朱旭升， 吳曉宇

論 著

新輔助化療對胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)及核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1表達的影響

朱旭升， 吳曉宇

目的探討新輔助化療對胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響與對胃癌組織中核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1(Special AT rich sequence binding protein 1，SATB1)表達的關(guān)系。方法對2013年12月至2015年12月江蘇省中醫(yī)院消化系腫瘤外科60例進展期胃癌患者術(shù)后癌組織進行超微結(jié)構(gòu)觀察，60例中40例行新輔助化療，其中20例用介入途徑(介入組)，20例用靜脈途徑(靜脈組)，另20例直接行手術(shù)治療為對照組。同時檢測新輔助化療前、后胃癌組織及癌旁組織SATB1的免疫組化表達。結(jié)果對化療敏感的病例癌細胞的細胞器嚴重損傷，包括核固縮、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹；對化療不敏感的病例癌細胞的細胞器未受破壞或僅輕度損傷，其中介入組細胞損傷程度高于靜脈組(P=0.047)。在癌細胞損傷明顯的病例中，SATB1的表達更加明顯(P=0.035)。結(jié)論介入法新輔助化療對胃癌細胞的損傷作用更大。SATB1的表達與胃癌細胞損傷程度相關(guān)，可作為評估新輔助化療療效新的標志物。

胃腫瘤； 顯微鏡檢查，電子，透射； 核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1； 新輔助化療

胃癌患者在就診時多數(shù)已為進展期，Ⅲ、Ⅳ期占50%～60%。研究發(fā)現(xiàn)，進展期胃癌獲得根治性切除的比例少，術(shù)后局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高，5年生存率低[1]。近年來，國內(nèi)外臨床研究表明，新輔助化療可以降低腫瘤的分期，提高胃癌患者的根治性切除率，減少術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，提高生存率[2-4]。本文從超微結(jié)構(gòu)及核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1(special AT-rich sequence binding protein 1,SATB1)的表達，來闡述新輔助化療對胃癌細胞的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

對江蘇省中醫(yī)院消化系腫瘤外科2013年12月至2015年12月收治的60例行胃癌根治術(shù)的患者進行分組觀察。其中男33例，女27例；年齡25～75歲，平均年齡57歲；均經(jīng)胃鏡明確診斷為胃腺癌；通過全腹CT、MRI或超聲內(nèi)鏡對腫瘤分期，cTNMⅡ期23例、Ⅲ期37例；KPS評分>60分，凝血、肝、腎功能等基本正常。40例術(shù)前行新輔助化療，其中20例采用介入法給藥(介入組)，20例采用靜脈法給藥(靜脈組)，另20例直接手術(shù)為對照組。3組年齡、性別、cTNM分期、病理類型等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表1)。

表1 介入組、靜脈組和對照組患者一般資料比較

病理學(xué)類型：1為高分化腺癌，2為中分化腺癌，3為低分化腺癌，4為印戒細胞癌

1.2 化療方法及方案

介入組采用Seldinger法。經(jīng)一側(cè)股動脈插管，導(dǎo)管插入腹腔動脈起始部，注入造影劑，根據(jù)腫瘤顯影情況判斷血供來源，選擇插管部位。若腫瘤顯影不明顯，則根據(jù)腫瘤所在部位，超選擇插管：腫瘤位于賁門和胃體部者選擇胃左動脈或腹腔動脈插管；腫瘤位于胃竇部者，選擇性插入肝總動脈或胃十二指腸動脈。靜脈組選擇周圍靜脈滴注化療。

化療方案均為順鉑60 mg/m2，紫杉醇135 mg/m2。持續(xù)滴注2 h。兩組病例均化療1次，術(shù)前常規(guī)預(yù)防性使用地塞米松，化療當天給予水化和利尿措施以減少毒性反應(yīng)?；熀蟮?天復(fù)查血常規(guī)、肝功能，第7～14天進行手術(shù)。

1.3 觀察項目

1.3.1 細胞超微結(jié)構(gòu)的變化 用電鏡觀察術(shù)后病理切片中癌細胞與癌旁正常胃黏膜細胞的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核、核膜、核仁等超微結(jié)構(gòu)的損傷程度。根據(jù)細胞器上述受損項評價，0～1項為無損傷，2～3項為輕度損傷，4～5項為中度損傷，>5項變化為重度損傷。

1.3.2 SATB1的表達 取胃癌及癌旁組織蠟塊，行鏈霉親和素-過氧化物酶法(streptavidin-perosidase，SP)檢測SATB1表達情況，按免疫反應(yīng)評分(immunoreactivity score，IRS)評估，IRS=染色程度×陽性細胞百分率。染色程度評分：細胞核無染色、弱染色、中等染色、強染色分別計為0分、1分、2分、3分。染色細胞百分率評分：1個視野內(nèi)著色細胞1%～10%計1分；11%～50%計2分；51%～75%計3分；>75%計4分；陰性計0分。IRS值滿3分為弱陽性；4分為陽性；≥5分為強陽性。取陽性及強陽性作為比較值，陰性及弱陽性不作參考。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞與正常胃黏膜細胞超微結(jié)構(gòu)的差異

胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)(圖1)相比正常胃黏膜細胞(圖2)，細胞形狀不規(guī)則；細胞膜可見微絨毛，核體積增大，核膜內(nèi)陷增多，核仁增大，核內(nèi)可見核內(nèi)小體及假性包含物；細胞質(zhì)相對減少，線粒體數(shù)量較多且形態(tài)不規(guī)則，游離核糖體增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器減少。

圖1 胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)(2 μm)圖2 正常胃黏膜細胞

2.2 新輔助化療對胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

在化療組患者術(shù)后病理標本中可見：對化療反應(yīng)好者可見癌細胞大量壞死、崩解，大量細胞碎片，溶酶體增多，單核細胞浸潤，成纖維細胞增生，出現(xiàn)纖維化反應(yīng)；對化療反應(yīng)較好者可見細胞碎片，有些細胞的核仁出現(xiàn)固縮、分裂，核內(nèi)出現(xiàn)空泡，線粒體破壞明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，但仍有未壞死癌細胞；對化療反應(yīng)差者可見癌細胞細胞器基本無損傷，或僅見細胞核固縮及核膜皺縮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹，線粒體腫脹，嵴減少(圖3～圖4)。

圖3 介入組胃癌細胞線粒體腫脹，異染色質(zhì)比例降低，個別線粒體呈空泡狀，核膜破壞，核固縮且出現(xiàn)分裂，核仁固縮(A，2 μm)；單核細胞浸潤及纖維化反應(yīng)(B，5 μm) ×1000

圖4 靜脈組胃癌細胞腫脹，但細胞核改變較少，核仁較大(A，1 μm；B，2 μm)

2.3 新輔助化療不同方式對胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)影響

通過電鏡下觀察統(tǒng)計各組術(shù)后標本發(fā)生胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)變化的例數(shù)及占比(表2)，結(jié)果可見，介入組對胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響明顯大于靜脈組(P<0.05)。

表2 術(shù)后3組胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)改變病例數(shù)(%)比較

注：表中χ2值與P值是介入組與靜脈組比較，未比較手術(shù)組

2.4 新輔助化療不同方式對胃癌細胞損傷程度比較

通過電鏡下觀察介入組與靜脈組術(shù)后標本胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)受損項評分例數(shù)的統(tǒng)計(表3)，結(jié)果可見介入組導(dǎo)致癌細胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度(5項以上者)高于靜脈組(χ2=7.943，P=0.047)。

表3 不同化療方式對胃癌細胞損傷程度的比較

2.5 胃癌細胞細胞器損傷與SATB1表達的關(guān)聯(lián)性

免疫組化結(jié)果顯示(圖5)，60例胃癌患者術(shù)前的癌組織中SATB1表達結(jié)果顯示陰性，而術(shù)后結(jié)果顯示弱陽性9例，陽性18例，強陽性33例。在癌旁組織SATB1表達結(jié)果顯示陰性。在胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)改變明顯的病例中，SATB1的表達水平高，出現(xiàn)強陽性的概率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035)，見表4及圖6～圖7。

表4 SATB1與胃癌細胞細胞器損傷[例(%)]

3 討論

目前，進展期胃癌術(shù)后5年生存率僅為30%～50%[5]。因此，尋求有效治療方法、提高手術(shù)切除率及降低術(shù)后復(fù)發(fā)率至關(guān)重要。術(shù)前化療即新輔助化療的臨床應(yīng)用近年來發(fā)展迅速，其能夠控制原發(fā)病灶，降低臨床分期，利于手術(shù)治療。

圖5 免疫組化SATB1表達(SP法 ×200)A：弱陽性表達；B：陽性表達；C：強陽性表達；D：陰性表達

目前電鏡的研究主要應(yīng)用于觀察腸黏膜形態(tài)及腎臟、血腦屏障及細胞株的超微結(jié)構(gòu)變化，對胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)的研究和報道甚少，同時缺少相應(yīng)的評價標準。本研究用超微結(jié)構(gòu)對比觀察不同化療方式對胃癌細胞的損傷程度及療效，結(jié)果顯示，癌細胞大量壞死、崩解，大量細胞碎片，溶酶體增多，單核細胞浸潤，成纖維細胞增生，出現(xiàn)纖維化反應(yīng)；對化療反應(yīng)較好者可見細胞碎片，有些細胞的核仁出現(xiàn)固縮、分裂，核內(nèi)出現(xiàn)空泡，線粒體破壞明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。同時，不同化療方式對胃癌細胞在超微結(jié)構(gòu)下顯示的的細胞結(jié)構(gòu)損壞程度有不同，介入組在細胞器的損傷程度上明顯重于靜脈組(P<0.01)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，存在化療耐受的現(xiàn)象。實驗結(jié)果中，化療反應(yīng)差者可見癌細胞器基本無損傷，或僅見細胞核固縮及核膜皺縮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹，線粒體腫脹，嵴減少。這類病例對化療的敏感性較差，往往會增加不良反應(yīng)發(fā)生率，影響整體治療效果。以下問題值得研究：①是否存在化療敏感性的預(yù)測方法？②是否能在減少化療劑量的同時不降低臨床療效？我們認為，預(yù)測敏感性更為重要，可以判斷胃癌對于化療是否敏感，選擇合理的治療方法，避免過度治療。

SATB1是一種核基質(zhì)結(jié)合區(qū)組織特異性表達的結(jié)合蛋白[6]，通過與位于BCL-2基因3'端非翻譯區(qū)主要斷裂區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)BCL-2基因的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮作用[7]。Han等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SATB1可限定多個基因組的位點和補充染色質(zhì)修飾酶來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因表達，對乳腺癌的生長轉(zhuǎn)移起到重要作用。SATB1基因在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中過表達，并能調(diào)節(jié)多個腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)移[9-11]。正常胃黏膜組織中STAB1的表達陽性率明顯低于胃癌組織，SATB1的表達與腫瘤的侵犯深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度相關(guān)[12-13]，SATB1的上調(diào)表達可能促進胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，新輔助化療后，超微結(jié)構(gòu)改變明顯的胃癌細胞中，SATB1的表達水平高于超微結(jié)構(gòu)改變不明顯的，出現(xiàn)強陽性的概率更高，表明SATB1的表達與胃癌細胞損傷程度有關(guān)，但具體原因尚待進一步研究。

[1] 何若冰, 陳俊強. 胃癌新輔助化療的研究進展[J].世界華人消化雜志,2009,17(12):1207-1211.

[2] Cunningham D, Allum WH, Stenning SP, et al. Perioperative chemotherapy versus surgery alone for resectable gastroesophageal cancer[J]. N Engl J Med, 2006,355(1):11-20.

[3] 方育, 王亞軍, 李非, 等. 奧沙利鉑聯(lián)合甲酰四氫葉酸鈣和氟尿嘧啶新輔助化療方案治療進展期胃癌的研究[J].中華胃腸外科雜志,2006,9(6):510-512.

[4] 李剛，夏雷，魏尉，等.谷氨酰胺改善新輔助化療引起的進展期胃癌患者腸黏膜通透性改變及毒性反應(yīng)[J].中國腫瘤外科雜志，2014,6(6):341-344.

[5] Lamb P, Sivashanmugam T, White M, et al. Gastric cancer surgery--a balance of risk and radicality[J]. Ann R Coll Surg Engl, 2008,90(3):235-242.

[6] Alvarez JD, Yasui DH, Niida H, et al. The MAR-binding protein SATB1 orchestrates temporal and spatial expression of multiple genes during T-cell development[J]. Genes Dev, 2000,14(5):521-535.

[7] Ma C, Zhang J, Durrin LK, et al. The BCL2 major breakpoint region (mbr) regulates gene expression[J]. Oncogene, 2007,26(18):2649-2657.

[8] Han HJ, Russo J, Kohwi Y, et al. SATB1 reprogrammes gene expression to promote breast tumour growth and metastasis[J]. Nature, 2008,452(7184):187-193.

[9] 周來勇, 劉芳, 童健, 等. 實時熒光定量RT-PCR分析非小細胞肺癌SATB1 的表達和臨床病理意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2009,29(3):534-537.

[10] Cheng C, Lu X, Wang G, et al. Expression of SATB1 and heparanase in gastric cancer and its relationship to clinicopathologic features[J]. APMIS, 2010,118(11):855-863.

[11] Zhao XD, Ji WY, Zhang W, et al. Overexpression of SATB1 in laryngeal squamous cell carcinoma[J]. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec, 2010,72(1):1-5.

[12] 楊歡,李倩,傅薇薇,等.SATBl和COX-2在胃癌中的表達及其臨床意義[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,33(5):334-337.

[13] 宋桂芹, 劉康, 白亦光, 等. SATB1在胃癌細胞SGC-7901中表達的研究[J].中華全科醫(yī)學(xué),2014,12(1):21-23,封3.

AdvancedgastriccancercellultrastructurechangeafterneoadjuvantchemotherapyandcanceroustissueSATB1expression

ZHUXusheng1,WUXiaoyu2.

(1.DepartmentofGeneralSurgery,NanjingGaochunHospitalofTCM,Nanjing211300,China; 2.DepartmentofDigestiveTumorSurgery,JiangsuProvinceHospitalofTCM,Nanjing210029,China)

ZHUXusheng,Email：2758966243@qq.com

ObjectivePhase by observing the progress of the changes of the ultrastructure of gastric cancer cells after neoadjuvant chemotherapy and carcinoma tissue SATB1 expression, and to explore new adjuvant chemotherapy for gastric cancer cell damage mechanism, and the relationship between the ultrastructural changes and SATB1.MethodsFrom December 2013 and December 2015, 60 patients with advanced gastric cancer were enrolled in Department of Digestive Tumor Surgery; Jiangsu Province Hospital of TCM, including 20 cases who accepted interventional chemotherapy and intravenous chemotherapy to the 20 cases, direct surgical treatment as control group 20 cases. SATB1 immunohistochemical expression of gastric cancer tissues and tissues adjacent to carcinoma were detected before and after the new adjuvant chemotherapy.ResultsIn cases where chemotherapy was sensitive, the organelles of cancer cells were severely damaged, including pyknosis, mitochondria, and endoplasmic reticulum swelling. In cases where chemotherapy was not sensitive, the organelles of cancer cells were not destroyed or only mildly damaged. The injury degree of the interventional group was higher than that of the intravenous group (P=0.047). The expression of SATB1 was more significant in the cases with obvious cancer damage (P=0.035).ConclusionsInterventional neoadjuvant chemotherapy has more damage to gastric cancer cells. SATB1 expression is related to tumor infiltrating degree, and SATB1 can be used as a new marker to evaluate the efficacy of neoadjuvant chemotherapy.

Stomach neoplasms; Cells; Microscopy, electron, transmission; Matrix attachment region binding proteins 1; Neoadjuvant chemotherapy

211300 江蘇 南京， 南京市高淳中醫(yī)院 普外科(朱旭升)； 210029 江蘇 南京，江蘇省中醫(yī)院 消化系腫瘤外科(吳曉宇)

朱旭升，Email：2758966243@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.04.009

1674-4136(2017)04-0239-04

2017-01-18][本文編輯：欽嫣]