張 靜, 陶寧萍, 朱清澄, 花傳祥

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，國家海洋漁業(yè)工程研究中心，海洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306)

秋刀魚內(nèi)臟磷脂的化學(xué)特性研究

張 靜1, 陶寧萍1, 朱清澄2, 花傳祥2

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，國家海洋漁業(yè)工程研究中心，海洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306)

采用超臨界二氧化碳(SC-CO2)與有機(jī)溶劑提取兩種方法對秋刀魚內(nèi)臟中的磷脂進(jìn)行提取，研究了兩種方法提取的磷脂及SC-CO2提取所得磷脂中的磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)的脂肪酸組成及含量，并對SC-CO2提取磷脂的酸值、過氧化值等理化指標(biāo)進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明：SC-CO2法的提取率(23.90±1.10)%(干重)高于有機(jī)溶劑法的提取率(20.81±1.25)%(干重)，但兩者無顯著差異(P>0.05)；SC-CO2法所得磷脂的脂肪酸總量高于有機(jī)溶劑法的，其中二十碳五烯酸(EPA)的含量分別為8.80%和8.95%，二十二碳六烯酸(DHA)的含量分別為43.20%和43.82%；PC、PE的脂肪酸組成之間無顯著差異(P>0.05)；磷脂酸值(KOH)為(21.52±0.57)mg/g，過氧化值為(2.06±0.12)mmol/kg，均符合JECFA標(biāo)準(zhǔn)Lecithin (Phosphalipides, Phospholipids; INS No.322 (ⅰ))的規(guī)定。

秋刀魚內(nèi)臟；磷脂；超臨界二氧化碳；脂肪酸

秋刀魚(CololabisSaira)是一種冷水性海洋生物，廣泛分布于西北太平洋及其沿海海域, 是日本、俄羅斯、韓國、中國等國家重要的捕撈品種之一[1-2]。魚類產(chǎn)品加工的過程中，通常會產(chǎn)生大量的魚頭、魚骨、魚皮、內(nèi)臟等下腳料，總質(zhì)量占魚體重的40%～50%，這些下腳料含有豐富的鈣、蛋白質(zhì)資源以及油脂資源等[3-4]。本研究中，秋刀魚內(nèi)臟占魚體重的(10±0.98)%，經(jīng)前期工作發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)臟中含有(25.14±2.01)%的粗脂肪，并且磷脂含量高達(dá)(7.58±1.33)%。海洋動物磷脂含有EPA 和DHA等豐富的不飽和脂肪酸，具有預(yù)防心腦血管疾病，延緩大腦的衰老和抑制腫瘤細(xì)胞生長等功能，有利于高血脂、脂肪肝等疾病的治療和人體正常的發(fā)育。作為一種混合物，海洋磷脂中主要含有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PI)等組分[5-7]。

本研究以秋刀魚內(nèi)臟為原料，分別利用超臨界二氧化碳提取法(SC-CO2)和有機(jī)溶劑法對其中的磷脂進(jìn)行提取，利用氣相色譜定性定量分析兩種提取方法所得磷脂中的脂肪酸成分，對結(jié)果進(jìn)行比較；利用硅膠柱層析分離SC-CO2法所得磷脂中的PC及PE，利用氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)一步分析PC以及PE中的脂肪酸成分；并對SC-CO2法提取的磷脂進(jìn)行理化指標(biāo)分析，對照Lecithin (Phosphalipides, Phospholipids; INS No.322 (ⅰ))標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行品質(zhì)評價，以期為后續(xù)進(jìn)一步研究海洋磷脂的功能特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

秋刀魚30尾，體重(107.63±11.31)g，體長(27.38±1.12)cm，均為西北太平洋捕撈，原料冷凍魚經(jīng)解凍，取內(nèi)臟剁碎，30 g每包分裝，然后凍藏貯存在-20℃條件下。

食品級CO2(純度大于99.99%)、N2購自上海利旦氣體，37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、十九烷酸甲酯及C19∶0標(biāo)準(zhǔn)品購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司,正己烷分別選用色譜純和分析純，乙醇、氫氧化鈉、二氯甲烷等均為分析純，默克硅膠粉末。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Speed SFE-2超臨界提取儀，美國Applied Separations公司；R250B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DZKW-4電子恒溫水浴鍋；TDL-40B型低速離心機(jī)；TRACE GC ULTRA氣相色譜儀，美國Thermo Fisher公司；Agilent 6890N-5975C氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷脂提取

1.2.1.1 有機(jī)溶劑法提取

將分裝的內(nèi)臟置于真空冷凍干燥機(jī)48 h，除去其中的水分，得到粉末狀干燥樣品。按料液比1∶8加入正己烷在40℃條件下放置4 h，進(jìn)行中性脂脫除，2 000 r/min離心15 min，收集殘?jiān)?。按料液?∶10 在殘?jiān)屑尤霟o水乙醇在40℃條件下放置3 h提取磷脂，重復(fù)此步驟2次，收集所得乙醇提取物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉乙醇溶劑，所得產(chǎn)物為磷脂粗提取物。將所得磷脂粗提取物溶于正己烷，加入3倍體積丙酮，并在4℃條件下緩慢攪拌，置于-20℃冰箱15 min，然后2 000 r/min離心15 min，棄上清液，所得即為秋刀魚內(nèi)臟磷脂。

1.2.1.2 SC-CO2法提取

稱取10 g左右經(jīng)冷凍干燥處理的樣品填入50 mL提取釜內(nèi)，檢查設(shè)備的氣密性，設(shè)定提取溫度、出口閥溫度為55℃，打開CO2、N2貯氣罐閥門，設(shè)定提取壓力45 MPa，打開出口閥，進(jìn)行中性脂脫除，4 h后中性脂脫除完畢，將提取溫度、出口閥溫度設(shè)定為50℃，打開夾帶劑系統(tǒng)，設(shè)置無水乙醇流速為2 mL/min，同時調(diào)節(jié)N2壓力穩(wěn)定在45 MPa，動態(tài)提取3 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉乙醇溶劑，所得殘?jiān)礊榍锏遏~內(nèi)臟磷脂。

1.2.1.3 硅膠柱層析分離PC和PE[8]

取12 g硅膠粉末放入玻璃柱中進(jìn)行裝柱，用正己烷-二氯甲烷溶液(體積比2∶3)對柱子進(jìn)行活化。取0.3 g上述SC-CO2提取所得的磷脂放入活化好的硅膠柱中，分別用二氯甲烷-甲醇溶液(體積比1∶1)洗脫P(yáng)E，用二氯甲烷-甲醇溶液(體積比1∶20)洗脫P(yáng)C。收集洗脫液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉其中的有機(jī)溶劑，得PC和PE。

1.2.2 脂肪酸組成及含量分析

利用37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品保留時間對照法定性，內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3)的形式表示。

1.2.2.1 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)溶液配制

在25 mg 37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品中添加1 mg十九烷酸甲酯及2.6 mL正己烷混勻，配制成10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。稱取50 mg C19∶0標(biāo)準(zhǔn)品于5 mL容量瓶，加入正己烷至刻度處，混勻，制成10 mg/mL內(nèi)標(biāo)儲備液。

1.2.2.2 甲酯化

分別取0.1 g上述步驟所得樣品于平底燒瓶內(nèi)，加入5 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液和100 μL 10 mg/mL內(nèi)標(biāo)儲備液，接入冷凝回流裝置，通入冷凝水，100℃水浴中煮沸冷凝回流10 min左右，每隔30～60 s搖晃1次燒瓶，直至燒瓶內(nèi)油滴消失；加入3 mL三氟化硼甲醇溶液，100℃煮沸冷凝回流3 min；再加入2 mL色譜級正己烷，100℃煮沸冷凝回流2 min；然后將燒瓶從水浴中取出，待冷凝管中無液滴滴下時取下冷凝回流裝置，加入10 mL飽和NaCl溶液，充分振搖，取上清液，過0.20 μm有機(jī)相濾膜保存在氣相進(jìn)樣瓶中。

1.2.2.3 氣相色譜條件

色譜柱為Agilent SP-2560毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；檢測器為FID；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0℃，以50℃/min升至140℃，保持1 min，4℃/min升至180℃，保持1 min，3℃/min升至225℃，保持30 min；汽化室溫度250℃；載氣N2；柱流速1 mL/min；分流比45∶1；進(jìn)樣量1 μL。

1.2.2.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：HP-88毛細(xì)管色譜柱(60 m×250 μm×0.2 μm)；進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0℃，以10℃/min升至210℃，然后以5℃/min升至220℃，再以5℃/min升至235℃，保持9 min；載氣為高純氦氣。

質(zhì)譜條件：EI離子源；電子能量70 eV；離子源溫度200℃；進(jìn)樣量1 μL；溶劑延遲時間11 min。

1.2.3 理化指標(biāo)的測定

酸值參照AOAC 969.17進(jìn)行測定，過氧化值參照AOAC 965.33進(jìn)行測定，碘值參照AOAC 993.20進(jìn)行測定，不皂化物參照AOAC 975.13進(jìn)行測定[9]。游離脂肪酸參照Berrdez等[10]的方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 SC-CO2法和有機(jī)溶劑法提取磷脂的脂肪酸組成分析

利用SC-CO2法和有機(jī)溶劑法提取磷脂，提取率分別達(dá)(23.90±1.10)%(干重)和(20.81±1.25)%(干重)，SC-CO2法較有機(jī)溶劑法提取率高，但兩者并無顯著性差異(P>0.05)。對兩種提取方法得到的磷脂進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，兩種提取方法所得磷脂脂肪酸種類一致，都為13種脂肪酸，SC-CO2法所得脂肪酸總量較有機(jī)溶劑提取法的高。兩種提取方法所得磷脂脂肪酸中SFA、MUFA和PUFA分別為5種、4種和4種，分別占脂肪酸總量的39.51%和38.05%、6.88%和7.57%、53.61%和54.37%。SC-CO2法所得磷脂中EPA占脂肪酸總量的8.80%，DHA占脂肪酸總量的43.20%，有機(jī)溶劑提取法所得磷脂中EPA占脂肪酸總量的8.95%，DHA占脂肪酸總量的43.82%。將兩種結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析比較，結(jié)果顯示無顯著性差異(P>0.05)。推測其原因在于兩種方法本質(zhì)上都是利用無水乙醇作為提取劑，提取所得產(chǎn)物性質(zhì)較為相似。但由于SC-CO2法提取率較有機(jī)溶劑提取法的高，并且提取時間大幅縮短，所得產(chǎn)物脂肪酸總量較高，之后的研究都選用了SC-CO2提取法所得磷脂。

表1 兩種方法提取得到秋刀魚內(nèi)臟磷脂脂肪酸組成及含量 mg/g

注：SFA為飽和脂肪酸；MUFA為單不飽和脂肪酸；PUFA為多不飽和脂肪酸；Tr.為痕量。下同。

2.2 磷脂中PC和PE組分脂肪酸組成分析

研究室前期的檢測結(jié)果表明，秋刀魚內(nèi)臟磷脂中PC、PE的總量占PC、PE、PI、PS、LPC、LPE幾種磷脂組分的64.33%，為秋刀魚內(nèi)臟磷脂的重要組成部分。因此，為研究PC、PE對總磷脂脂肪酸的貢獻(xiàn)與影響情況，本研究中對PC、PE兩種組分進(jìn)行分離并鑒定其脂肪酸組成。表2中列出SC-CO2法提取的秋刀魚內(nèi)臟磷脂再經(jīng)柱層析分離得PC、PE的脂肪酸組成分析結(jié)果。

表2 秋刀魚內(nèi)臟磷脂中PC、PE脂肪酸組成及含量 mg/g

注：N.D.為未檢出。下同。

從表2可以看出，C16∶0是PC、PE主要的飽和脂肪酸，C20∶1和C22∶1是PC、PE主要的單不飽和脂肪酸，這與研究室之前研究結(jié)果秋刀魚內(nèi)臟甘油三酯中的脂肪酸組成類似。

PC、PE中DHA和EPA的含量分別占總脂肪酸含量的8.88%和2.89%、7.12%和3.11%，兩者脂肪酸組成較為相近，無顯著性差異(P>0.05)。樓喬明等[14]通過硅膠柱層析分離得到皺紋盤鮑內(nèi)臟磷脂中的PC、PE組分，研究其脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)從PC、PE中分別檢測出0.18%(PC)的DHA以及10.43%和6.53%的EPA。Uddin等[15]從魷魚內(nèi)臟中提取磷脂并通過薄層層析分離得到其中的PC，PE，對其脂肪酸進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)從PC、PE中分別檢測到22.70%和17.60%的DHA以及13.10%和16.40%的EPA。經(jīng)比較可以看出，秋刀魚內(nèi)臟磷脂中的PC、PE組分可以作為良好的DHA和EPA來源。

2.3 磷脂理化指標(biāo)分析

本研究對于磷脂的理化指標(biāo)主要檢測了酸值、過氧化值、碘值、不皂化物含量和游離脂肪酸，結(jié)果如表3所示。

表3 秋刀魚內(nèi)臟磷脂理化指標(biāo)

注：“-”表示標(biāo)準(zhǔn)中無該項(xiàng)。

從表3可以看出，利用SC-CO2法提取的秋刀魚內(nèi)臟磷脂的游離脂肪酸含量低，不皂化物未檢出，酸值和過氧化值檢測結(jié)果均符合JECFA標(biāo)準(zhǔn)Lecithin (Phosphalipides, Phospholipids; INS No.322 (ⅰ))的規(guī)定。

3 結(jié) 論

秋刀魚內(nèi)臟所含脂質(zhì)成分豐富，其中磷脂含量較高。通過對SC-CO2法和有機(jī)溶劑法提取所得磷脂的分析比較，SC-CO2法的提取率及脂肪酸總量較有機(jī)溶劑法的高，提取時間短；秋刀魚內(nèi)臟磷脂中脂肪酸種類豐富，其中EPA和DHA含量較高，尤其是DHA含量占總脂肪酸的40%以上，可以視為良好的DHA及EPA來源；將SC-CO2法得到磷脂中的PC和PE兩種組分分離并進(jìn)一步進(jìn)行脂肪酸組成分析，兩者無顯著差異，最主要的脂肪酸都為單不飽和脂肪酸，且DHA和EPA含量豐富；SC-CO2法所得磷脂的酸值、過氧化值均符合JECFA標(biāo)準(zhǔn)Lecithin (Phosphalipides, Phospholipids; INS No.322 (ⅰ))的規(guī)定，品質(zhì)良好。

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ChemicalcharacterizationofPacificsaury(CololabisSaira)visceralecithin

ZHANG Jing1, TAO Ningping1, ZHU Qingcheng2, HUA Chuanxiang2

(1.College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2.Key Laboratory of Sustainable Exploitation of Oceanic Fisheries Resources, Ministry of Education,National Engineering Research Centre for Oceanic Fisheries, College of Marine Sciences,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The lecithin in Pacific saury (CololabisSaira) viscera was extracted by supercritical carbon dioxide (SC-CO2) and organic solvent method. Fatty acid compositions and contents of lecithin extracted by the two methods and its phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) in lecithin extracted by SC-CO2were determined. Meanwhile, the acid value and peroxide value of Pacific saury viscera lecithin extracted by SC-CO2were detected. The results showed that the extraction rate of Pacific saury viscera lecithin of SC-CO2((23.90±1.10)%, dry basis) was higher than that of organic solvent method ((20.81±1.25)%, dry basis), but they had no significant difference(P>0.05). The total fatty acid content of lecithin obtained by SC-CO2was higher than that of lecithin obtained by organic solvent method. EPA contents in lecithin obtained by SC-CO2and organic solvent method were 8.80% and 8.95%, respectively. DHA contents in lecithin obtained by SC-CO2and organic solvent method were 43.20% and 43.82%, respectively. The fatty acid compositions of PC and PE had no significant difference(P>0.05). The acid value and peroxide value of Pacific saury viscera lecithin were (21.52±0.57)mgKOH/g and (2.06±0.12)mmol/kg, respectively, which met the standard of JECFA Lecithin (Phos-phalipides, Phospholipids; INS No.322 (ⅰ)).

Pacific saury viscera; lecithin; SC-CO2; fatty acid

2016-10-12；

：2017-03-16

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)(2016YFD0400202-8)；江蘇省國家長江珍稀魚類工程技術(shù)研究中心培育點(diǎn)項(xiàng)目(BM2013012)

張 靜(1990)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與品質(zhì)評價(E-mail)1185686189@qq.com。

TS254.9;TS225.4

：A

1003-7969(2017)08-0028-05

油脂化學(xué)