樊翠平段玉寶田秀華白素英

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明，650224)

基于COI基因?qū)祓B(yǎng)緬甸蟒個體來源及遺傳多樣性分析

樊翠平段玉寶田秀華1*白素英1

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明，650224)

稿件運(yùn)行過程

緬甸蟒； 個體來源； COI； 遺傳多樣性； 遺傳距離

緬甸蟒(Pythonbivittatus)是世界上最巨型的6種無毒蛇類之一[1]，隸屬于蛇亞目(Serpentes)、蟒科(Pythonidae)，被列為 《中國物種紅色名錄》極危物種，為國家Ⅰ級和 CITES附錄Ⅱ保護(hù)動物[2]。緬甸蟒在中國分布于福建(南平、金門)、廣東、香港、海南、廣西、云南、貴州(望謨、羅甸、紫云)、西藏(墨脫)、江西、四川(內(nèi)江)等地[1-4]。

分子系統(tǒng)學(xué)是通過分子技術(shù)，從分子水平研究生物分類和生物進(jìn)化關(guān)系的一門學(xué)科[5]，這項(xiàng)技術(shù)需要大量特定標(biāo)記的遺傳數(shù)據(jù)，通過對遺傳數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，分析出個體間的遺傳差異，達(dá)到對結(jié)果進(jìn)行解釋的目的。分子系統(tǒng)學(xué)的高速發(fā)展，使分子標(biāo)記被運(yùn)用在生物學(xué)領(lǐng)域研究的方方面面[6]。線粒體(mitochondrial)是存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種可以進(jìn)行有氧呼吸的細(xì)胞器，同時也是動物體細(xì)胞質(zhì)遺傳信息的唯一載體[7]。線粒體遺傳是嚴(yán)格的細(xì)胞質(zhì)母系遺傳，它具有分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)簡單，不易發(fā)生插入和缺失等特點(diǎn)，是研究低級分類單元較好的分子標(biāo)記方式，在多種動物類群的系統(tǒng)進(jìn)化研究中得到廣泛應(yīng)用[8]。細(xì)胞色素c氧化酶亞單元I(Cy-tochrome oxidase subunitⅠ，COI)基因是線粒體蛋白質(zhì)編碼基因之一[3]，該基因序列雖然進(jìn)化速率較低，序列相對保守，但卻也能夠發(fā)生充足的基因突變，提供豐富的DNA信息[9-10]，被認(rèn)為是一種非常好的分子生物學(xué)標(biāo)記基因，這也是COI DNA條形編碼基因常被選用作為研究基因的主要原因[4]。海內(nèi)外學(xué)者通過對線粒體控制區(qū)基因分析成功判定緬甸蟒屬于本土物種，通過對微衛(wèi)星標(biāo)記分析緬甸蟒遺傳多樣性。臺灣師范大學(xué)教授You等利用線粒體Cytb和COI對33條來自臺灣金門、福州動物園以及越南的緬甸蟒進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育研究，單倍型網(wǎng)絡(luò)顯示了金門種群與大陸種群親緣關(guān)系較近，證實(shí)了金門島的緬甸蟒并非外來種，是臺灣首例被列為本土種的蟒蛇[11]；劉雅芳等對海南和越南2個已知來源的緬甸蟒種群，基于控制區(qū)II序列進(jìn)行建樹、并計(jì)算兩群體的固定指數(shù)(Fst)，得出海南緬甸蟒與越南緬甸蟒已經(jīng)出現(xiàn)明顯分化的結(jié)果[12]。段玉寶等人通過微衛(wèi)星標(biāo)記得出緬甸蟒海南養(yǎng)殖群體在近期沒有經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)，群體數(shù)量沒有出現(xiàn)過明顯下降[10]。楊寶山等通過COI基因序列變異對不同地理種群的銀杏大蠶蛾(DictyoplcajaponicaButler)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析結(jié)果表明南方組和北方組種群間已經(jīng)按地理位置形成了一定的地理格局，AMOVA分析顯示北方組和南方組之間已經(jīng)具有明顯的遺傳分化，因此可以根據(jù)COI基因序列變異將這13個地理種群劃分為北方和南方2個組的進(jìn)化分枝[13]。張迪等人在基于COI基因序列的太湖新銀魚(Neosalanxtaihuensis)遺傳多樣性中認(rèn)為線粒體COI基因非常適合銀魚科(Salangidae)魚類的物種鑒別和系統(tǒng)發(fā)育研究，在同種不同地理種群間遺傳關(guān)系研究中也同樣適宜，但若結(jié)合Cytb等基因一并分析，可以獲取更多的遺傳信息[14]。鄭文娟等人基于線粒體COI基因序列探討泥蚶(Tegillarcagranosa)的遺傳分化，得出我國沿海地區(qū)7個泥蚶群體已經(jīng)分化形成了二大類群：福建以北(包括福建)的5個群體(江蘇鹽城、浙江奉化、浙江樂清養(yǎng)殖和自然群體、福建福鼎)形成一個類群，福建以南的2個群體(廣東湛江、海南?？?形成一個類群[15]。You基于Cytb和COI基因序列的蟒蛇分子鑒定中，表明福州動物園的蟒蛇是福建本地種群和東南亞種群混養(yǎng)的，其中金門種群和Fuzhou1和Fuzhou4組成福州本地種群，F(xiàn)uzhou2、Fuzhou3、Fuzhou5與海南緬甸蟒蛇及越南蟒蛇等組成東南亞種群。該文章表明金門蟒蛇非來源東南亞，與金門原生種群與福建本地種同源[11]。

近些年，中國境內(nèi)蟒蛇野外數(shù)量急劇減少，緬甸蟒人工養(yǎng)殖的成功繁育和馴化，為野外種群的擴(kuò)增提供了可能。而國內(nèi)對于該物種原人工繁育種群的遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)研究十分缺乏。海南東盛弘蟒業(yè)科技股份有限公司飼養(yǎng)的緬甸蟒其產(chǎn)地與來源不同，由于沒有規(guī)范的來源記錄，且不同地理種群的蟒蛇在外形特征上不易區(qū)分，以至不能準(zhǔn)確鑒定。為了更好地對蟒蛇進(jìn)行科學(xué)的鑒別和保護(hù)，本研究首次對人工混養(yǎng)養(yǎng)殖種群基于COI基因序列進(jìn)行了遺傳多樣性、遺傳距離較為詳盡研究，并重新確定人工混養(yǎng)養(yǎng)殖種群的物種來源，為人工繁育的緬甸蟒種群健康發(fā)展和野生資源的遷地保護(hù)提供了分子生物學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

在海南東盛弘蟒業(yè)科技股份有限公司，采用無損傷取樣法收集緬甸蟒蛇蛻樣本，共采集28條緬甸蟒剛剛褪去的蛇蛻，冰凍帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA的提取

利用經(jīng)典的苯酚-氯仿方法提取緬甸蟒的蛇蛻基因組DNA：緬甸蟒基因組DNA通過酚、氯仿多次抽提，后用無水乙醇和70%的乙醇沉淀DNA；室溫干燥后加50 μL TE溶液溶解，-4℃保存或-20℃儲存。用紫外分光光度法檢測DNA的濃度，然后稀釋成50 ng備用。

1.2.2引物的擴(kuò)增

本研究使用You等[11]報道的COI引物，引物由博仕生物技術(shù)股份有限公司合成。

F：5′-CCCTTATGAGTAGATTTACAGCCTA-3′

R：5′-GGATTGGGGCGTACATATTGTTTAGT-3′

PCR擴(kuò)增的目的片段為1 500 bp，擴(kuò)增體系為50 μL，其配比為：8×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 5 μL，rTaq酶0.5 μL，Primer 1和Primer 2均是1 μL(最終濃度)，模板5～8 μL，然后補(bǔ)增滅菌的去離子水至50 μL。

在Eppendorf梯度PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：依次預(yù)變性溫度95℃時長5 min，變性溫度95℃時長28 s，退火溫度55℃時長28 s，延伸溫度72℃時長88 s，35個循環(huán)后72℃延伸8 min，4℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測后，采用愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，純化回收后的樣品送博仕生物公司使用ABI3728全自動測序儀進(jìn)行雙向測序。

1.2.3數(shù)據(jù)處理

將測得的基因序列，用Seqman軟件進(jìn)行拼接，人工進(jìn)行峰圖矯正后，使用MEGA 5.05與Genbank中的基因序列進(jìn)行比對、剪切；使用DnaSP 5.8.01軟件統(tǒng)計(jì)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、核苷酸多樣性(Pi)、單倍型多樣性(Hd)和核苷酸平均差異數(shù)(K)，確定單倍型。在NCBI中下載已知的緬甸蟒COI序列，用MEGA 5.05采用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)，以 Modeltest 3.7中h LRT篩選出的最優(yōu)模型GTR+I+G 在 PAUP*4.0 b8中構(gòu)建ML樹。用MEGA 5.05計(jì)算不同種間的遺傳距離。

表1 GenBank下載序列詳情

Tab.1 GenBank download sequence for details

2 結(jié)果

2.1 COI序列基因片段特征及遺傳多樣性

測序得到的28條緬甸蟒mtDNA COI基因序列，經(jīng)過比對剪切得到COI基因全序列，片段長度為1 428 bp。其中T、C、A和G的含量分別為29.8%、15.5%、27.9%和26.9%，A+T的含量(54.8%)高于C+G的含量(45.2%)。保守位點(diǎn)(C)占89.6%，變異位點(diǎn)(V)占9.6%，簡約信息位點(diǎn)(Pi)占1.7%。緬甸蟒混養(yǎng)種群存在的單倍型數(shù)為8個，單倍型多樣性(Hd)為(0.726±0.068)，核苷酸多樣性Pi為(0.003 57±0.000 56)，平均核苷酸差異數(shù)k是5.099。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

在GenBank分別下載3條越南緬甸蟒、1條海南緬甸蟒和12條金門緬甸蟒與1條印度蟒(表1)的COI基因序列，與本研究所檢測的28條養(yǎng)殖緬甸蟒樣本的COI同源基因序列采用鄰接法構(gòu)建ML(圖1)。

由圖1的ML樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以看出，12條金門緬甸蟒聚成一小支，與8條養(yǎng)殖緬甸蟒與海南緬甸蟒HN(KF293729.1)聚在一起，和其余20條養(yǎng)殖緬甸蟒聚與3條越南緬甸蟒(PM008(JX40187.1)、PM007(JX40186.1)、PM08(JX40189.1))聚成的一支共同形成姐妹支，然后與印度蟒(PMM(HM581978.1)聚在一起。

圖1 基于COI基因序列構(gòu)建的全部個體ML系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on COI gene sequences of all individuals

2.3 遺傳距離

用MEGA 5.05計(jì)算不同種間的遺傳距離，首先對單個個體間遺傳距離進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)全部緬甸蟒個體間遺傳距離在0.000 7～0.012 75之間；緬甸蟒個體與印度蟒之間的遺傳距離為0.069 02～0.073 80。又根據(jù)已知地理分布和系統(tǒng)發(fā)育樹所顯示的差異將樣本分為4大類群，分別為海南類群(HN：包括海南個體與8條養(yǎng)殖個體)、金門類群(JM)、養(yǎng)殖群體1(YZ1：包括其余20條聚在一起的養(yǎng)殖個體)和越南群體(YN)。計(jì)算4個群體間遺傳距離(表2)，根據(jù)其遺傳距離遠(yuǎn)近判斷其歸屬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個緬甸蟒群體內(nèi)的遺傳距離都很接近(0.0～0.002 95)。4個群體間遺傳距離在0.002 11～0.006 99之間。其中YZ1群體與YN群體間遺傳距離為0.002 52，與海南群體間遺傳距離為0.006 99。

表2 基于COI基因序列計(jì)算的4個越南緬甸蟒群體間的遺傳距離

Tab.2 Genetic distance of partial COI gene between four Python bivittatus populations

3 討論

3.1 COI序列的多態(tài)性分析

通過對COI堿基序列的分析可以發(fā)現(xiàn)，C堿基在各堿基中所占的比例要低于其他堿基，其中A+T的含量(54.8%)明顯高于C+T的含量(45.2%)，說明COI的堿基組成具有偏向性，這與脊椎動物線粒體DNA輕鏈(light strand)COI區(qū)核苷酸的堿基組成特點(diǎn)相一致[15]。已有研究表明，線粒體不同基因的進(jìn)化速率存在差異。本文中檢測的28條養(yǎng)殖緬甸蟒COI基因中保守位點(diǎn)(C)占86.9%，變異位點(diǎn)(V)占4.6%，證明COI基因序列相對保守，變異速率慢。COI基因是線粒體13種編碼基因之一，因此其進(jìn)化速率較慢，這與其他動物相關(guān)序列的研究結(jié)果相同。

人工混養(yǎng)養(yǎng)殖緬甸蟒群體單倍型多樣性相對比較高(>0.7)，核苷酸多樣性較低(<0.007)，這表明該群體遺傳多樣性并不高。已有的研究通過對線粒體DNA序列的遺傳變異進(jìn)行分析，通過單倍型多樣性與核苷酸多樣性的高低組合將其分為4種類型：第一類是前者較低(< 0.5)同時后者也低(< 0.005)；第二類是前者較高但后者較低；第三類是前者較低但后者卻較高；第四類是前者與后者同時相對較高[16]。本研究中養(yǎng)殖緬甸蟒的結(jié)果屬于第二種類型。物種種群數(shù)量大和生長環(huán)境的不均性是維持自然種群內(nèi)單倍型多樣性較高的基礎(chǔ)，種群數(shù)量的增長速度也是影響遺傳多樣性的重要因素[17]。劉雅芳等對緬甸蟒線粒體控制區(qū)遺傳多樣性的研究結(jié)果顯示緬甸蟒總體上群體遺傳特征與本文一致[12]。一個種群能否健康持續(xù)的發(fā)展，遺傳多樣性是關(guān)鍵，它關(guān)乎著整個種群的長期進(jìn)化和繁衍，這一點(diǎn)對于人工混養(yǎng)緬甸種群的人工馴養(yǎng)及繁殖也同樣重要[18]。遺傳多樣性低，同樣會為人工馴養(yǎng)帶來阻礙，因此在人工養(yǎng)殖過程中，我們更應(yīng)加強(qiáng)遺傳管理，明確物種內(nèi)種群的劃分關(guān)系，并建立明確的譜系關(guān)系，防止近親衰退。

3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

劉雅芳等人通過對海南和越南已知的緬甸蟒種群的線粒體控制區(qū)基因建樹并計(jì)算兩群體間的固定指數(shù)Fst，證明海南與越南緬甸蟒在分子水平上已出現(xiàn)明顯的分化[12]。本文基于COI核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，緬甸蟒與外群完全分開，ML法系統(tǒng)發(fā)育樹基部分為2支：由金門緬甸蟒種群與8條養(yǎng)殖蟒蛇個體和海南緬甸蟒個體聚在一起形成1支，3條越南緬甸蟒與其余20條養(yǎng)殖緬甸蟒個體聚在一起形成1支?；谝陨辖浞椒ㄋa(chǎn)生的結(jié)果，28條養(yǎng)殖緬甸蟒中有8條緬甸蟒判斷其來源地為海南，另外20條緬甸蟒的來源地為越南。由此看出基于COI氨基酸序列重建的系統(tǒng)發(fā)育樹能夠用于緬甸蟒種源劃分。

3.3 種群遺傳距離分析

Avise認(rèn)為同一物種的個體間遺傳距離一般會保持在0.05之內(nèi)，當(dāng)差異超過0.06，該個體已經(jīng)與其他個體之間發(fā)生了明顯的亞種或者種的分化[19]。從本研究的結(jié)果顯示，海南、越南、金門與養(yǎng)殖個體的個體間的遺傳距離在0.000 7～0.012 75之間，證明養(yǎng)殖個體與其他野生群體間未發(fā)生明顯亞種或種的分化。同時做群體間遺傳距離，發(fā)現(xiàn)YZ1群間與越南群體間的遺傳距離為0.002 52，與HN緬甸蟒群體間遺傳距離為0.006 99，與JM緬甸蟒群體間遺傳距離為0.006 11。YZ1群體與越南緬甸蟒之間遺傳距離最近，這也與ML系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，從而進(jìn)一步證明了YZ1群體來自越南的結(jié)果的準(zhǔn)確性。HN群體與JM群體間的遺傳距離較近(0.002 11)，這也與其物種來源的地理位置遠(yuǎn)近和系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究首次通過對28條人工混養(yǎng)養(yǎng)殖緬甸蟒COI基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，成功準(zhǔn)確判斷了混養(yǎng)個體的個體來源，28條養(yǎng)殖緬甸蟒樣品中有8條來自海南，20條來自越南。養(yǎng)殖場可根據(jù)本研究的結(jié)果，在以后的種群選育過程中根據(jù)不同的繁殖需求選取不同個體進(jìn)行配對繁殖，同時，根據(jù)不同群體建立譜系管理制度，有效避免近交衰退，從而保持緬甸蟒群體內(nèi)較豐富的遺傳多樣性。本研究成果為人工繁育的緬甸蟒種群健康發(fā)展提供了分子生物學(xué)參考，同時對保護(hù)蟒蛇資源、人工飼養(yǎng)的種群管理以及明確市場上的產(chǎn)品來源等方面將具有重要的理論參考價值和實(shí)際應(yīng)用價值。

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Pythonbivittatus； Individual sources； COI； Genetic diversity； Genetic distance

采用PCR技術(shù)首次用緬甸蟒人工養(yǎng)殖混養(yǎng)種群作為實(shí)驗(yàn)樣本，進(jìn)行mtDNA COI基因序列擴(kuò)增，得到28條mtDNA COI基因序列，片段長度為1 428 bp，其中T、C、A和G的含量分別為29.8%、15.5%、27.9%和26.9%，A+T的含量(54.8%)高于C+G的含量(45.2%)。保守位點(diǎn)(C)占89.6%，變異位點(diǎn)(V)占9.6%，簡約信息位點(diǎn)(Pi)占1.7%。根據(jù)個體系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹與群體間遺傳距離重新判定緬甸蟒人工養(yǎng)殖混養(yǎng)養(yǎng)殖種群的個體來源，并確定28條養(yǎng)殖個體中8條來自海南，20條來自越南。從遺傳距離結(jié)果可以看出，緬甸蟒養(yǎng)殖群體與野生緬甸蟒相比，并沒有出現(xiàn)明顯的遺傳分化。

Source of Origin and Genetic Diversity of Polyculture Burmese Python (Python bivittatus)Based on COI Gene

Fan Cuiping1Duan Yubao2Tian Xiuhua1*Bai Suying1

(1.College of Wildlife Resource，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China；2.College of Forestry，Southweat Forestry University，Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province，Kunming，650224，China)

We obtained 28 Cytochrome oxidase subunitⅠ (COI)gene sequences of polyculture burmese python (Pythonbivittatus)using PCR technology.The length of the COI gene fragment was 1428 bp，of which the content of T，C，A and G is 29.8%，15.5%，27.9%，and 26.9%，respectively.Content of A+T (54.8%)was higher than that of C+G (45.2%).Conservative sites (C)accounted for 89.6%，mutation loci (V)accounted for 9.6%，and simple information site (Pi)accounted for 1.7%.Based on phylogeny trees and genetic distance between individuals，the 28 burmese pythons were considered to be 8 individuals from Hainan Province，China，and 20 individuals from Vietnam.According to genetic distance，there was no obvious genetic differentiation between the domestic and wild populations of burmese python.

樊翠平，女，25歲，碩士研究生；主要從事特種經(jīng)濟(jì)動物飼養(yǎng)、分子生物學(xué)研究。E-mail：1391577155@qq.com 段玉寶，男，33歲，博士，講師；主要從事保護(hù)生物學(xué)、分子生物學(xué)研究。E-mail：boyciana@163.com

*通訊作者：田秀華，E-mail：tianxiu-hua@163.com

2016-12-06

Q953

A

修回日期：2016-02-24

發(fā)表日期：2017-05-10

2310-1490(2017)02-295-05