何秋實(shí)，王志興，趙城彬

(1.青島酒店管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 青島 266100； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130118)

超聲輔助復(fù)合酶法制備核桃油工藝研究

何秋實(shí)1，王志興1，趙城彬2

(1.青島酒店管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 青島 266100； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130118)

以核桃仁為原料，采用超聲輔助復(fù)合酶(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶)破壁，然后進(jìn)行堿性蛋白酶酶解制備核桃油，對超聲輔助酶解工藝條件及復(fù)合酶配比進(jìn)行研究。結(jié)果表明：復(fù)合酶破壁的提油效果優(yōu)于單一酶；最佳酶解破壁條件為超聲功率90 W、復(fù)合酶添加量4%、酶解pH 4.5、酶解溫度50℃、酶解時間40 min；在最佳的復(fù)合酶破壁條件下，利用混料試驗(yàn)對復(fù)合酶配比進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳復(fù)合酶(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶)配比為1∶1.46∶1.11，此時總油提取率最大，為89.73%。

超聲波；復(fù)合酶；核桃油

核桃屬于胡桃科植物，又稱為羌桃或胡桃。核桃營養(yǎng)價值豐富，且風(fēng)味怡人，是一種深受消費(fèi)者喜愛的堅(jiān)果[1]。核桃富含油脂，其脂肪酸組成豐富，飽和脂肪酸占8%左右，包括棕櫚酸和硬脂酸；不飽和脂肪酸占90%以上，主要包括油酸、亞油酸和α-亞麻酸；此外，核桃油中還含有少量的肉豆蔻酸、十五烷酸、十六碳烯酸、十六碳二烯酸、花生酸和二十碳烯酸等[2]。核桃油富含人體所需的礦物質(zhì)、微量元素以及一定量的脂溶性維生素，如維生素A、維生素E等。

水酶法提油是在機(jī)械破碎的基礎(chǔ)上，利用生物酶手段降解植物細(xì)胞壁及油體蛋白，從而使油脂易于從油料中釋放出來[3]，其最大優(yōu)勢是提取油脂反應(yīng)條件溫和，提取油脂的同時可回收低變性的蛋白質(zhì)[4]，利于后續(xù)加工生產(chǎn)及利用。水酶法提油作為一種新興的綠色提油技術(shù)，已被成功應(yīng)用于花生、大豆、油茶籽和亞麻籽等油料中[5-7]。超聲輔助提取是一種新的提取分離技術(shù)，隨著研究領(lǐng)域的拓展該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于油脂提取。超聲波產(chǎn)生的空化、機(jī)械以及熱作用能夠破壞油料種子細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[8]，促進(jìn)油料中油脂的釋放。目前，對于超聲輔助復(fù)合酶法制備核桃油的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以核桃仁為原料，采用超聲輔助復(fù)合酶破壁，然后進(jìn)行堿性蛋白酶酶解制備核桃油，對超聲輔助酶解工藝條件以及復(fù)合酶配比進(jìn)行研究，為核桃油的實(shí)際生產(chǎn)以及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核桃：烏魯木齊西域名品商貿(mào)有限公司；果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、Protex-6L堿性蛋白酶：丹麥Novo公司；其他試劑均為分析純。

JY92-2D超聲探頭發(fā)生器：寧波新芝生物科技有限公司；恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；LDZ5-2型臺式低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；ZHWY112B型雙層恒溫振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超聲輔助復(fù)合酶法制備核桃油工藝

具體方法：將核桃仁脫皮、粉碎，以1∶5的料液比將核桃仁粉與水混合得到混合液，向混合液中添加一定配比的果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶，將混合液置于超聲處理器中進(jìn)行超聲輔助酶解破壁，然后添加Protex-6L堿性蛋白酶進(jìn)行酶解。堿性蛋白酶酶解條件為[9]：加酶量1.6%，酶解溫度60℃，酶解時間3 h，酶解pH 9.6。酶解后離心分離得到游離油、乳狀液、殘?jiān)?，將乳狀液破乳后離心分離得到游離油。

1.2.2 總油提取率和游離油得率的測定

總油提取率=(原料含油質(zhì)量-酶解后殘?jiān)唾|(zhì)量)/原料含油質(zhì)量×100%

游離油提取率=破乳前游離油質(zhì)量/原料含油質(zhì)量×100%

其中，含油質(zhì)量的測定參照Chabrand等[10]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類酶對提油效果的影響

選取果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶及其復(fù)合酶(3種酶復(fù)配比例1∶1∶1)進(jìn)行酶解，各種酶的加酶量均為2%，酶解溫度50℃，酶解時間30 min，果膠酶酶解pH為3.5，纖維素酶酶解pH為6，半纖維素酶酶解pH為4.5，復(fù)合酶酶解pH為5，考察不同種類酶對提油效果的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，采用單一酶進(jìn)行酶解時，纖維素酶對核桃仁的酶解效果優(yōu)于果膠酶和半纖維素酶，釋放出更多的油脂，導(dǎo)致較高的總油提取率和游離油提取率，這可能是由于核桃仁細(xì)胞壁的纖維素含量高于半纖維素和果膠質(zhì)。采用復(fù)合酶酶解后總油提取率和游離油提取率高于單一酶，這說明復(fù)合酶破壁的提油效果優(yōu)于單一酶。李楊等[11]采用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶以及其復(fù)合酶制備大豆油，發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶的作用效果優(yōu)于單一酶，這與本文中得到的結(jié)果相似。因此，本試驗(yàn)選擇復(fù)合酶對核桃仁進(jìn)行酶解破壁處理。

圖1 不同種類酶對總油提取率和游離油提取率的影響

2.2 超聲輔助復(fù)合酶破壁工藝條件分析

2.2.1 超聲功率對總油提取率的影響

采用4%的復(fù)合酶(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶配比為1∶1∶1)進(jìn)行酶解破壁，酶解pH 5，酶解溫度50℃，酶解時間30 min，以總油提取率為指標(biāo)，選取超聲功率分別為50、70、90、110、130 W，考察超聲功率對總油提取率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，隨著超聲功率的增大，總油提取率先增加后降低，當(dāng)超聲功率為90 W時，提油效果最好。超聲的空化和機(jī)械作用使物料細(xì)胞破碎，同時超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)加快分子運(yùn)動，提高酶與底物碰撞概率，促進(jìn)酶解反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，釋放出油脂；當(dāng)超聲功率過大時，過高的溫度會使酶分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致酶變性失活，從而影響提油效果[12]。因此，選擇超聲功率為90 W。

圖2 超聲功率對總油提取率的影響

2.2.2 酶解pH對總油提取率的影響

采用4%的復(fù)合酶(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶配比為1∶1∶1)進(jìn)行酶解破壁，超聲功率90 W，酶解溫度50℃，酶解時間30 min，以總油提取率為指標(biāo)，選取酶解pH分別為4、4.5、5、5.5、6，考察酶解pH對總油提取率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，隨著酶解pH的增加，總油提取率先增加后降低，當(dāng)酶解pH為4.5時，提油效果最好。復(fù)合酶由果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶組成，每種酶具有最適的pH范圍，過酸或過堿的環(huán)境會破壞酶分子的空間結(jié)構(gòu)，酶變性失活，酶解能力降低[13]，不能夠充分破壞細(xì)胞壁，影響油脂釋放。因此，選擇酶解pH為4.5。

圖3 酶解pH對總油提取率的影響

2.2.3 酶解溫度對總油提取率的影響

采用4%的復(fù)合酶(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶配比為1∶1∶1)進(jìn)行酶解破壁，超聲功率90 W，酶解pH 5，酶解時間30 min，以總油提取率為指標(biāo)，選取酶解溫度分別為40、45、50、55、60℃，考察酶解溫度對總油提取率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，隨著酶解溫度的升高，總油提取率先增加后降低，酶解溫度為50℃時提油效果最好。與酶解pH相似，每種酶都具有最適的溫度范圍，當(dāng)超過這個范圍，酶分子結(jié)構(gòu)中的活性中心構(gòu)象發(fā)生改變，阻礙酶與底物的有效結(jié)合，使酶作用效果下降[14]，不利于油脂的提取。因此，選擇酶解溫度為50℃。

圖4 酶解溫度對總油提取率的影響

2.2.4 酶解時間對總油提取率的影響

采用4%的復(fù)合酶(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶配比為1∶1∶1)進(jìn)行酶解破壁，超聲功率90 W，酶解pH 5，酶解溫度50℃，以總油提取率為指標(biāo)，選取酶解時間分別為10、20、30、40、50 min，考察酶解時間對總油提取率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，隨著酶解時間的延長，總油提取率逐漸增加，直到酶解時間為40 min時達(dá)到最大，超過40 min后總油提取率出現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于酶解pH為酸性，在酸性條件下長時間反應(yīng)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性聚集[15]，不利于此后蛋白酶對蛋白質(zhì)的酶解，阻礙油脂的分離。因此，選擇酶解時間為40 min。

圖5 酶解時間對總油提取率的影響

2.3 復(fù)合酶復(fù)配比例優(yōu)化分析

在超聲功率90 W、復(fù)合酶添加量4%、酶解pH 4.5、酶解溫度50℃、酶解時間40 min條件下，選取果膠酶添加量A、纖維素酶添加量B、半纖維素酶添加量C3個因素為自變量，以總油提取率R為響應(yīng)值，根據(jù)混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert軟件進(jìn)行過程優(yōu)化，其因素水平編碼見表1，混料試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表1 混料試驗(yàn)因素水平編碼

表2 混料試驗(yàn)安排及結(jié)果

續(xù)表2

試驗(yàn)號ABCR/%1110060．871201056．961300152．57140．50．5081．52

通過統(tǒng)計(jì)軟件Design-expert對總油提取率R進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次回歸模型：R=61.30A+56.49B+51.15C+95.43AB+70.59AC+125.53BC。

采用Design-expert軟件對模型方程進(jìn)行方差分析，回歸與方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸與方差分析結(jié)果

由表3可知，該模型回歸極顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，并且R2=99.13%，說明該模型與試驗(yàn)擬合良好，能夠很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用該模型進(jìn)行試驗(yàn)分析是可行的。模型的一次項(xiàng)A、B、C和交互項(xiàng)AB、AC、BC均達(dá)到極顯著水平，說明響應(yīng)值與自變量之間不是簡單的線性關(guān)系。在最佳的超聲輔助酶解破壁條件下，即超聲功率90 W，復(fù)合酶添加量4%，酶解pH 4.5，酶解溫度50℃，酶解時間40 min，根據(jù)混料試驗(yàn)尋優(yōu)結(jié)果可知，果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶3種酶的添加量分別為1.12%、1.64%和1.24%，即3種酶的復(fù)配比例為1∶1.46∶1.11，在此條件下，總油提取率有最大值，為89.22%。通過3次驗(yàn)證試驗(yàn)得到總油提取率平均值為89.73%，與預(yù)測值89.22%較接近，說明響應(yīng)面的試驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值吻合良好。

3 結(jié) 論

本文采用超聲輔助復(fù)合酶法制備核桃油，比較了果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶及其復(fù)合酶破壁的提油效果，結(jié)果表明復(fù)合酶破壁的提油效果優(yōu)于單一酶。最佳酶解破壁條件為超聲功率90 W、復(fù)合酶添加量4%、酶解pH 4.5、酶解溫度50℃、酶解時間40 min。在最佳的復(fù)合酶破壁條件下，利用混料試驗(yàn)對復(fù)合酶(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶)配比進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳復(fù)合酶配比為1∶1.46∶1.11。在最優(yōu)工藝條件下，總油提取率最大，為89.73%。

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Preparationofwalnutoilbyultrasound-assistedcomplexenzymesmethod

HE Qiushi1, WANG Zhixing1, ZHAO Chengbin2

(1.Qingdao Vocational and Technical College of Hotel Management, Qingdao 266100,Shandong, China;2.College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Using walnut kernel as raw material, wall-breaking treatment was carried out by ultrasound-assisted complex enzymes (pectase, cellulase, hemicellulase) method, and walnut oil was prepared by enzymolysis of alkaline protease. The process conditions of ultrasound-assisted enzymolysis and the ratio of complex enzymes were studied. The results showed that the oil extraction effect of complex enzymes was better than that of single enzyme. The optimal enzymolysis wall-breaking conditions were obtained as follows: ultrasonic power 90 W, dosage of composite enzymes 4%, enzymolysis pH 4.5, enzymolysis temperature 50℃ and enzymolysis time 40 min. Under these conditions, the ratio of complex enzymes was optimized by mixture experiment and the optimal ratio of complex enzymes(pectase, cellulase, hemicellulase) was determined as 1∶1.46∶1.11. Under these conditions, the total extraction rate of oil was the highest, which was 89.73%.

ultrasound; complex enzymes; walnut oil

2016-10-31；

：2017-04-17

何秋實(shí)(1979)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)(E-mail)154201866@qq.com。

TS224；TQ644

：A

1003-7969(2017)08-0013-04

油脂加工