn)品，包括苯丙胺、甲基苯丙胺、苯佐卡因，3,4-亞甲基二氧基苯丙胺，咖啡因，氯胺酮，杜冷丁，丁卡因，安定，嗎啡，去甲羥基安定，舒樂安定，可待因，利眠寧，咪達(dá)唑侖，美沙酮，蒂巴因，四氫大麻酚，三唑侖，氯氮平，由中國國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供。此外，還包括甲醇、三氯甲烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、純水等標(biāo)準(zhǔn)品。待測樣本取自懷疑吸毒人員，10份，采集自肘部外周靜脈血。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液

分別稱取以上涉及的20種標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，置于10mL容量瓶中，加入少量甲醇溶解，定容，配制1.0mg/mL溶液，避光保存。稱取一定量的毒品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液，用甲醇稀釋為0.1mg/mL、10μg/ mL、1μg/mL工作液溶液，避光4℃保存。取以上20種毒品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液，甲醇稀釋，配制濃度分別為0.1μg/mL、0.01μg/mL、1μg/ L溶液，避光4℃保存，制備混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液。

1.2.2 血液處理

空白樣品取自無吸毒史的健康人群，抗凝管采集，冷藏保存。取血液1.0mL，置于10mL具塞離心管中，加入5μL 0.2μg/mL的SKF525A內(nèi)標(biāo)工作液，加入有機(jī)10mL試劑，超聲下液液萃取，渦旋混勻器上混勻1min，8000r/min，離心10min，提取上層有機(jī)相于試管中，45℃氮?dú)獯蹈?，殘留物?00μL甲醇溶液溶解，過0.25μm濾膜，取20μL進(jìn)樣，按儀器工作條件進(jìn)行測定，測得峰面積，計(jì)算回收率。

1.2.3 儀器工作條件

色譜柱：SHIMADZU VP-ODS（250mm×4.6mm，5μm），C18色譜柱，流動相：A：20mmol·L-1醋酸銨溶液（含0.1%甲酸，V/V），B：乙腈（梯度洗脫）。梯度洗脫程序：0～1min，A為90%，1～3min，A由90%降至10%，保持4.5min，7.5min～8min,A升至90%，保持3min。柱溫35℃、樣品室穩(wěn)定20℃，1.0 mL·min-1（分流比4:1），進(jìn)樣量20μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）電噴霧電壓2500V，掃描模式為正離子模式（ESI＋），全掃描一級質(zhì)譜，選擇離子二級掃描質(zhì)譜檢查，離子源溫度120℃、去溶劑氣溫度40℃、毛細(xì)管電壓3.00kV，錐孔電壓15V、毛細(xì)管電壓3V，去溶劑氣流速750L·h-1，錐孔反吹氣流速50L·h-1。監(jiān)測的離子對及碰撞能量參照國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜分析參數(shù)。

1.2.4 定性分析以及檢測方法的優(yōu)化

在獲得待測樣品中的色譜峰后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對照品中的保留值，進(jìn)行定性、改變?nèi)萘恳蜃覭、離線結(jié)構(gòu)分析。符合以下條件則可認(rèn)為色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)對照一致：①色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)樣品一致；②峰面積有一定加標(biāo)比例關(guān)系；③符合實(shí)驗(yàn)室誤差限定標(biāo)準(zhǔn)范圍。根據(jù)《中華藥典》中有關(guān)毒品的溶解性，分別考察在10、15、20 min條件下甲醇對藥品的溶出度，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)調(diào)節(jié)乙腈、水、甲酸、乙酸銨的濃度水平，建立二元溶劑體系，最終發(fā)現(xiàn)以乙腈提取的樣本的去干擾效果較差，背景干擾多，乙酸乙酯中性條件下回收率較低，加入0.1mol/L NaOH溶液，再提取，化合物回收率較高。原因是多數(shù)毒品為有機(jī)胺類化合物，在C18柱中的保留性會因?yàn)樗嵝詶l件下的電離子化而變差，在弱堿性條件下，化合物保留了分子形式，在C18柱上能夠得到更良好的保留。為降低樣本對質(zhì)譜儀器的污染，通過在線切換閥處理，將目標(biāo)化合物出峰前的溶液和待測組分流出色譜柱之后的溶液，切換至廢液中，盡量減少各種雜質(zhì)對質(zhì)譜的污染。根據(jù)對照標(biāo)準(zhǔn)品的裂解方式，選擇最高豐度離子作為檢測離子條件，最后繪制各類標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)檢測總離子流量圖。

圖1 20種毒品標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)檢測總離子流圖

2 結(jié)果

2.1 毒品的線性方程以及有效性驗(yàn)證結(jié)果

精密度試驗(yàn)采用同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，相對保留時間RSD（%）在0.1～1.2之間，相對峰面積RSD（%）在0.8～2.9之間，均小于3%，精密度符合要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn)采用同一份供試品溶液，記錄0、4、8、16、24h的色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣6次，相對保留時間RSD（%）在0.2～1.1之間，相對峰面積RSD（%）在0.9～2.8之間，均小于3%，樣本溶液24h內(nèi)保持穩(wěn)定精密度符合要求。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取統(tǒng)一對象的血液樣本進(jìn)行重復(fù)檢測6次，相對保留時間RSD（%）在0.1～1.2之間，相對峰面積RSD（%）在1.4～2.8之間，均小于3%，重現(xiàn)性良好。

回收率試驗(yàn)，在陰性血液樣品中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品使其達(dá)到1、2、5μg/kg的濃度水平，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，20種毒品的加標(biāo)回收率在94～102%之間，符合檢測要求。

20種毒品的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限，回收率分別如下：①苯丙胺：y=7.50×105＋7.31×105x，0.996，2.0μg/kg，99.5%；②甲基苯丙胺：y=-0.60×106＋2.32×106x，0.994，2.0μg/kg，101.4%；③苯佐卡因：y=-1.56×105＋2.62×105x，0.998，，2.0μg/kg，95.6%；④3，4-亞甲基二氧基苯丙胺：y=3.90×105＋3.39×105x，0.994，2.0μg/kg，98.6%；⑤咖啡因：y=-4.66×104＋5.92×105x，0.999，2.0μg/kg，99.4%；⑥氯胺酮：y=1.29×106＋2.16×106x，0.991,4.0μg/kg，99.1%；⑦杜冷?。簓=4.21×106＋1.25×107x，0.993，1.0μg/kg，98.5%；⑧丁卡因：y=2.19×105＋3.98×105x，0.995，5.0μg/kg，95.6%；⑨安定：y= 3.59×106＋1.46×106x，0.994，2.0μg/kg，94.8%；⑩嗎啡：y=0.21×103＋2.97×104x，0.985，2.0μg/kg，95.6%；?去甲羥基安定：y=3.83×106＋1.98×106x，0.991，2.0μg/kg，99.1%；?舒樂安定：y=2.24×106＋3.04× 106x，0.990，4.0μg/kg，97.4%；?可待因：y=6.57×105＋5.90×105x，0.986，5.0μg/kg，97.3%；?利眠寧:y=1.12×105＋2.53×105x，0.987，2.0μg/kg，98.6%；?咪達(dá)唑侖:y=0.93×106＋3.06×106x，0.983，3.0μg/ kg，97.4%；?美沙酮:y=2.03×106＋3.54×106x，0.991，4.0μg/kg，97.9%；?蒂巴因:y=1.38×105＋2.96×105x，0.992，3.0μg/kg，98.5%；?四氫大麻酚:y=-2.17×104＋2.75×104x，0.972，2.0μg/kg，98.4%；?三唑侖:y=3.19×105＋2.45×106x，0.984，2.0μg/kg，96.8%；?氯氮平: y=1.07×106＋3.05×106x，0.991，2.0μg/kg，100.56%。20種毒品的線性方程相關(guān)性r在0.970以上，在1.0～100μg/kg之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回收率在94～102%之間，檢出限1.0～5.0μg/kg，均符合要求。

20種毒品標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)檢測總離子流圖見圖1，可見標(biāo)準(zhǔn)對照品離子峰顯現(xiàn)較好，無雜峰。

2.2 待測樣本以及健康人群檢出情況

健康人群檢出咖啡因陽性1例，正常人空白血液樣品色譜圖如下圖2。對吸毒人員的血樣進(jìn)行檢驗(yàn)，10份樣本全部檢出了毒品成分，嗎啡6例、苯佐卡因陽性3例、可待因2例、甲基苯丙胺1例、四氫大麻酚4例、去甲羥基安定5例，絕大多數(shù)檢出了多種毒品成分。圖3為檢出基苯丙胺的對象血液樣本色譜圖。

圖2 正常人空白血液樣品色譜圖

圖3 1例檢出甲基苯丙胺血液樣品色譜圖

3 討論

根據(jù)我國《刑法》第357條規(guī)定，毒品主要是指鴉片、海洛因、甲基苯丙胺（冰毒）、嗎啡、大麻等管制的能夠使人形成癮癖的麻醉藥物和精神藥物。通常而言，毒品可分為麻醉藥物與精神類兩類。在我國使用量較大的毒品主要是海洛因、甲基苯丙胺、嗎啡、大麻等。人在吸毒后，血液、尿液等代謝物中會存在毒品的原體以及代謝物，對這些物質(zhì)進(jìn)行含量檢測，能夠判斷人過去一段時間內(nèi)是否有應(yīng)用毒品的歷史。血液檢驗(yàn)不同于尿液檢驗(yàn)，獲得的樣本質(zhì)量控制相對容易，同時原藥含量相對較高，檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)采集樣本也更為容易，不容易受到腎臟功能等代謝因素的影響，在國際上血樣檢驗(yàn)興奮劑的檢出率也遠(yuǎn)高于尿液檢驗(yàn)。血液毒品檢驗(yàn)的方法較多，包括免疫學(xué)檢驗(yàn)、薄層色譜、高效液相色譜，不同技術(shù)各有優(yōu)劣，儀器聯(lián)用越來越受到重視。高液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測是應(yīng)用最廣泛的聯(lián)用技術(shù)之一，可以應(yīng)對層出不窮的新型毒品，依次分離、定性、定量分析，適合確證分析，而確證分析是吸毒史鑒定的最終目的。

高液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測可同時檢測血液樣本中的多種毒品成分殘留，本次研究建立了20種常見毒品殘留量色譜質(zhì)譜聯(lián)合檢測體系。具有以下優(yōu)勢：①可同時檢測，可進(jìn)行成分檢測，具體分析毒品的種類，從而有針對性的分析當(dāng)前吸毒情況，當(dāng)然需注意的毒品本身在人體內(nèi)可能會出現(xiàn)成分變化，需要做好藥理學(xué)分析[3]；②回收率、精密度較高優(yōu)勢，相關(guān)系數(shù)均大于0.970，線性范圍1.0～100μg/kg，RSD均小于3%，檢出限1.0～5.0μg/kg,精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性試驗(yàn)相對保留時間RSD（%）、相對峰面積RSD（%）均小于3%，符合試驗(yàn)的要求，回收RSD在94～102%之間，回收率也較好，可有效的降低偏差，需注意的是，因毒品的種類較多，建立線性方程、有效性驗(yàn)證過程中基礎(chǔ)工作量大。未進(jìn)行檢測條件的優(yōu)化，也需要進(jìn)行關(guān)聯(lián)試驗(yàn)，做好數(shù)據(jù)管理，從其他渠道獲得已有的數(shù)據(jù)資料，以縮短研究的過程中，提高測試整體效率。③有必要了解檢查地區(qū)的毒品檢測結(jié)果流行情況，對于分析毒品的來源，打擊毒品犯罪具有重要意義。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測毒品方法不僅可用于人體樣本的檢測，還可用于藥物檢測。許多藥物如抗風(fēng)濕類藥物、解熱鎮(zhèn)咳類藥物，可能會添加非法添加劑，其中不乏毒品，如咖啡因。另外許多毒品被用作醫(yī)療領(lǐng)域，如咪達(dá)唑侖是一種臨床常用的鎮(zhèn)定劑，也可用于醫(yī)療事故責(zé)任鑒定。

當(dāng)然，本次研究目標(biāo)毒品的數(shù)量僅為20類，實(shí)際上毒品的種類遠(yuǎn)不止這些，且仍在不斷增多。當(dāng)前，新的毒品層出不窮，制作販賣毒品的犯罪分子也在嘗試制作反檢測的毒品，采用常規(guī)的血液檢測技術(shù)檢出較困難。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定相較于普通的色譜檢測等技術(shù)，靈敏性較好，即使是缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，也能夠較容易的檢出異常的離子峰，對于新毒品的發(fā)現(xiàn)也有重要意義。需注意的是，無吸毒史人群也可能因用藥導(dǎo)致出現(xiàn)異常色譜峰、離子峰，需要慎重對待，做好數(shù)據(jù)的對比工作，避免誤檢[4]。為快速的檢出毒品的類型，實(shí)驗(yàn)室還需加強(qiáng)信息建設(shè)，建立不同毒品的血液樣本濃度與檢測目標(biāo)值之間的數(shù)據(jù)庫，必要時采用智能化的離子峰圖形匹配分析技術(shù)，快速進(jìn)行檢測峰與數(shù)據(jù)庫中的毒品峰對照，快速分析毒品類型。再先進(jìn)的技術(shù)，其檢驗(yàn)的效果也會受到檢驗(yàn)的質(zhì)控水平影響，對于高液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測而言，選擇合適的樣本預(yù)處理非常重要，同時不同的毒品其性質(zhì)不盡相同，不同的物質(zhì)適合的檢驗(yàn)條件不盡相同，這就要求需要對檢驗(yàn)條件的優(yōu)化，以提高檢驗(yàn)的質(zhì)量，今后有必要開展這方面的研究。

綜上所述，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可同時測定人血液中多種毒品殘留，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

[1]聯(lián)合國毒品犯罪局.2012世界毒品報(bào)告[R].2012.

[2]邸玉敏,朱軍,常靖,等.GC/MS、GC/NPD法檢測血液中氯胺酮[J].中國法醫(yī)學(xué)雜質(zhì),2010,25（3）:169-171.

[3]張睿,王海濤,吳斌,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人血液中常見毒品殘留量[J].分析試驗(yàn)室,2011,30（10）:71-74.

[4]M.Cruz-Vera,R.Lucena,S.Ca′rdenas,et al.Sorptive microextrac?tion for liquid-chromat ographic determination of drugs in urine[J]. Trends in Analytical Chemistry,2009,28（10）:1164-1173.