陳 卓，石 蕊，譚李玉，張宇佳

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021； 2. 陜西省人民醫(yī)院，西安 710068)

綜合利用

DHA-絲裂霉素C偶聯(lián)前藥的制備及角膜透過性研究

陳 卓1，石 蕊2，譚李玉1，張宇佳1

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021； 2. 陜西省人民醫(yī)院，西安 710068)

為了降低絲裂霉素C(MMC)在治療翼狀胬肉時(shí)經(jīng)角膜吸收所導(dǎo)致的副作用，將其與DHA偶聯(lián)為前藥DHA-MMC。經(jīng)離體角膜透過性實(shí)驗(yàn)及體外釋放實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：增大的相對(duì)分子質(zhì)量可阻斷MMC的角膜吸收，以避免其眼內(nèi)副作用；MMC可以前藥(DHA-MMC)形式積聚在眼表后逐漸釋放MMC以產(chǎn)生活性。

DHA；前藥；DHA-MMC；翼狀胬肉

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是一種存在于核桃油、橄欖油、玉米油、芥花油、葵花籽油等油脂中的多烯類脂肪酸[1]，其不僅可以作為營養(yǎng)物質(zhì)，在藥物化學(xué)領(lǐng)域還常常被用于制備前藥。當(dāng)PUFAs用于前藥時(shí)具有以下3個(gè)特點(diǎn)：①PUFAs本身就是人體所需的營養(yǎng)成分之一,可以較大劑量攝入，具有較好的代謝活性以及無毒性、無免疫原性[2]；②二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)等PUFAs具有腫瘤抑制活性[3]；③PUFAs具有腫瘤靶向性[4]。因此，PUFAs是一種理想的腫瘤靶向載體，可以與抗腫瘤藥物通過化學(xué)法制備為前藥。

眼表長期受到外界刺激，如高紫外線、高風(fēng)沙、霧霾等，易在瞼裂部球結(jié)膜引起纖維血管組織贅生性病變，因其酷似昆蟲的翅膀而得名翼狀胬肉。翼狀胬肉是西北地區(qū)最常見的眼表疾病之一。翼狀胬肉嚴(yán)重危害人們的視力健康，其生長浸潤角膜會(huì)導(dǎo)致散光、炎癥、甚至失明。翼狀胬肉組織具有很強(qiáng)的腫瘤樣特征，目前臨床上多采用手術(shù)切除法，且必須在術(shù)中、術(shù)后聯(lián)用絲裂霉素C(MMC)等高毒性抗代謝藥物，否則單純術(shù)后會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)復(fù)發(fā)，其新生成組織由于手術(shù)刺激生長更快，波及更廣，必須使用抗腫瘤藥物殺滅、抑制手術(shù)切除后眼表殘存的成纖維細(xì)胞[5]。但是，術(shù)中、術(shù)后在眼表長期施用的MMC會(huì)通過角膜吸收進(jìn)入眼球，導(dǎo)致眼內(nèi)組織如晶狀體、玻璃體及視網(wǎng)膜等受損[5]。這種現(xiàn)象即MMC在翼狀胬肉治療中的主要副作用：在眼表靶點(diǎn)外通過角膜吸收導(dǎo)致的眼內(nèi)副作用。

角膜是介于眼表與眼內(nèi)的保護(hù)屏障，進(jìn)入眼內(nèi)的藥物必須通過角膜吸收。角膜上皮細(xì)胞層厚約 50 μm，其細(xì)胞間以橋小體相接，構(gòu)成致密的質(zhì)膜，使相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)到500以上的化合物難以通過角膜吸收[6]。本研究將MMC與DHA這一無毒、無免疫原性較大分子化合物通過化學(xué)合成的方法制備為較大分子前藥DHA-MMC，從而使藥物的相對(duì)分子質(zhì)量由單獨(dú)MMC時(shí)的334提高至649，從而難以透過角膜形成眼內(nèi)吸收，降低了眼內(nèi)副作用，并在蓄積于結(jié)膜及翼狀胬肉組織后逐漸水解釋放MMC起效。同時(shí)，利用PUFAs的腫瘤抑制性和靶向性增強(qiáng)DHA-MMC的翼狀胬肉組織選擇性及抑制性。本文研究了所獲得的較大分子前藥DHA-MMC的角膜透過性及體外釋放性，驗(yàn)證了課題設(shè)計(jì)，有望獲得一種新穎的翼狀胬肉治療藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

絲裂霉素C為化學(xué)純(Sigma-Aldrich)；DHA(Sigma-Aldrich)；N-甲基嗎啉為分析純(上海阿拉丁生化科技)；1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亞胺鹽酸鹽(EDC-HCl)為分析純(上海源葉生物科技)；N-羥基丁二酰亞胺為分析純(上海源葉生物科技)；雙蒸水;柱層析所使用薄層硅膠為硅膠H(青島海洋化工)；家兔(購于市場(chǎng))；其他常見有機(jī)溶劑、試劑均為分析純，必要時(shí)干燥。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

FD-1000型冷凍干燥機(jī)(日本東京理化株式會(huì)社)；1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫)；UV-1780 型紫外分光光度計(jì)(日本島津)；PSL-1810型磁力攪拌低溫槽(日本東京理化株式會(huì)社)；RYJ-6B型FRANZ擴(kuò)散池(上海黃海藥檢儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DHA-MMC的制備機(jī)理(見圖1)

DHA-MMC是通過將DHA的羧基與MMC上的伯氨基以酰胺鍵的方式連接。采用了1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亞胺鹽酸鹽(EDC-HCl)作為縮合劑，先將DHA與N-羥基丁二酰亞胺(NHS)縮合為反應(yīng)性質(zhì)極為活潑的DHA活性酯(DHA-NHS)后，再使其與MMC縮合成酰胺鍵。

圖1 DHA-MMC的制備

1.2.1.1 DHA-NHS的制備

向25 mL圓底瓶中加入DHA 329 mg(1 mmol)，NHS 173 mg(1.5 mmol)，EDC-HCl 574 mg(3 mmol)及2 mL N-甲基嗎啉，加入二氧六環(huán)15 mL溶解后，在N2保護(hù)下20℃反應(yīng)24 h，減壓蒸去溶劑，剩余物用氯仿溶解，2 mol/L鹽酸30 mL洗滌，氯仿層干燥后蒸干，得黃色油狀物171 mg，即DHA-NHS，得率40.2%。DHA-NHS在N2保護(hù)下保存。

1.2.1.2 DHA-MMC的制備

向25 mL圓底瓶中加入DHA-NHS 106.3 mg(0.25 mmol)，0.03 mol/L HBS緩沖液(pH 7.4)10 mL，攪拌下加入MMC 83.5 mg(0.25 mmol)，期間監(jiān)測(cè)pH并按需加入0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液維持pH 7.4；然后攪拌12 h后將其濃縮至干，剩余物使用硅膠柱色譜分離(洗脫液為環(huán)己烷-乙酸乙酯(體積比100∶1))得黃白色產(chǎn)物143.1 mg，即DHA-MMC，得率75.1%。

1.2.2 DHA-MMC的體外釋放研究

1.2.2.1 人工淚液STF的配制

取NaCl 6.78 g，KCl 1.38 g，NaHCO32.18 g加入1 L容量瓶中，并加入約500 mL雙蒸水溶解，取CaCl20.084 g溶解于約200 mL雙蒸水后攪拌下加入上述容量瓶中，定容即得。

1.2.2.2 MMC及DHA-MMC含量的測(cè)定

參考楊西曉等[7]的方法，采用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件為：C18色譜柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)，乙腈-磷酸緩沖液(體積比15∶85)，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫37℃，測(cè)定波長為365 nm。DHA-MMC、MMC對(duì)照品配制方法為：精密稱取DHA-MMC、MMC各25 mg，分別置于50 mL容量瓶中，加人工淚液稀釋至刻度后，即得0.5 mg/mL 對(duì)照品溶液。

1.2.2.3 DHA-MMC的體外釋放性的測(cè)定

以人工淚液10 mL為溶出介質(zhì)，向其中加入DHA-MMC 50 mg，控制其溫度為(37±1)℃，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速約為60 r/min。每隔1 h取釋放液0.3 mL并補(bǔ)加人工淚液0.3 mL，釋放液經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾后直接用HPLC測(cè)定，使用外標(biāo)法計(jì)算釋放出的MMC的質(zhì)量濃度。

1.2.3 DHA-MMC的離體角膜透過性研究

將家兔耳緣靜脈注射空氣致死。在死后立即取出眼球，剪下前節(jié)，小心分離出角膜，并除去鞏膜、虹膜、睫狀體等多余組織，期間嚴(yán)格避免劃傷角膜組織。將新鮮離體角膜分別小心固定在兩套FRNAZ擴(kuò)散池的供給池和接收池之間，使上皮層面向供給池，在接收池中加入新鮮配制的人工淚液4.5 mL，在供給池中加入6.5 mg/mL(1 μmol/mL)的DHA-MMC人工淚液溶液。溫度控制在(37±1)℃，轉(zhuǎn)速控制在(200±25)r/min。待8 h后在接收池中取樣4.5 mL。樣液經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾后，用1.2.2.2 的方法測(cè)定DHA-MMC的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 DHA-MMC的體外釋放研究結(jié)果

DHA-MMC在人工淚液中的體外釋放性采用了1.2.2的方法進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見表1。如表1所示，DHA-MMC在人工淚液中呈零級(jí)緩慢釋放，這說明將MMC制備成DHA化的前藥(DHA-MMC)可以有效控制藥物的釋放，達(dá)到緩釋的目的。

表1 DHA-MMC的體外釋放

2.2 DHA-MMC的離體角膜透過性研究結(jié)果

翼狀胬肉病發(fā)于眼表，MMC的副作用由角膜吸收入眼導(dǎo)致。通過1.2.3方法考察了DHA-MMC的離體角膜透過性。經(jīng)純品DHA-MMC進(jìn)樣比較，發(fā)現(xiàn)HPLC檢測(cè)限上未檢出經(jīng)角膜透出的 DHA-MMC。表明增大相對(duì)分子質(zhì)量可阻斷MMC的角膜吸收，以避免其眼內(nèi)副作用。

2.3 DHA-MMC的制備方法的選擇

DHA-MMC是通過將DHA的羧基與MMC上的伯氨基以酰胺鍵的方式連接。但是，由于DHA上的羧基的反應(yīng)活性較低，無法直接與MMC上的伯氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，我們比較了酰氯法、直接縮合法后，選擇采用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亞胺鹽酸鹽作為縮合劑，先將DHA與 N-羥基丁二酰亞胺縮合為反應(yīng)性質(zhì)極為活潑的DHA活性酯(DHA-NHS)后，再使其與MMC縮合成酰胺鍵。

該法相比酰氯法及直接縮合法的優(yōu)勢(shì)在于，DHA活性酯的反應(yīng)活性遠(yuǎn)大于酰氯法擬使用的DHA酰氯及直接縮合法使用的DHA本身。因此，雖然此法第一步制備活性酯的得率較低(40.2%)，但基于DHA-MMC的得率相對(duì)其他方法較高，使我們最終選擇了活性酯法制備DHA-MMC。

2.4 DHA-NHS的制備條件優(yōu)化

DHA-NHS是制備DHA衍生物的關(guān)鍵中間體，對(duì)DHA在醫(yī)藥領(lǐng)域的深入研究有著重要的價(jià)值。然而，DHA-NHS的化學(xué)性質(zhì)活潑，本身極不穩(wěn)定，對(duì)制備方法進(jìn)行考察有一定的研究意義。在DHA-NHS的制備過程中，所生成的產(chǎn)物有可能隨反應(yīng)時(shí)間的延長及反應(yīng)溫度的升高發(fā)生分解。因此，以產(chǎn)物得率為指標(biāo)，對(duì)反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度進(jìn)行了考察，結(jié)果見表2。如表2所示，較好反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度20℃，反應(yīng)時(shí)間24 h。

表2 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)DHA-NHS得率的影響

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)并通過兩步反應(yīng)合成了前藥DHA-MMC，通過離體角膜透過性研究表明其角膜吸收已被阻斷。通過體外釋放研究表明MMC可以前藥(DHA-MMC)形式積聚在眼表后逐漸釋放MMC以產(chǎn)生活性，從而獲得了一種減少M(fèi)MC在翼狀胬肉治療中經(jīng)角膜吸收導(dǎo)致的眼內(nèi)副作用，具更大治療窗的絲裂霉素C前藥。

[1] 王萍,張銀波,江木蘭. 多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展[J]. 中國油脂,2008,33(12)：42-46.

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PreparationofDHA-mitomycinCprodruganditspermeabilityoncorneal

CHEN Zhuo1, SHI Rui2, TAN Liyu1, ZHANG Yujia1

(1. College of Pharmacy, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, China； 2. Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068, China)

In order to reduce the side effects of mitomycin C(MMC) by corneal absorption in the treatment of pterygium,the prodrug DHA-MMC was preparaed by chemical coupling with DHA and MMC. The results of the corneal permeability experiment and in vitro release experiment showed that increased relative molecular weight could block MMC’s corneal absorption, so as to avoid its ocular side effects. The prodrug DHA-MMC could amass in ocular surface and then release the MMC to generate activity.

DHA; prodrug; DHA-MMC; pterygium

2017-01-20；

：2017-04-12

陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(15JK1620)

陳 卓(1985)，男，講師，碩士，主要從事藥物化學(xué)研究工作(E-mail)352304625@qq.com。

R77; R917

：A

1003-7969(2017)08-0108-04