中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

麻疹診斷

中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

前 言

本標(biāo)準(zhǔn)第5章為強(qiáng)制性條款，其余為推薦性條款。

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1—2009 給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)代替WS 296—2008《麻疹診斷標(biāo)準(zhǔn)》。本標(biāo)準(zhǔn)自實(shí)施之日起，WS 296—2008同時(shí)廢止。

本標(biāo)準(zhǔn)與WS 296—2008相比，主要修改如下：——修改了縮略語（見第2章，2008年版的第2章）；——修改了麻疹的診斷依據(jù)（見第3章，2008年版的第3章）；——修改了臨床診斷病例的定義（見第 5 章，2008 年版的第 5 章）；——增加了實(shí)驗(yàn)室檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)操作（見附錄 A 和附錄 B，2008 年版的附錄 A 和附錄 B）；——增加了麻疹流行病學(xué),尤其是新形勢下麻疹傳播呈現(xiàn)的流行病學(xué)特征、臨床表現(xiàn)、并發(fā)癥等內(nèi)容（見附錄 C，2008 年版的附錄 C）。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國疾病預(yù)防控制中心、中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院、廣東省疾病預(yù)防控制中心、浙江省疾病預(yù)防控 制中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：羅會(huì)明、許文波、余文周、李興旺、馬超、張燕、謝正德、郝利新、鄭慧貞、謝淑云、蘇琪茹。

本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：——GB 15983—1995；

——WS 296—2008。

1 范 圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了麻疹的診斷依據(jù)、診斷原則、診斷和鑒別診斷。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于全國各級(jí)各類醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)及其醫(yī)務(wù)人員對(duì)麻疹的診斷。

2 縮略語

下列縮略語適用于本文件。

CPE：致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect）

DEPC：焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate）

ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immun

osorbent assay）

IgG：免疫球蛋白G（immunoglobulin G）

IgM：免疫球蛋白M（immunoglobulin M）

RF：類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor）

RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）

RT- PCR：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription

polymerase chain reaction）

RPM：每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（revolutions per minute）

OD：光密度值（optical density value）

VTM：病毒運(yùn)輸液（virus transportation medium）

3 診斷依據(jù)

3.1 流行病學(xué)史

3.1.1 在出疹前 7 d～21 d 與麻疹確診患者有接觸史。

3.1.2 在出疹前 7 d～21 d 有麻疹流行地區(qū)居住或旅行史。

3.2 臨床表現(xiàn)

3.2.1 發(fā)熱，體溫一般≥38 ℃。

3.2.2 在病程第 3 天～第 4 天開始出現(xiàn)紅色斑丘疹，疹間皮膚正常。出疹順序一般自耳后、面部開始， 自上而下向全身擴(kuò)展，并可累及黏膜。出疹時(shí)間一般持續(xù) 3 d～5 d。

3.2.3 咳嗽、流涕、噴嚏等上呼吸道卡他癥狀，并有畏光、流淚、結(jié)膜炎癥狀。

3.2.4 起病早期（一般于病程第 2 天～第 3 天）在口腔頰黏膜見到麻疹黏膜斑（Koplik 斑）。

3.3 實(shí)驗(yàn)室檢測

3.3.1 采血前8 d～56 d 內(nèi)未接種過含麻疹成分減毒活疫苗，而出疹后 28 d 內(nèi)血標(biāo)本中麻疹I(lǐng)gM 陽性（見附錄 A）。

3.3.2 咽拭子或尿液標(biāo)本中麻疹病毒核酸陽性或分離到麻疹病毒（見附錄 B）。

3.3.3 恢復(fù)期血標(biāo)本麻疹 IgG 抗體滴度比急性期有≥4 倍升高，或急性期抗體陰性而恢復(fù)期抗體陽轉(zhuǎn)（見附錄 A）。

4 診斷原則

根據(jù)流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果予以診斷。

5 診 斷

5.1 疑似病例

具備3.2.1、3.2.2和3.2.3。

5.2 臨床診斷病例

疑似病例符合以下任何一項(xiàng)者：

a) 具備 3.1.1 和/或 3.1.2，且未明確診斷為其他疾??；

b) 具備 3.2.4；

c) 未采集標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，且未明確診斷為其他疾病。

5.3 實(shí)驗(yàn)室確診病例

疑似病例具備 3.3.1、3.3.2、3.3.3 中任何一項(xiàng)者。

5.4 排除病例

疑似病例符合以下任何一項(xiàng)者：

a) 出疹后 4 d～28 d 內(nèi)采集的血標(biāo)本檢測麻疹 IgM 抗體陰性，且不符合 3.1.1 和/或 3.1.2；

b) 出疹后 3 d 內(nèi)采集的血標(biāo)本檢測麻疹 IgM抗體陰性，合格咽拭子/尿液標(biāo)本中麻疹病毒核酸陰 性，且不符合 3.1.1 和 /或 3.1.2；

c) 未采集標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，但明確診斷為其他疾?。?/p>

d) 病原學(xué)標(biāo)本分離鑒定出麻疹疫苗株病毒或疫苗株病毒核酸陽性，且未分離出麻疹野病毒也無麻疹野病毒核酸陽性；或同時(shí)符合以下 5 種情形的：

1) 有出疹，有或無發(fā)熱，但無咳嗽等呼吸道癥狀；

2) 接種含麻疹成分減毒活疫苗后 7 d～14 d出疹；

3) 血標(biāo)本采集日期為接種含麻疹成分減毒活疫苗后 8 d～56 d，且檢測麻疹 IgM 陽性；

4) 流行病學(xué)調(diào)查未發(fā)現(xiàn)該病例引起的續(xù)發(fā)病例；

5) 流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室調(diào)查未發(fā)現(xiàn)其他可明確解釋的原因。

6 鑒別診斷

本病應(yīng)與風(fēng)疹、猩紅熱、幼兒急疹等其他發(fā)熱出疹性疾病進(jìn)行鑒別（參見附錄 C）。

附錄A（規(guī)范性附錄） 血清學(xué)診斷方法

A.1 血液標(biāo)本的采集、儲(chǔ)存及運(yùn)輸

A.1.1 血標(biāo)本的采集

出疹后28 d內(nèi)采集血液標(biāo)本，用于麻疹I(lǐng)gM和IgG血清學(xué)檢測。

A.1.2 在下列情況下需要采集第2份血標(biāo)本

出疹后3 d內(nèi)采集的血標(biāo)本檢測麻疹I(lǐng)gM抗體陰性，無合格咽拭子/尿液標(biāo)本，需要采集4 d～28 d 的第2份血標(biāo)本。

A.1.3 血標(biāo)本采集流程

A.1.3.1 用無抗凝劑采血管收集2 mL～3 mL靜脈血，在管壁上做好標(biāo)記。

A.1.3.2 血標(biāo)本不能冷凍，應(yīng)1 000 RPM離心10 min，用于分離血清；如果無離心機(jī)，血標(biāo)本應(yīng)冷藏4℃ 放置，直到血清完全析出。

A.1.3.3 小心吸取血清，避免吸到紅血球，在無菌條件下，移至帶外螺旋蓋的血清管中，在管壁上做 好標(biāo)記。

A.1.3.4 填寫標(biāo)本送檢表，包括最后一次接種含麻疹成分疫苗日期、出疹日期、標(biāo)本采集日期。送檢 表上要注明病例編號(hào)。

A.1.4 血標(biāo)本的儲(chǔ)存

A.1.4.1 血標(biāo)本應(yīng)冷藏（2 ℃～8 ℃）保存，并在24 h內(nèi)送達(dá)檢測實(shí)驗(yàn)室。如不能達(dá)到上述要求，應(yīng)按 照A.1.3方法分離血清。

A.1.4.2 無菌血清應(yīng)在48 h內(nèi)使用冰盒運(yùn)送到檢測實(shí)驗(yàn)室，或保存在2 ℃～8 ℃，最多不能超過7 d。 血清長期保存應(yīng)在-20 ℃以下冷凍，避免反復(fù)凍融。

A.1.5 血標(biāo)本的運(yùn)輸

標(biāo)本應(yīng)盡快運(yùn)送到檢測實(shí)驗(yàn)室，將盛裝標(biāo)本的容器放在有封口的塑料袋中，用冷藏盒或保溫瓶運(yùn)送， 將標(biāo)本送檢單放在塑料袋中，再用膠帶固定在冷藏盒中的上部，運(yùn)輸日期確定后，通知接收實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本運(yùn)送的時(shí)間和運(yùn)輸方法。

A.2 實(shí)驗(yàn)室檢測

A.2.1 ELISA法檢測麻疹I(lǐng)gM抗體

A.2.1.1 用途

主要用于定性和/或定量檢測人血清或血漿中抗麻疹病毒的IgM抗體，用于麻疹早期診斷。

A.2.1.2 操作步驟（或按照試劑使用說明書進(jìn)行）

A.2.1.2.1 定量ELISA法檢測麻疹病毒IgM抗體的標(biāo)本稀釋法

A.2.1.2.1.1 應(yīng)使用500 μL稀釋緩沖液對(duì)10 μL患者待測樣品進(jìn)行稀釋，制成患者標(biāo)本稀釋液。

A.2.1.2.1.2 將 40 μL RF 加入 100 μL 患者標(biāo)本稀釋液（A.2.2.2.1.1）中，并用60 μL稀釋緩沖液進(jìn) 行稀釋，最終標(biāo)本稀釋比例為1∶100。

A.2.1.2.2 檢測過程

A.2.1.2.2.1 將檢測所需數(shù)目的微孔條放到微孔板框上并準(zhǔn)備好一張標(biāo)簽。

A.2.1.2.2.2 加入RF的待測血清標(biāo)本，于室溫吸附15 min或4 ℃過夜。

A.2.1.2.2.3 在微量孔內(nèi)分別加入100 μL的已稀釋樣本或立即可用的對(duì)照血清。留一個(gè)孔作為底物空白，例如：

A.2.1.2.2.4 將樣品于濕盒內(nèi)（37±1）℃孵育（60±5） min。

A.2.1.2.2.5 孵育后以洗液緩沖液洗滌板孔（使用自動(dòng)洗板機(jī)或手工洗板）。先吸去或甩去洗液；然后 每孔內(nèi)加入300 μL洗液，再吸去或甩去洗液，重復(fù)洗滌過程共4次；最后將微孔板翻轉(zhuǎn)過來在紙巾上拍干，使微孔中不再含有液體。

A.2.1.2.2.6 加入酶標(biāo)記抗體：于相應(yīng)孔內(nèi)（底物空白孔除外）加入100 μL IgM酶標(biāo)記抗體，濕盒內(nèi)（37±1）℃孵育（30±1）min。

A.2.1.2.2.7 以洗液緩沖液洗滌板孔（見A.2.2.2.2.5）。

A.2.1.2.2.8 加入底物：于每孔內(nèi)加入100 μL底物溶液（包括底物空白孔），濕盒內(nèi)（37±1）℃孵育（30±1）min。

A.2.1.2.2.9 終止反應(yīng)：每孔內(nèi)加入100 μL終止液，輕微振蕩微孔板以混合溶液。

A.2.1.2.2.10 讀取OD值：以底物空白孔為空白對(duì)照，60 min內(nèi)讀取OD值。

A.2.1.3 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)

A.2.1.3.1 底物空白孔的OD值必須＜0.25。A.2.1.3.2 陰性對(duì)照必須為陰性。

A.2.1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)血清的平均OD值必須在有效范圍內(nèi)，此范圍已在試劑盒專用的質(zhì)量控制證書中給定（減去底物空白之后）。

A.2.1.3.4 如果未達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，則試驗(yàn)無效且應(yīng)重做。

A.2.1.4 結(jié)果評(píng)估

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血清OD值計(jì)算CUT-OFF值上限和下限，標(biāo)本OD值≥CUT-OFF值上限,結(jié)果判定為陽性；標(biāo)本 OD值＜ CUT-OFF值下限,結(jié)果判定為陰性；當(dāng)標(biāo)本OD值在CUT-OFF值上限和下限之間，結(jié)果判定為可疑。

根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)本中抗體活性值。

A.2.2 ELISA法檢測麻疹I(lǐng)gG抗體

A.2.2.1 用途

主要用于定性和/或定量檢測人血清或血漿中抗麻疹病毒的IgG抗體，用于麻疹診斷或人群抗體水平調(diào)查。

A.2.2.2 操作步驟（或按照試劑使用說明書進(jìn)行）

A.2.2.2.1 定量ELISA法檢測麻疹病毒IgG抗體的標(biāo)本稀釋法

應(yīng)使用1 000 μL稀釋緩沖液對(duì)10 μL患者待測樣品進(jìn)行稀釋，制成患者標(biāo)本稀釋液，最終標(biāo)本稀 釋比例為1∶100。

A.2.2.2.2 檢測過程

A.2.2.2.2.1 將檢測所需數(shù)目的微孔條放到微孔板框上并準(zhǔn)備好一張標(biāo)簽。

A.2.2.2.2.2 在微量孔內(nèi)分別加入100 μL的已稀釋樣本或立即可用的對(duì)照血清。留一個(gè)孔作為底物空白，例如：

A.2.2.2.2.3 將樣品于濕盒內(nèi)（37±1）℃孵育（60±5）min。

A.2.2.2.2.4 孵育后以洗液緩沖液洗滌板孔（使用自動(dòng)洗板機(jī)或手工洗板）。先吸去或甩去洗液；然后每孔內(nèi)加入300 μL洗液，再吸去或甩去洗液，重復(fù)洗滌過程共4次；最后將微孔板翻轉(zhuǎn)過來在紙巾上拍干，使微孔中不再含有液體。

A.2.2.2.2.5 加入酶標(biāo)記抗體：于相應(yīng)孔內(nèi)（底物空白孔除外）加入100 μL IgG酶標(biāo)記抗體，濕盒內(nèi)（37±1）℃孵育（30±1）min。

A.2.2.2.2.6 以洗液緩沖液洗滌板孔（見A.2.2.2.2.5）。

A.2.2.2.2.7 加入底物：于每孔內(nèi)加入100 μL底物溶液（包括底物空白孔），濕盒內(nèi)（37±1）℃孵育（30±1）min。

A.2.2.2.2.8 終止反應(yīng)：每孔內(nèi)加入100 μL終止液，輕微振蕩微孔板以混合溶液。

A.2.2.2.2.9 讀取OD值：以底物空白孔為空白對(duì)照，60 min內(nèi)讀取OD值。

A.2.2.3 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)

A.2.2.3.1 底物空白孔的OD值必須＜0.25。

A.2.2.3.2 陰性對(duì)照必須為陰性。

A.2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)血清的平均OD值必須在有效范圍內(nèi)，此范圍已在試劑盒專用的質(zhì)量控制證書中給定（減去底物空白之后）。

A.2.2.3.4 如果未達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，則試驗(yàn)無效且必須重做。

A.2.2.4 結(jié)果評(píng)估

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血清OD值計(jì)算CUT-OFF值上限和下限，標(biāo)本OD值≥CUT-OFF值上限,結(jié)果判定為陽性；標(biāo)本 OD值＜CUT-OFF值下限,結(jié)果判定為陰性；在標(biāo)本OD值在CUT-OFF值上限和下限之間，結(jié)果判定為可疑。根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)本中抗體活性值。

附錄B（規(guī)范性附錄） 病原學(xué)診斷方法

B.1 病毒分離

B.1.1 標(biāo)本采集與處理

B.1.1.1 標(biāo)本采集

用于病毒分離的標(biāo)本包括咽拭子和尿液。宜在麻疹病例出疹前5 d至疹后5 d內(nèi)取上述標(biāo)本。

B.1.1.2 標(biāo)本處理方法

B.1.1.2.1 咽拭子標(biāo)本

將無菌棉拭子稍蘸生理鹽水，反復(fù)涂抹患者咽部數(shù)次，然后將棉拭子浸于1 mL～2 mL標(biāo)本維持液[含 500～1 000單位（Unit，U）/mL青霉素、500 μg/mL～1 000 μg/mL鏈霉素和2%牛血清DMEM液]或者 VTM中，并反復(fù)擠壓后，棄棉拭子。標(biāo)本維持液中最好加無細(xì)胞毒性的制霉菌素50 μg/mL或二性霉素5 μg/mL，接種細(xì)胞前置于4 ℃過夜，用于滅活真菌。

B.1.1.2.2 尿液標(biāo)本

無菌收集30 mL～50 mL中段尿液于50 mL帶螺旋蓋的無菌塑料離心管中，當(dāng)日盡快冷藏送至實(shí)驗(yàn)室，2 000 Rpm，離心5 min，棄上清，沉淀用2 mL標(biāo)本維持液或VTM重懸，重懸后的標(biāo)本液于-70 ℃凍存； 未經(jīng)離心的尿液不得冷凍。

B.1.2 標(biāo)本接種

上述處理后的標(biāo)本，接種細(xì)胞前需要至少-70 ℃凍融一次，以利于病毒從上皮細(xì)胞釋放。取0.3 mL～ 0.5 mL標(biāo)本液接種于生長良好的單層傳代細(xì)胞系如非洲綠猴腎細(xì)胞/淋巴細(xì)胞信號(hào)激活因子轉(zhuǎn)染的非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero cell transfected to express the human signaling lymphocyte activation molecule, Vero/SLAM）上，置37 ℃吸附1 h～2 h后棄液，再加入維持液，置37 ℃培養(yǎng)，次日觀察有無細(xì)胞毒性， 必要時(shí)換液。

B.1.3 觀察CPE

接種后每天觀察CPE的進(jìn)展情況，連續(xù)觀察7 d，如果有特征性的麻疹病毒CPE出現(xiàn)，觀察直到75%以上的細(xì)胞發(fā)生病變（CPE+++），-70 ℃凍存。若無CPE，即置-70℃凍化3次，再盲傳1代～2代。

B.1.4 毒株鑒定

可以采用熒光定量RT-PCR、RT-PCR和序列測定等方法進(jìn)行麻疹病毒株的鑒定（見附錄B.2）。

B.2 病毒核酸檢測

B.2.1 標(biāo)本收集與處理

參考B.1.1，進(jìn)行標(biāo)本的收集與處理。在標(biāo)本的運(yùn)送過程中，注意低溫條件運(yùn)輸，在標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室后，不要反復(fù)凍融標(biāo)本，以免核酸發(fā)生降解。

B.2.2 病毒核酸提取

使用商品化的試劑盒或自動(dòng)核酸提取儀，操作方法參照試劑盒說明書和/或自動(dòng)核酸提取儀儀器使用說明。也可以采用TRIZOL法提取，具體步驟如下：

a) 取 250 μL 病毒懸液加到 1.5 mL 離心管中，然后加入 750 μL TRIZOL 溶液，混勻 5 s 后離心；

b) 加入 200 μL 三氯甲烷溶液，充分混勻 5 s；

c) 室溫放置 10 min，然后在室溫，10 000 RPM離心 20 min；

d) 將上清液轉(zhuǎn)移到一支新的 1.5 mL 離心管中；

e) 再加入 500 μL 異丙醇溶液，搖勻 10 s；f) 室溫靜置至少 15 min；

g) 4 ℃，13 000 RPM 離心 25 min；

h) 倒掉上清液，加入 950 μL 冰冷的 70%乙醇；

i) 4 ℃，13 000 RPM 離心 20 min；

j) 用吸尖小心吸出上清液；

k) 室溫干燥后加入15 μL DEPC處理后的H2O，并加入 20 U 的RNasin（RNA 酶蛋白質(zhì)抑制劑），-20 ℃保存。

注：整個(gè)操作過程要帶口罩和一次性手套。

B.2.3 熒光定量RT-PCR方法檢測麻疹病毒核酸

B.2.3.1 反應(yīng)體系

B.2.3.2 引物和探針序列

B.2.3.2.1 上游引物序列：5’-TGG CAT CTG AAC TCG GTA TCA C-3’

B.2.3.2.2 下游引物序列：5’-TGT CCT CAG TAG TAT GCA TTG CAA-3’

B.2.3.2.3 探針序列：5’(FAM)-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-3’(BHQ)

B.2.3.3 反應(yīng)條件

B.2.3.4 結(jié)果分析和判斷

結(jié)果分析和判斷方法參照試劑盒說明書。

B.2.4 麻疹病毒鑒定和基因定型靶基因的擴(kuò)增及序列測定

B.2.4.1 N基因羧基末端634個(gè)核苷酸序列的擴(kuò)增

B.2.4.1.1 反應(yīng)體系

B.2.4.1.2 引物序列

B.2.4.1.2.1 上游引物序列：5’-TGG AGC TAT GCC ATG GGA GT-3’

B.2.4.1.2.2 下游引物序列：5’-TAA CAA TGA TGG AGG GTA GG-3’

B.2.4.1.3 在PCR儀中按如下過程進(jìn)行反應(yīng)

B.2.4.1.4 PCR產(chǎn)物的檢測和鑒定

B.2.4.1.4.1 制備1%～2%瓊脂糖凝膠

取100 mL電泳緩沖液（1×TAE）加入到干凈的三角瓶中，加入1 g～2 g瓊脂糖粉末，輕輕搖動(dòng)三角瓶，使瓊脂糖微粒呈均勻混濁狀態(tài)；微波爐加熱使瓊脂糖熔化；熔化的瓊脂糖自然冷卻到70 ℃左右， 倒入已準(zhǔn)備好的膠床中，凝膠厚度約為0.3 cm～0.5 cm；室溫下靜置，凝膠固化。

B.2.4.1.4.2 凝膠電泳

取已制備好的瓊脂糖凝膠，置于電泳槽中；向電泳糟中加入電泳緩沖液（1×TAE），緩沖液的量以超過凝膠表面1 mm～2 mm為宜；用加樣器吸取樣品5 μL，與上樣緩沖液混勻后，輕輕加入到凝膠的樣品孔中；電壓選擇100 V，開始電泳。當(dāng)指示劑遷移到合適位置時(shí)，則切斷電源取出凝膠；將凝膠放入含溴化乙錠（EB）的溶液中，染色約10 min；凝膠成像儀觀察電泳條帶，保存記錄。也可使用其他商品化的染料代替EB，使用方法參照染料使用說明書。

B.2.4.1.5 PCR產(chǎn)物切膠純化

使用試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。具體操作步驟參見試劑盒說明書。

B.2.4.1.6 標(biāo)記反應(yīng)

B.2.4.1.6.1 配制標(biāo)記反應(yīng)體系

B.2.4.1.6.2 在PCR儀中按如下過程進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)

B.2.4.1.6.3 標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物純化

稱量 2.7 g G-50 粉末放入 50 mL 離心管中，加入去離子水至50 mL。充分混勻后，室溫靜置30 min， 使之充分水化；向離心柱中加入混勻的G-50 混懸液900 μL，靜置 10 min；加壓，使多余的水分從離心柱的底部流出；隨后將離心柱放在2 mL 收集管上，于室溫 3 000 RPM 離心2 min；將離心柱轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，向凝膠的斜面中央加入標(biāo)記產(chǎn)物；于室溫3 000 RPM 離心2 min，收集純化后的標(biāo)記產(chǎn)物。

B.2.4.1.7 序列測定

將純化好的標(biāo)記產(chǎn)物加入到 96 孔 PCR 板中，在計(jì)算機(jī)中輸入樣品的編號(hào)，然后按照序列分析儀的操作說明書進(jìn)行后續(xù)的操作。

B.2.4.1.8 序列整理和分析

從序列測定儀上獲得的序列資料，以標(biāo)準(zhǔn)的圖形文件（.ab1）保存，序列整理使用相關(guān)序列分析軟件分別對(duì)序列進(jìn)行剪輯，以及基因親緣性關(guān)系、核苷酸和氨基酸同源性分析等。

附錄C（資料性附錄）麻疹的病原學(xué)、流行病學(xué)和臨床表現(xiàn)

C.1 麻疹的病原學(xué)

麻疹病毒為麻疹的病原體，于20世紀(jì)50年代由John Enders和Thomas Peebles首先從麻疹患者的血液中分離得到。麻疹病毒是已知的最具傳染性病原體之一，人類是麻疹病毒的唯一自然宿主。

麻疹病毒為有包膜的單鏈RNA病毒，屬于副黏液病毒科的麻疹病毒屬。麻疹病毒全基因組中，N（Nucleoprotein,核蛋白）和H（Hemaggglutitin,血凝素）基因變異相對(duì)較大，其中N基因羧基末端的 450個(gè)核苷酸變異最大，該段序列既可鑒定麻疹病毒，又是麻疹病毒基因定型的靶序列。通過對(duì)N基因羧基末端的RT-PCR擴(kuò)增，可達(dá)到鑒定麻疹病毒、診斷麻疹的目的；通過對(duì)陽性RTPCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定和 分析，可達(dá)到基因定型的目的，同時(shí)也能區(qū)分疫苗株和野毒株引起的疑似麻疹病例。依據(jù)麻疹病毒血凝素和核蛋白基因序列的差異，可以將全球曾經(jīng)流行的麻疹病毒分為24個(gè)基因型，一些國家或地區(qū)具有特定的本土基因型，中國近20多年來主要以H1基因型麻疹病毒流行為絕對(duì)優(yōu)勢基因型，通過分子流行病學(xué)監(jiān)測可以追蹤麻疹病毒的來源和傳播途徑。

麻疹病毒只有一個(gè)血清型，可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的麻疹病毒膜表面糖蛋白中和抗原血凝素和血融素相對(duì)保守，20世紀(jì)50至60年代由A基因型麻疹野病毒研制的麻疹減毒活疫苗目前仍在全世界范圍廣泛應(yīng)用，對(duì)全球消除和強(qiáng)化控制麻疹發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。很多研究都證實(shí)，由于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全或受母傳抗體的干擾，≤6月齡嬰兒接種麻疹疫苗往往發(fā)生免疫失敗比例較高。適齡兒童接種疫苗后，麻疹中和性抗體可以持續(xù)很長時(shí)間，對(duì)麻疹病毒具有長效的免疫力，盡管疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體隨時(shí)間的推移而逐漸下降，甚至可能檢測不到，但免疫記憶會(huì)持續(xù)存在。

麻疹病毒侵入人體2 d～3 d后在呼吸道上皮細(xì)胞和附近的淋巴結(jié)內(nèi)復(fù)制，隨著網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)感染出現(xiàn)首次病毒血癥，5 d～7 d后，更多的病毒復(fù)制發(fā)生在局部和末梢網(wǎng)狀內(nèi)皮組織，并發(fā)生第二次病毒血癥。從前驅(qū)癥狀開始到皮疹出現(xiàn)后3 d～5 d，從鼻咽部標(biāo)本、血液中的白細(xì)胞和尿液標(biāo)本中均能分離出麻疹病毒。典型麻疹病例出疹后3 d內(nèi)僅約70%左右的患者IgM陽性，4 d～28 d應(yīng)為100%陽性（輕型麻疹病例IgM的產(chǎn)生會(huì)更晚一些）。

C.2 麻疹流行病學(xué)

C.2.1 流行特征

麻疹病人是唯一的傳染源，病毒可經(jīng)飛沫傳播或直接接觸感染者的鼻咽分泌物傳播，無患病史和麻疹疫苗免疫史的人群普遍易感，其中包括母傳抗體已衰減的嬰幼兒。所有易感者感染麻疹病毒都是有癥狀的。易感者感染麻疹病毒，7 d～21 d后出現(xiàn)皮疹?；颊咴诔稣钋? d至出疹后4 d均具有傳染性。對(duì)于一個(gè)已有免疫力的感染麻疹病毒的人，其IgM抗體水平可能會(huì)臨時(shí)升高且無癥狀表現(xiàn)，但這些人并無傳染性。

麻疹疫苗既有單價(jià)疫苗，也有含麻疹成分的聯(lián)合疫苗，另含風(fēng)疹、流行性腮腺炎等成分。我國在疫苗應(yīng)用以前，麻疹呈自然流行狀態(tài)，發(fā)病高峰周期性出現(xiàn)，1951年—1964年，全國報(bào)告發(fā)病率波動(dòng)在 157.5/10萬～1 432.4/10萬。1965年開始大規(guī)模使用麻疹疫苗，隨著計(jì)劃免疫實(shí)施和疫苗冷鏈系統(tǒng)建設(shè)以及免疫策略的調(diào)整，麻疹發(fā)病水平持續(xù)下降。1998年我國提出加速麻疹控制規(guī)劃，2006年開始實(shí)施消除麻疹行動(dòng)計(jì)劃，2007年實(shí)施擴(kuò)大免疫規(guī)劃，實(shí)施2劑次含麻疹成分疫苗免疫程序，即8月齡接種第1劑（使用麻疹-風(fēng)疹聯(lián)合疫苗），18月齡～24月齡接種第2劑（使用麻疹-流行性腮腺炎-風(fēng)疹聯(lián)合疫苗）。 2004年—2009年先后27個(gè)省開展補(bǔ)充免疫，2010年全國統(tǒng)一開展麻疹疫苗補(bǔ)充免疫活動(dòng)，2009年—2012 年全國報(bào)告發(fā)病率持續(xù)下降，2011年和2012年＜1/10萬。麻疹一年四季均可發(fā)生，3月—5月為其發(fā)病高峰。發(fā)病主要集中在小年齡兒童中，近年來隨著發(fā)病率的下降，＜8月齡麻疹病例所占比例上升明顯，部分地區(qū)15歲以上麻疹病例占較高比例。

C.2.2 麻疹病例感染來源分類

C.2.2.1 本土病例

實(shí)驗(yàn)室或流行病學(xué)依據(jù)證實(shí)病例來源于本土麻疹病毒持續(xù)傳播，或無證據(jù)表明為國（境）外輸入病例或國（境）外輸入病例的傳播所致。

C.2.2.2 輸入病例

有流行病學(xué)和/或病毒學(xué)依據(jù)證實(shí)，麻疹病例是在其他國家（地區(qū)）感染麻疹病毒。病例須在出疹前7 d～21 d有在其他國家（地區(qū)）的暴露史，且在進(jìn)入境內(nèi)后21 d內(nèi)出疹。如果出疹前7 d～21 d期間只有部分時(shí)間在其他國家（地區(qū)）的，需要對(duì)病例接觸史進(jìn)行詳盡調(diào)查，并對(duì)病例感染的病毒做基因定型并與國內(nèi)外流行株做對(duì)比分析，以排除在境內(nèi)感染的可能性。

C.2.2.3 輸入相關(guān)病例

有流行病學(xué)和/或病毒學(xué)依據(jù)證實(shí)，在境內(nèi)感染自國（境）外輸入病例或其傳播鏈的病例。如果病毒為非本土基因型但暴露史不詳，也視為輸入相關(guān)病例。

輸入病例造成的傳播在境內(nèi)持續(xù)超過12個(gè)月，此后發(fā)生的病例不再屬于輸入相關(guān)病例，應(yīng)視為輸入病毒建立了本土傳播。

C.2.2.4 感染來源不詳病例

在已證實(shí)消除麻疹的地區(qū)，調(diào)查無法確認(rèn)該病例同輸入病例或本土病例存在流行病學(xué)或病毒學(xué)聯(lián)系的。

C.3 麻疹臨床表現(xiàn)

C.3.1 類型

C.3.1.1 典型麻疹

即普通型，臨床最為常見。典型麻疹的臨床經(jīng)過可分以下幾期：前驅(qū)期3 d～4 d，發(fā)熱，體溫達(dá)39 ℃～ 40 ℃，流涕、噴嚏、咳嗽、流淚、畏光、結(jié)膜炎等，發(fā)熱2 d～3 d后，口腔頰黏膜粗糙，上有數(shù)量不等周圍可見紅暈的0.5 mm～1 mm灰白色小點(diǎn)，稱麻疹黏膜斑（Koplik’s spot，柯氏斑），上下唇黏膜也可見到，是早期診斷麻疹的標(biāo)志；出疹期多在發(fā)熱2 d～4 d后出現(xiàn)，持續(xù)3 d～5 d，自耳后、發(fā)際、 前額、面、頸部開始自上而下波及軀干和四肢手掌足底，疹間皮膚正常，皮疹初為淡紅色斑丘疹，以后部分融合成暗紅色，出疹時(shí)體溫達(dá)到高峰，全身癥狀加重；若無并發(fā)癥，皮疹出齊后體溫開始下降，進(jìn)入恢復(fù)期，皮疹依出疹順序逐漸隱退，色變暗，有色素沉著及糠皮樣脫屑，1周～2周消退，疹退同時(shí)體溫也下降到正常。

C.3.1.2 重型麻疹

持續(xù)高熱在40 ℃以上，皮疹融合成片，深紅色，可見出血性皮疹，病情重且病程長，常伴肺炎、喉炎或有驚厥、昏迷等腦炎表現(xiàn)。

C.3.1.3 輕型麻疹

臨床表現(xiàn)為發(fā)熱相對(duì)輕，多低于39 ℃，熱程短于7 d，輕度上呼吸道卡他癥狀，及少量皮疹，不留色素沉著或脫屑，口腔麻疹黏膜斑僅見1個(gè)～2個(gè)或無，全身狀況良好。無并發(fā)癥，病程約1周。多見于6 個(gè)月前嬰兒或4周內(nèi)經(jīng)過被動(dòng)免疫的患兒，偶見于接種麻疹疫苗后。機(jī)理為機(jī)體內(nèi)的抗體不能完全抵御麻疹病毒的侵襲，但仍有一定的抗病能力，因此病毒在體內(nèi)只能有限復(fù)制。

C.3.2 主要并發(fā)癥

C.3.2.1 肺炎

是麻疹最常見的并發(fā)癥，發(fā)生率約10%左右，多見于出疹期，也是引起死亡的主要原因。常見于5 歲以下、原有佝僂病和營養(yǎng)不良的小兒。由麻疹病毒引起的肺炎多不嚴(yán)重，但有免疫功能缺陷患者（如白血病、先天性無球蛋白血癥等）發(fā)生嚴(yán)重和致死性的巨細(xì)胞性肺炎，其臨床特征為缺乏皮疹和血清中不能形成麻疹病毒特異性抗體，其病理變化為間質(zhì)性肺炎。其他病原所致的繼發(fā)性肺炎多較為嚴(yán)重，常見的病原為腺病毒、肺炎球菌、葡萄球菌、流行性感冒嗜血桿菌等。

C.3.2.2 喉炎

發(fā)生率為1%～4%，可以是麻疹病毒本身感染所致，多見于2歲～3歲以下嬰幼兒，程度輕者預(yù)后較好，若繼發(fā)細(xì)菌感染則病情加重，常呈聲音嘶啞，犬吠樣咳嗽，容易氣道梗阻，吸氣性呼吸困難，胸部三凹征明顯，若不及時(shí)處理可窒息。

C.3.2.3 中耳炎

多見于嬰幼兒，是繼發(fā)細(xì)菌感染所致，與麻疹病毒無關(guān)。

C.3.2.4 腦炎

在免疫功能正常的患者，麻疹腦炎的發(fā)病率約為麻疹病人的1‰。多見于2歲以上兒童，病死率約為15%，病程1周～2周，腦脊液和血中可查到麻疹I(lǐng)gM抗體。30%的存活者有輕重不等的后遺癥。在細(xì)胞免疫功能缺陷的患者，可發(fā)生麻疹病毒包涵體腦炎，疾病呈急性或亞急性的過程。

C.3.3 鑒別診斷

麻疹與其他常見發(fā)熱出疹性疾病臨床鑒別診斷要點(diǎn)見下表B.1。

表B.1 麻疹與其他常見發(fā)熱出疹性疾病臨床鑒別診斷要點(diǎn)表

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R511.1

A

1007-8134(2017)04-000Ⅰ-09

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.04.001